Analisis Fisiko Kimia

(1)

Analisis Fisiko Kimia

Oleh : Dr. Harmita

(2)

DEFINISI

 Kromatografi adalah teknik pemisahan Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan

campuran didasarkan atas perbedaan

distribusi dari komponen-komponen

campuran tersebut diantara dua fase,

yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase

gerak (cair atau gas).

 Bila fase diam berupa zat padat yang Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah kromatografi

aktif, maka dikenal istilah kromatografi

penyerapan (adsorption chromatography).

Bila fase diam berupa zat cair, maka

teknik ini disebut kromatografi pembagian

(partition chromatography).

(3)

Jenis-jenis kromatografi



Berdasarkan

fase

gerak

yang

digunakan, kromatografi dibedakan

menjadi dua golongan besar yaitu

gas chromatography dan liquid

chromatography.

Masing-masing

chromatography.

Masing-masing

golongan dapat dibagi lagi seperti

yang telah disebutkan pada definisi

di atas.

(4)

Con’d

Kromatografi

PADAT _{ION EXCHANGE} GEL

PLATE KOLOM GAS CAIR KATION ANION GPC GC EKSKLUSI HPLC FASA GERAK CAIR PERTUKARAN ION CAIR HPTLC FASA DIAM ADSORBSI Keterangan

GLC = Gas Liquid Chromatography GSC = Gas Solid Chromatography LLC = Liquid Liquid Chromatography LSC = Liquid Solid Chromatography PC = Paper Chromatography

TLC = Thin Layer Chromatography GP = Gel Permeation

(5)

Liquid Liquid Chromatography (LLC)

 LLC adalah kromatografi pembagian LLC adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi antara fase gerak

dimana partisi terjadi antara fase gerak

dan fase diam yang kedua-duanya zat

cair.

cair. Dalam hal ini fase diam tidak boleh Dalam hal ini fase diam tidak boleh larut dalam fase gerak.

larut dalam fase gerak.

 Umumnya sebagai fase diam digunakan Umumnya sebagai fase diam digunakan air dan sebagai fase gerak adalah pelarut

air dan sebagai fase gerak adalah pelarut

organik. Misalnya pada kromatografi

kertas, sebagai fase diam adalah air yang

terserap pada serat selulosa dari kertas.

(6)

Liquid Solid Chromatography (LSC)

 LSC adalah kromatografi penyerapan. LSC adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben digunakan silika gel,

Sebagai adsorben digunakan silika gel,

alumina, penyaring molekul atau gelas

berpori dipak dalam sebuah kolom dimana

komponen-komponen campuran

dipisahkan dengan adanya fase gerak.

Kromatografi kolom dan kromatografi lapis

tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan

yang masuk golongan ini.

(7)

Ion-exchange chromatography

 Teknik ini menggunakan zeolitas, resin Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar

organik atau anorganik sebagai penukar

ion. Senyawaan yang mempunyai ion-ion

dengan afinitas yang berbeda terhadap

resin yang digunakan dapat dipisahkan.

 Analisa asam-asam amino adalah yang Analisa asam-asam amino adalah yang umum dilakukan dengan cara ini.

umum dilakukan dengan cara ini.

 Contoh lain adalah asam-asam nukleat Contoh lain adalah asam-asam nukleat dan analisis garam-garam anorganik.

(8)

Exclusion chromatography

 Dalam teknik ini, gel nonionik berpori banyak dengan Dalam teknik ini, gel nonionik berpori banyak dengan

ukuran yang sama digunakan untuk memisahkan ukuran yang sama digunakan untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya (BM). Molekul-molekul yang kecil akan memasuki (BM). Molekul-molekul yang kecil akan memasuki pori-pori dari gel sedangkan molekul besar akan pori-pori dari gel sedangkan molekul besar akan melewati sela-sela gel lebih cepat bila dibandingkan melewati sela-sela gel lebih cepat bila dibandingkan dengan molekul yang melewati pori-porinya. Jadi dengan molekul yang melewati pori-porinya. Jadi urutan elusi mula-mula adalah molekul yang lebih urutan elusi mula-mula adalah molekul yang lebih besar, molekul sedang, dan terakhir molekul yang besar, molekul sedang, dan terakhir molekul yang paling kecil. Bila sebagai penyaring digunakan gel paling kecil. Bila sebagai penyaring digunakan gel

yang hidrofil (Sephadex) maka teknik ini disebut

yang hidrofil (Sephadex) maka teknik ini disebut gel gel filtration chromatography

filtration chromatography dan bila digunakan gel yang dan bila digunakan gel yang hidrofob (polystyrene-divinylbenzene) disebut

hidrofob (polystyrene-divinylbenzene) disebut gel gel permeation chromatography.

permeation chromatography.

 Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang

farmasi yaitu kromatografi kolom, kromatografi farmasi yaitu kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas, dan kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas, dan high performance liquid chromatography high performance liquid chromatography

(kromatografi cair kinerja tinggi / KCKT). (kromatografi cair kinerja tinggi / KCKT).

(9)

Teori

 Martin dan Synge adalah yang pertama Martin dan Synge adalah yang pertama kali menulis tentang teori liquid partition

kali menulis tentang teori liquid partition

chromatography. Prinsip teori yang

dikemukakan itu dapat diterapkan untuk

semua jenis kromatografi.

 Pemisahan terjadi karena molekul sampel Pemisahan terjadi karena molekul sampel tertahan oleh fase diam atau dibawa oleh

tertahan oleh fase diam atau dibawa oleh

fase gerak, tergantung dari afinitas

senyawa tersebut terhadap kedua fase ini.

(10)

Koefisien distribusi

 Distribusi dari molekul-molekul sampel Distribusi dari molekul-molekul sampel

diantara dua fase ditentukan oleh tetapan

kesetimbangan yang dikenal dengan

koefisien distribusi, K (koefisien partisi).

K =

K = koefisien partisi

Cs

Cs == konsentrasi sampel dalam fase diam konsentrasi sampel dalam fase diam

(stationary phase)_{(stationary phase)}

Cm = konsentrasi sampel dalam fase

gerak (mobile phase)gerak (mobile phase)

Cm Cs

(11)

Faktor kapasitas ( Retention / K’)

 K’= KVs/Vm = capacity factor = K’= KVs/Vm = capacity factor =

CsCv / CmVm = perbandingan

molekul sampel dalam fase diam

dengan fase gerak.

 K’ adalah nilai yang menunjukkan K’ adalah nilai yang menunjukkan

seberapa kuat komponen-komponen

dalam sample yang dibawa oleh fasa

gerak berinteraksi dengan kolom

(fasa diam).

(12)

Con’d

 Faktor kapasitas (k’) didefinisikan sebagai waktu tambahan Faktor kapasitas (k’) didefinisikan sebagai waktu tambahan yang diperlukan zat terlarut untuk terelusi, dibandingkan

yang diperlukan zat terlarut untuk terelusi, dibandingkan

dengan zat yang tidak tertahan (k’ = 0), dibagi dengan

waktu elusi dari zat yang tidak tertahan. Faktor kapasitas

dinyatakan berdasarkan persamaan :

k’ = =

M M R t t t − M R t t ' '

Keterangan : k’ = faktor kapasitas

t_R

R

= waktu retensi zat

t_M

M

(13)

Con’d

Kromatogram sampel dengan tiga komponen

tM

tR1

(14)

Laju pemisahan

Apabila bagian waktu yang dibutuhkan oleh molekul

sampel

sampel pada fase gerak dikalikan dengan kecepatan linier pada fase gerak dikalikan dengan kecepatan linier (u) dari fase gerak maka diperoleh laju pemisahan (rate of

(u) dari fase gerak maka diperoleh laju pemisahan (rate of

travel) dari molekul rata-rata.

Rate = u

Jadi, laju pemisahan ditentukan oleh :

1. Kecepatan fase gerak (sama untuk tiap komponen

campuran).

2. Perbandingan dari volume fase diam dengan fase gerak

(sama untuk tiap komponen campuran)

3. Koefisien distribusi (spesifik untuk tiap komponen

campuran). campuran). K' 1 1 +

(15)

Retention time

Waktu yang diperlukan oleh sebuah komponen

sampel untuk melintasi kolom sepanjang L disebut

‘retention time’ (t). Dari definisi ini, laju pemisahan

diperoleh:

t= = = ( 1 + K’) = tt= = = ( 1 + K’) = t_M_M(1 + K’)(1 + K’) t

t_M_M= waktu yang diperlukan oleh fase gerak untuk = waktu yang diperlukan oleh fase gerak untuk melintasi kolom sepanjang L.

melintasi kolom sepanjang L.

Persamaan ini merupakan persamaan dasar untuk

semua jenis kromatografi. Dalam praktek sering

diterapkan pada kromatografi gas dan definisinya

dapat diubah menjadi

dapat diubah menjadi retention timeretention time, yaitu waktu , yaitu waktu yang diperlukan oleh sampel mulai dari saat injeksi

yang diperlukan oleh sampel mulai dari saat injeksi

sampai timbulnya peak maksimum.

Rate Length

u L

(16)

Retention volume

 Bila kecepatan dari fase gerak konstan, maka volume dari Bila kecepatan dari fase gerak konstan, maka volume dari fase gerak yang diperlukan untuk memisahkan suatu

fase gerak yang diperlukan untuk memisahkan suatu

komponen campuran dari kolom dapat dihitung dengan

rumus berikut :

Volume = waktu x kecepatan aliranVolume = waktu x kecepatan aliran

VV_R_R = t = t_R_RFF

 Bila persamaan retention time disubstitusikan ke dalam Bila persamaan retention time disubstitusikan ke dalam persamaan ini maka diperoleh:

persamaan ini maka diperoleh:

VV_R_R = Vm (1 + K’) = Vm + KVs = Vm (1 + K’) = Vm + KVs

Vm = volume dari fase gerak dalam kolom

Vs = volume dari fase diam

 Bila fase diam berupa zat padat maka Vs dapat dirubah Bila fase diam berupa zat padat maka Vs dapat dirubah menjadi luas permukaan / area (adsorption) atau

menjadi luas permukaan / area (adsorption) atau

dengan kapasitas penukar ion.

(17)

Relative retention (selektifitas,

α

_α

)

₎

 αα adalah nilai yang menunjukkan seberapa baik adalah nilai yang menunjukkan seberapa baik

sistem kromatografi dapat memisahkan dua

komponen.

 Retention time dan retention volume kurang Retention time dan retention volume kurang

tepat jika dipakai untuk identifikasi dengan

membandingkan data-data lainnya karena

harga-harga ini sangat tergantung dari cara pembuatan

harga ini sangat tergantung dari cara pembuatan

kolom dan kondisi percobaan. Untuk

menghilangkan efek dari operasional variabel,

maka lebih baik digunakan harga

maka lebih baik digunakan harga relative relative

retention

retention yaitu perbandingan antara retention yaitu perbandingan antara retention time sampel dengan retention time standar yang

time sampel dengan retention time standar yang

diperoleh dari kolom yang sama dengan kondisi

percobaan yang sama

(18)

 _{α =}_{α =}₌₌ α = relative retention

α = relative retention

 tanda asetrik (*) = harga untuk standartanda asetrik (*) = harga untuk standar

m R m R t t t t − − * K* K Vm V Vm V R R ₌ + − − Injek

Gambar : Kromatogram sampel dengan empat komponen Selektifitas, α = k’2 = tR2 - tM

(19)

Plate theory (N)



Martin dan Synge melihat adanya

persamaan proses yang terjadi pada

kolom kromatorafi dengan kolom

destilasi

bertingkat

kemudian

destilasi

bertingkat

kemudian

menerapkan

konsep

“theoretical

menerapkan

konsep

“theoretical

rate”

pada

pemisahan

dengan

rate”

pada

pemisahan

dengan

destilasi ke dalam kromatografi.

(20)

Rate theory

 Dalam praktek harga H selalu lebih besar dari harga Dalam praktek harga H selalu lebih besar dari harga

idealnya (nol) yang berarti terjadi pelebaran peak.

Pelebaran ini disebabkan oleh 3 faktor yaitu:

1

1. . Efek perbedaan jarak (eddy diffusion)Efek perbedaan jarak (eddy diffusion)

Perbedaan jarak yang dilalui oleh molekul yang satu

dengan yang lain disebabkan perbedaan bentuk,

ukuran partikel-partikel pengisi kolom, cara pengisian

kolom, dan diameter dari kolom. Perbedaan ini

mengakibatkan perbedaan waktu keluarnya

molekul-molekul dari kolom. Untuk memperkecil efek ini,

molekul dari kolom. Untuk memperkecil efek ini,

digunakan partikel-partikel kecil yang serba sama

tetapi tidak menyebabkan penurunan tekanan dalam

kolom terlalu tinggi, diameter kolom yang kecil,

pengepakan yang mampat dan serba sama tanpa

memecahkan partikel-partikel pengisi kolom tersebut.

Efek ini lebih lanjut dapat dijelaskan dengan gambar

berikut :

(21)

Con’d

2.Difusi molekul sepanjan

g kolom Cm

Fase Diam

_{Fase Diam}

Molekul-molekul

cenderung

untuk

Molekul-molekul

cenderung

untuk

berdifusi

dari

daerah

yang

berdifusi

dari

daerah

yang

konsentrasinya tinggi ke daerah yang

konsentrasiya rendah. Akibatnya, waktu

melintasi kolom, molekul-molekul akan

menyebar (berdifusi) ke belakang dan

ke depan

(22)

Con’d

3.

3. Efek ketidaksinambunganEfek ketidaksinambungan

Aliran yang terus-menerus dari fase gerak

menyebabkan penyimpangan dari

keseimbangan dimana Cs/Cm selalu lebih

kecil dari K pada tepi zona yang didepan

dan selalu lebih besar pada tepi zona yang

dibelakang seperti terlihat pada gambar di

atas (c). Pada partition chromatography,

efek ini makin nyata bila kekentalan fase

diam makin tinggi.

(23)

Resolusi (R)



Merupakan

ukuran

apakah

seuatu senyawa terpisah secara

baik atau tidak dengan senyawa

lain

(24)

Con’d



Perubahan kecil pada nilai

α

akan

menyebabkan nilai resolusi berubah

secara segnifikan, hal ini dapat

dilihat pada contoh dibawah ini.

selektivit as

Hitunglah R jika α = 1,1 dan α = 1,4

(25)

Con’d

(26)

Resolusi atau daya pisah menunjukkan apakah dua komponen

terpisah baik. Resolusi didefinisikan sebagai jarak (t) antara

dua puncak dibagi rata-rata lebar (W) dua puncak yang

diukur pada alas puncak.

W1 W2

∆tR

(27)

Con’d

 Cara menghitung resolusi :Cara menghitung resolusi :

R =

 Keterangan : t Keterangan : t _R1_R1 = waktu retensi komponen 1 = waktu retensi komponen 1

t t _R2_R2= waktu retensi komponen 2= waktu retensi komponen 2

WW₁₁= lebar puncak komponen 1= lebar puncak komponen 1

WW₂₂ = lebar puncak komponen 2 = lebar puncak komponen 2

 Bila nilai resolusi lebih besar dari 1,5; maka Bila nilai resolusi lebih besar dari 1,5; maka

pemisahan yang dihasilkan baik atau lebih dari

99,7 % dan bila nilai resolusi lebih kecil dari 1,5

maka pemisahan yang dihasilkan tidak baik.

2 1 1 2 ) ( 2 W W t t_R _R + −

(28)

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI



HPLC (

High Performance Liquid

Chromatography

)

atau

KCKT

(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

merupakan teknik analisis yang

paling cepat berkembang dalam

kimia analitik. Penggunaannya yang

sangat banyak terdiri atas berbagai

metode dalam kromatografi cair

(29)

1.

1. Metode dalam kromatografi cair dibagi atas Metode dalam kromatografi cair dibagi atas

dua macamdua macam ::

a. Kromatografi Cair Retensif

Pemisahan dicapai melalui interaksi antara zat

terlarut dengan fase diam. Tipe ini mencakup

f

fase normal, fase terbalik, dan kromatografi ion.ase normal, fase terbalik, dan kromatografi ion.

b. Kromatografi Cair Non-retensifb. Kromatografi Cair Non-retensif

Pemisahan yang dicapai tergantung kepada

perbedaan besar molekul zat terlarut dimana

terjadi interaksi antara zat terlarut dengan

pori-pori yang terdapat di permukaan fase diam. Tipe

pori yang terdapat di permukaan fase diam. Tipe

ini dikenal sebagai kromatografi ekslusi.

(30)

Con’d

 2. Keuntungan KCKT antara lain :2. Keuntungan KCKT antara lain :

a.

a. Waktu analisis cepatWaktu analisis cepat

Waktu yang diperlukan biasanya kurang dari satu jam, seringkali hanya 15 Waktu yang diperlukan biasanya kurang dari satu jam, seringkali hanya 15 menit hingga 30 menit. Untuk analisis yang mudah waktu yang diperlukan menit hingga 30 menit. Untuk analisis yang mudah waktu yang diperlukan kurang dari 5 menit.

kurang dari 5 menit. b. Daya pisahnya baik. b. Daya pisahnya baik. c. Peka

c. Peka

Kepekaannya sangat tergantung pada jenis detektor dan eluen yang Kepekaannya sangat tergantung pada jenis detektor dan eluen yang digunakan.

digunakan.

d. Pemilihan kolom dan eluen sangat bervariasi. d. Pemilihan kolom dan eluen sangat bervariasi. e. Kolom dapat dipakai kembali.

e. Kolom dapat dipakai kembali.

f. Dapat digunakan untuk molekul besar dan kecil. f. Dapat digunakan untuk molekul besar dan kecil.

Mudah untuk memperoleh kembali cuplikan. Mudah untuk memperoleh kembali cuplikan.

Tidak seperti kebanyakan detektor dalam kromatografi gas, detektor KCKT Tidak seperti kebanyakan detektor dalam kromatografi gas, detektor KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, sehingga zat yang telah tidak merusak komponen zat yang dianalisis, sehingga zat yang telah dielusi dapat dikumpulkan dengan mudah setelah melewati detektor.

dielusi dapat dikumpulkan dengan mudah setelah melewati detektor. h. Dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah.

h. Dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah.

Hal ini sangat bergantung kepada detektor yang digunakan, namun Hal ini sangat bergantung kepada detektor yang digunakan, namun detektor KCKT dapat mendeteksi zat sampai dengan kadar ppt (

detektor KCKT dapat mendeteksi zat sampai dengan kadar ppt (part per part per trillion

(31)

Instrumentasi

 KCKT memiliki beberapa komponen yang KCKT memiliki beberapa komponen yang berbeda. Sebagai akibatnya banyak

berbeda. Sebagai akibatnya banyak

instrumen-instrumen KCKT yang atau

telah tersedia secara komersial telah

menggunakan desain standar. Bentuk

desain ini sangat menguntungkan karena

instrumen dapat diperbaharui(mengikuti

teknologi terkini) hanya dengan

menambahkan komponen lain atau

dengan mengganti dengan

komponen-komponen lain yang sesuai.

(32)