KINETIKA DAN APLIKASI ENZIM
“ENZIM PROTEASE”
DOSEN PENGASUH : Dr. Laksmi Ambarsari, MS
OLEH :
DEDE RIVAL NOVIAN G851140021 ELFIRA JUMRAH G851140071
NUR HASANAH G851140091
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2014
Protease adalah enzim yang dapat menghidrolisis ikatan peptida pada protein menjadi senyawa yang lebih sederhana seperti peptide kecil dan asam amino (Bains,1998). Sehingga enzim ini menjadi salah satu enzim yang banyak digunakan baik dalam industri pangan maupun non pangan. Di bidang industri pangan enzim protease digunakan pada industri keju, bir, roti dan daging, sedangkan di bidang non pangan paling banyak digunakan di industri detergen, farmasi, fotografi, tekstil dan kulit (Suhartono, 1989). Hal ini yang alasan utama protease sebagai satu dari tiga kelompok terbesar dari industri enzim dan diperkirakan sebesar 60% dari perdagangan enzim di seluruh dunia (Rao et al., 1998).
Sumber enzim protease bisa berasal dari hewan, tanaman dan mikroorganisme. Penggunaan tumbuhan sebagai sumber protease dibatasi oleh tersedianya tanah untuk penanaman dan kondisi yang cocok untuk pertumbuhan. Disamping itu proses produksi protease dari tumbuhan sangat memakan waktu. Protease tumbuhan yang dikenal antara lain papain, bromelain, dan karetinase. Protease hewan yang paling dikenal adalah tripsin, kimotripsin, pepsin, dan rennin. Enzim ini dapat diperoleh dalam keadaan murni dengan jumlah besar (Boyer, 1971). Namun secara ekomomi produksi protease dari heawan dan tanaman membutuhkan sumber daya dan biaya yang besar.
Untuk keperluan industri biasanya enzim diperoleh dari mikroorganisme. Karena mikroorganisme mempunyai beberapa keunggulan bila dibanding protease dari sumber lainnya, diantaranya dapat diproduksi dalam jumlah besar, produktivitasnya mudah ditingkatkan, mutu lebih seragam, harga lebih murah, dapat ditumbuhkan dengan cepat, pertumbuhannya mudah diatur, enzim yang dihasilkan mudah diisolasi. Keunggulan lainnya adalah mikroorganisme dapat hidup dan berkembang biak dalam media limbah pertanian yang relatif lebih murah. Adanya mikroorganisme unggul merupakan salah satu faktor penting dalam usaha produksi enzim (Stanbury and Whitaker, 1984). Mikroba yang telah dikembangkan secara komersial sebagai penghasil protease antara lain Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilus, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, bakteri asam laktat seperti Lactobacillus bulgaricus, Bacillus lichenoformis, dan Streptococcus thermophilus. (Epi Supriwardi, 2011).
Teknologi fermentasi merupakan salah satu cara pengolahan dan pengawetan makanan, baik secara konvensional maupun modern, dengan memanfaatkan mikroba baik langsung maupun tidak langsung. Dalam proses fermentasi, mikroba maupun enzim yang dihasilkan dapat menstimulasi rasa yang spesifik, meningkatkan nilai cerna bahan pangan, menurunkan kandungan anti gizi atau bahan lain yang tidak dikehendaki, dan dapat menghasilkan produk atau senyawa turunan yang bermanfaat
Protease bakteri secara ekstensif digunakan dalam industri deterjen, yang jumlahnya mencapai 25% dari total enzim yang dijual di dunia. Dimulai tahun 1993, protease dari ekstrak kasar protease ditambahkan pada deterjen laundry untuk mencapai hasil yang lebih baik dalam memindahkan noda proteinaceous. Akhir tahun 50-an, protease bakteri pertama kali digunakan dalam deterjen komersil. Saat ini protease paling populer untuk digunakan dalam deterjen yang semuanya tergolong protease serin dari Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus. lichenformis, Bacillus alkali kuat seperti Bacillus. lentus (Rao et al., 1998). Pada industri lain protease juga digunakan dalam industry farmasi, produk-produk kulit, proses pengolahan limbah industri (Nascimento & Martin, 2006), peragian, pengembang, penyamakan kulit dan pengempukan daging biasanya protrase ini berasal dari Bacillus, Aspergillus oryzae dan streptomyces spp. Tipe protease ini umumnya dihasilkan selama proses fermentasi dan dikeluarkan ke dalam media produksi (Headon & Walsh, 1994).
Isolasi Bakteri
Isolasi bakteri dilakukan sesuai dengan standar metode uji mikrobiologi menurut Standar Nasional Indonesia (SNI) 6887-1:2012. Sampel diambil sebanyak 60 ml yang dimasukkan ke dalam botol steril. Kemudian diperlakukan pengenceran berseri 10-1–10-6 menggunakan pepton water steril. Hasil pengenceran 10-2, 10-4, dan
10-6ditanam menggunakan metode pour plate pada media Trypthone Soya Agar
(TSA), diinkubasi pada suhu 300C selama 48 jam. Pada hasil koloni yang
ditumbuhkan dilakukan penghitungan koloni serta pengamatan morfologi koloni. Pemurnian bakteri dilakukan dengan menanam pada media TSA diinkubasi pada suhu 300C selama 48 jam. Target pemurnian adalah setiap koloni yang memiliki perbedaan
diinkubasi pada suhu 300C selama 48 jam dan disimpan pada suhu -200C. Untuk uji
selanjutnya, dilakukan penanaman pada agar miring media TSA untuk mendapatkan fresh culture.
Uji Aktivitas Protease
Uji aktivitas protease dilakukan menurut Baehaki (2011) yaitu dengan cara bakteri yang memiliki nilai positif dari uji kualitatif ditumbuhkan pada media pertumbuhan yaitu Nutrient Broth (NB). Kemudian dilihat kemampuan bakteri proteolitik dalam membentuk zona bening di sekitar isolat yang ditumbuhkan dalam media agar skim susu.
Menurut Pakpahan (2009), Susu merupakan media yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri karena mengandung banyak nutrien. Kasein merupakan protein susu yang terdiri dari fosfoprotein yang berikatan dengan kalsium membentuk garam kalsium yang disebut kalsium kalsenat. Molekul ini sangat besar dan tidak larut dalam air serta membentuk koloid. Suspensi ini berwarna putih serta mampu diamati secara langsung saat disuspensikan dalam kultur media padat.
Zona bening yang terbentuk di sekitar koloni bakteri merupakan tanda hilangnya partikel kasein di media susu skim. Adanya enzim proteolitik ekstraseluler bakteri, kasein akan terhidrolisis menjadi peptida- peptida dan asam amino yang larut. Enzim ekstraseluler ini (diantaranya berasal dari: Bacillus sp) sangat efisien dalam memecah berbagai senyawa karbohidrat, lipid dan protein rantai panjang menjadi unit-unit rantai pendek atau senyawa-senyawa yang lebih sederhana
Produksi
galur produsen selama pertumbuhan fase eksponensial (Schenell et al 1988). Dan biasanya mengikuti pola klasik sintesis protein. yang diatur oleh plasmid DNA ekstrakromosomal (piart et al 1993) dan umumnya disintesis melalui jalur ribosomal sebagai propeptida kemudian mengalami modifikasi (Engelke et al, 1992). Pada kondisi ini, kebutuhan akan energi bagi bakteri lebih tinggi dibandingkan pada fase lainnya. Oleh karena itu bakteri banyak memproduksi zat-zat metabolit yang dibutuhkan dalam memenuhi kebutuhan nutrisinya. (Mukhamad Kosim, 2010). Sehingga peningkatan produksi protease seiring dengan meningkatnya pertumbuhan bakteri dan dipengaruhi oleh nutrien, oksigen, potensial oksidasi reduksi dan adanya zat-zat penghambat (Putri, 2012) waktu, suhu, PH inkubasi, (Soeka, et al 2011) Pada waktu inkubasi setelah 32 jam, bakteri mengalami fase eksponensial diperlambat karena pada fase ini nutrisi yang tersedia sudah mulai berkurang dan hasil ekskresi bakteri telah bertimbun dalam medium sehingga menganggu pembiakan dan pertumbuhan bakteri selanjutnya. Sedangkan pada waktu inkubasi setelah 36 jam, bakteri mengalami fase stasioner dimana pada fase ini sel kehabisan nutrien untuk tumbuh dan membelah.
Isolasi Enzim
Ekstrak kasar enzim protease di produksi dari fermentasi media cair sintetik. Fermentasi dilakukan di dalam “shaker waterbath” pada suhu 37 0C, 150 rpm. Isolasi
ekstrak kasar enzim protease dilakukan pada waktu inkubasi optimum yang ditetapkan dengan kurva pertumbuhan yaitu 32 jam. Protease dari ekstraseluler diperoleh dengan mensentrifugasi medium produksi pada kecepatan 6.000 rpm pada suhu 4 0C, selama 15 menit. (Elfi, 2003) Enzim ini akan berada di supernatannya dan
merupakan ekstrak kasar protease. Ekstrak kasar ini kemudian dimurnikan melalui tahap freeze drying, dan selanjutnya difraksinasi dengan amonium sulfat. Freeze drying merupakan tahap pemekatan atau pengeringan larutan protein untuk mencegah denaturasi protein. Sedangkan fraksinasi amonium sulfat merupakan proses pengendapan protein dari larutannya. Hal ini dilakukan setelah ekstrak kasar protease dipekatkan melalui freeze drying.
sehingga mengurangi molekul air pada bagian permukaan hidrofob protein, dan menurunkan kelarutan protein, selanjutnya protein berinteraksi satu sama lainnya membentuk gumpalan dan mengendap. Molekul protein dengan berat molekul besar memerlukan konsentrasi garam yang kecil untuk membentuk endapan dan akan mengendap lebih dulu hal ini menyebabkan terjadinya efek salting out (Fatoni, 2008). Salting out adalah peristiwa peningkatan muatan listrik di sekitar protein, yang akan menarik mantel air dari koloid protein dan menyebabkan peristiwa hidrofobik antarmolekul protein pada suasana ionik tinggi yang menyebabkan penurunan kelarutan protein. Sedangkan pada konsentrasi rendah, ion-ion ini akan mengelilingi molekul protein dan mencegah mereka bersatu sehingga protein melarut. Peristiwa ini disebut salting in.
Pengendapan terjadi secara perlahan dan disetimbangkan selama 12 jam. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan cara sentrifugasi, Untuk menghilangkan sisa-sisa garam amonium sulfat dan molekul-molekul kecil lainnya, maka endapan yang diperoleh didialisis menggunakan tabung selovan (Elfi, 2003).
Karakterisasi
Karakterisasi enzim protease dapat ditentukan berdasarkan pengaruhnya terhadap pH, temperatur serta penambahan aktivator dan inhibitor. pH optimum ditentukan dengan mengukur aktivitas enzim pada variasi pH dari buffer fosfat 0,2 M dan buffer karbonat 0,2 M pada temperatur 400C dengan lama inkubasi 10 menit.
Selanjutnya ditentukan temperatur optimum pada pH optimum yang diperoleh dari pengukuran di atas, dengan cara mengukur aktivitas enzim pada variasi suhu inkubasi. Pada pH dan suhu optimum, yang telah diketahui kemudian dilakukan pengujian aktivitas enzim dengan menambahkan aktivator dan inhibitor pada substrat, antara lain: ion Ca2+ , Mg2+ Zn2+ Fe2+ EDTA, SDS dengan variasi konsentrasi 10, 100,
1000 ppm.
Pada penelitian karakteristik protease dari Bacillus amyloliquefaciens uji stabilitas Enzim yang dilakukan dengan cara menyimpan enzim protease pada suhu 40C selama 6 hari diperoleh hasil aktivitas enzim semakin menurun dengan
bertambahnya waktu penyimpanan. Menurut Suhartono dkk. (1994), enzim protease memiliki stabilitas penyimpanan yang rendah.
atau terjadinya penurunan aktivitas pada saat enzim disimpan, disebabkan antara lain: 1. Enzim protease hanya aktif secara katalitik dalam jangka waktu yang pendek karena
adanya autolisis. Autolisis adalah proses dimana enzim protease mengkatalis hidrolisis protein enzim protease yang sama, misalnya tripsin menghidrolisa molekul tripsin lainnya (Suhartono, 1989).
2. Enzim ini berbentuk larutan dan air berfungsi sebagai medium untuk substrat berdifusi ke dalam sisi aktif enzim dan produk berdifusi dari sisi aktif enzim, sehingga dengan adanya air akan lebih mempermudah enzim mengalami degradasi oleh enzim lain (protease) sehingga enzim yang berbentuk larutan lebih tidak stabil daripada enzim yang telah dikeringkan Fox (1991).
Pengaruh pHterhadap Aktivitas enzim protease
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH, karena pH mempengaruhi keadaan muatan listrik substrat atau enzim. Perubahan muatan dapat mempengaruhi aktivitas, baik dengan perubahan struktur maupun dengan perubahan muatan pada residu asam amino yang berfungsi mengikat substrat atau terjadi katalisis. Misalnya enzim bermuatan negatif (Enz-) bereaksi dengan substrat (SH+):
Enz-+ SH+→ EnzSH
Pada nilai pH kurang dari 7,5 untuk protease netral atau kurang dari 9 untuk protease alkali, Enz-akan diprotonasi dan kehilangan muatan negatifnya.
Enz-+ H+→ EnzH
Pada nilai pH lebih dari 7,5 untuk protease netral atau lebih dari 9 untuk protease alkali, SH+akan terionisasi dan kehilangan muatan positifnya.
SH+→S+H+
Jadi nilai pH yang lebih rendah atau lebih tinggi akan menurunkan konsentrasi Enz
-dan SH+, padahal yang bereaksi adalah Enz- dan SH+ sehingga akan menurunkan
kecepatan reaksi (Martin et al., 1983).
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas enzim protease
rotasi enzim dan substrat molekul sehingga kontak antara substrat dan enzim dapat terjadi dengan frekuensi yang lebih banyak (Suhartono, 1989).
Namun energi kinetik molekul-molekul enzim menjadi demikian besar sehingga melampaui energi untuk memecahkan ikatan-ikatan sekunder (ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik, ikatan elektrostatik) yang mempertahankan enzim dalam keadaan alaminya, dimana enzim akan kehilangan struktur tiga dimensi sehingga enzim akan kehilangan kemampuan katalitik pada suhu reaksi yang lebih tinggi dari suhu optimumnya (Martin et al. 1983).
Aktivator dan Inhibitor
Pada penelitian karakteristik protease dari Bacillus amyloliquefaciens untuk melihat sifat aktivator dan inhibitor digunakan Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, SDS dan
EDTA, yang masing-masing diukur dengan variasi konsentrasi 10, 100, 1000 ppm. Hasilnya dengan semakin bertambahnya konsentrasi ion Ca2+ tidak memberi pengaruh
secara nyata terhadap aktivitas relatif enzim. Hal ini menunjukkan bahwa ion Ca2+
kurang berperan sebagai aktivator pada enzim protease netral, namun dapat digunakan untuk meningkatkan stabilitas enzim (Endo, 1962 dalam Rose, 1980). Sehingga dapat disimpulkan bahwa enzim dapat distabilkan dengan penambahan ion kalsium karena inaktivasi enzim sangat dipengaruhi oleh kondisi ikatan kalsium. Parameter aktivitas untuk inaktivasi menunjukkan penguraian protein enzim saat pemanasan. Nilai entalpi aktivitas dan entropi akan meningkat dengan peningkatan konsentrasi ion kalsium. Model kinetik inaktivasi didasarkan pada asumsi bahwa dua tahap penguraian transisi dimana disosiasi ion bivalen terjadi pada tahap pertama dan kemudian diikuti tahap kedua yaitu penguraian struktur. Model kinetik tersebut menginterpretasikan ikatan ion kalsium terhadap protein enzim secara quantitatif maupun qualitatif dan pengaruhnya terhadap inaktivasi. Afinitas entalpi yang kuat semakin memperkuat ikatan ion bivalen terhadap protein enzim sehingga bersifat sebagai penstabil (Hoshino and Tanaka, 2002). Ion Mg2+ pada enzim protease berperan sebagai inhibitor
karena dengan penambahan 1000 ppm ion Mg2+ dapat menurunkan aktivitas enzim.
Dengan semakin bertambahnya konsentrasi ion Zn2+ memberikan peningkatan
aktivitas relatif enzim. Hai ini menunjukkan bahwa ion Zn2+ berperan sebagai
aktivator Penambahan ion Fe2+ juga meningkatkan aktivitas enzim. Peran ion Fe2+ ini
EDTA menurunkan aktivitas enzim protease secara nyata. Hal ini mengindikasikan ion logam divalen dibutuhkan untuk aktivitas enzim protease sebagai kofaktor (Kim, et al, 2005).
Penambahan SDS yang merupakan detergen menurunkan aktivitas enzim, tetapi peran SDS bukan untuk mengikat logam, melainkan mendenaturasi protein enzim.
Reaksi Pemutusan Ikatan Peptida pada Protein oleh Protease
Gambar 1. Reaksi Pemutusan Ikatan peptida Protein oleh Protease
Imobilisasi Enzim
Imobilisasi merupakan suatu modifikasi untuk meniru keadaan asalnya di alam yang diyakini berada dalam keadaan terikat pada membran atau partikel partikel dalam sel. Tujuan utama mengimobilisasi enzim adalah untuk mendayagunakan enzim yang dapat memberikan proses katalitik yang berkesinambungan (Zaborsky 1973). Teknik imobilisasi enzim pertama kali dilakukan oleh Nelson dan Griffin pada tahun 1916 (Muchtadi et al. 1992) Nelson dan Griffin mengimobilisasi enzim interfase dari khamir dengan cara adsorpsi pada arang aktif (Chibata 1978). Menurut Soehartono (1989) dan Winarno (1995), selama enzim belum mengalami kerusakan struktur, enzim masih dapat dipakai secara berulang-ulang. Kekurangan-kekurangan tersebut dapat diatasi dengan teknologi enzim yaitu membuat enzim amobil (Immobilized enzyme). Penggunaan enzim terimobilisasi akan memberikan beberapa keuntungan yaitu:
1. enzim dapat digunakan secara berulang
2. proses dapat dihentikan secara cepat dengan mengeluarkan enzim dari larutan substrat
3. kestabilan enzim dapat diperbaiki
4. larutan hasil proses tidak terkontaminasi oleh enzim
5. dapat digunakan untuk tujuan analisis yang melibatkan enzim.
Imobilisasi enzim dapat dilakukan secara fisik, kimia atau kombinasi keduanya. Metode imobilisasi terbagi atas tiga kelompok yaitu metode pengikatan pada penyangga (carrier binding), metode pengikatan silang (crosslinking) dan metode pemerangkapan (entrapping) (Chibata 1978).
Imobilisasi enzim protease dengan metode penjebakan menggunakan poliakrilamid (Alexander, R.R. dan J. M Griffiths, 1993)
kadar protein untuk mengetahui efektivitas amobilisasi. Enzim yang telah diamobilisasi disebut enzim amobil. Enzim amobil juga dilakukan karakterisasi untuk mengetahui suhu dan pH optimum.
Penentuan Suhu Optimum Enzim Amobil
Gambar 2. Perbandingan suhu optimum enzim bebas dan enzim amobil
Penentuan pH Optimum Enzim Amobil
Gambar 3. Perbandingan pH optimum enzim bebas dan enzim amobil
Penentuan pH optimum Penentuan pH optimum dilakukan dengan mengukur aktivitas EK bebas dan amobil pada berbagai variasi pH substrat kasein dan dilakukan pada suhu optimum. Enzim berada pada struktur tiga dimensi yang tepat saat kondisi pH optimum, sehingga enzim dapat mengikat dan mengolah substrat dengan kecepatan tertinggi.
Struktur tiga dimensi enzim mulai berubah pada kondisi di luar pH optimum, sehingga substrat tidak lagi berada pada posisi yang tepat pada bagian molekul enzim. Hal ini menyebabkan proses katalisis tidak berjalan optimum, sehingga aktivitas enzim berkurang (Sadikin, 2002). Aktivitas suatu enzim sangat dipengaruhi oleh konsentrasi ion hidrogen (keasaman dan kebasaan). Hal ini disebabkan residu asam amino yang terdapat pada pusat aktif enzim harus berada dalam keadaan ionisasi yang tepat agar menjadi aktif. Penentuan waktu inkubasi enzim amobil bertujuan untuk mengetahui waktu inkubasi pada menit berapa enzim dapat bekerja maksimum menghasilkan produk tinggi. Waktu inkubasi yang terlalu lama membuat aktivitas enzim semakin menurun, hal ini dikarenakan enzim mengalami perubahan konformasi struktur molekul atau terdenaturasi, sehingga tidak terbentuk kompleks enzim-substrat dan menyebabkan tidak terbentuknya produk akibatnya aktivitas enzim mengalami penurunan.
Gambar 4. Uji pemakaian berulang enzim amobil
Uji pemakaian berulang enzim amobil bertujuan untuk mengetahui stabilitas EK amobil terhadap pemakaian berulang. EK amobil diuji aktivitasnya pada suhu optimum, pH optimum dan waktu inkubasi. Dengan pemakaian berulang aktivitas EK amobil mengalami penurunan secara drastis. Hal ini menunjukkan bahwa amobilisasi enzim protease dengan poliakrilamida meningkatkan kestabilan untuk pemakaian berulang. Proses imobilisasi menyebabkan penurunan aktivitas enzim namun meningkatkan stabilitas enzim. Penghambatan reaksi enzimatis oleh pengaturan difusi dari pemindahan substrat dan produk merupakan salah satu kelemahan metode penjebakan enzim dalam gel. Pada enzim yang telah diamobilisasi, substrat dan produk dengan berat molekul tinggi lebih sulit melewati pori-pori gel. Substrat yang mempunyai berat molekul tinggi akan sulit masuk ke dalam gel, begitu juga apabila produk yang dihasilkan molekul, mempunyai berat molekul tinggi akan sulit keluar dari gel, sehingga aktivitasnya menjadi berkurang (Smith, 1990). Menurut Soehartono (1989), penurunan aktivitas enzim amobil kemungkinan disebabkan oleh matriks penyangga yang digunakan bersifat porous, sehingga enzim mudah keluar dari gel.
1. Imobilisasi dinding sel
produksi protease dapat ditingkatkan melalui fermentasi batch yang terendam. Jebakan fisik sel utuh dalam matriks gel polimer digunakan sebagai metode amobil. Proses fermentasi menggunakan busa urethane sebagai amobilisasi operator. Selanjutnya sel-sel bakteri yang bergerak pada serat selulosa triasetat dan film, diikuti oleh ikatan silang dengan reagen bifungsional, glutaraldehid.
2. Imobilisasi sel-bebas
Berbagai operator yang digunakan untuk tujuan ini diantaranya: bentonit, kaca berpori, nilon telah banyak digunakan, biaya yang relatif tinggi. Dukungan ini telah menjadi faktor pembatas untuk aplikasi industri. Metode imobilisasi dari protease alkali pada alat bantu tersebut menggunakan glutaraldehid melibatkan lampiran kovalen kelompok amino dari enzim kepada kelompok aldehida yang tersedia dalam glutaraldehid-diaktifkan. Dalam satu studi, Srokova dan Cik berhasil amobil suatu protease alkalin ke gel O-hidroksietilselulosa melalui fotokimia polimer-operator silang yang disebabkan oleh fotolisis azida aromatik. Beberapa studi imobilisasi telah membahas peningkatan profil termostabilitas dan profil pH-aktivitas enzim ke sisi basa. Peningkatan termal stabilitas terutama karena multipoint kovalen dan stabilisasi yang lemah, ikatan ionik dan ikatan hidrogen antara protease dengan senyawa yang melindungi enzim dari inaktivasi dan autolisis. Selanjutnya, perubahan nilai pH dapat dikaitkan dengan partisi efek yang menyebabkan konsentrasi yang berbeda dari ion hidrogen dalam lingkungan mikro dari amobil enzim ketika digabungkan dengan pembawa yang memiliki interaksi elektrostatik
Imobilisasi enzim protease menggunakan Kitosan untuk penggembang film dengan sifat anti-biofilm (Henri Elchinger-pierre et. Al. 2014)
Alternatif matriks pengganti yang banyak dipilih oleh para ilmuwan dan pengusaha adalah kitin dan kitosan, hal ini karena kitin jumlahnya lebih melimpah dan keberadaannya terbesar kedua di alam setelah selulosa. Kitin dan kitosan memiliki beberapa keunggulan jika digunakan sebagai matriks imobil, antara lain: bentuk fisiknya dapat diubah (serpihan, manikmanik berpori, gel, fiber, membran), biodegradasi, murah, mudah penanganannya, memiliki afinitas yang tinggi pada protein dan non toksik. Stanley et al. (1975) menambahkan bahwa kitin dan kitosan mempunyai struktur yang keras, inert, dan densitas kamba (bulky) yang rendah. Kelebihan kitosan inilah yang dapat digunakan sebagai matriks penyangga pada imobilisasi enzim. Kitosan diharapkan dapat mengikat enzim bebas dan mampu menjaga stabilitas aktivitas katalitik enzim dengan lebih baik. Enzim protease merupakan salah satu enzim yang telah banyak diaplikasikan dalam industri pangan sebagai katalisator. Proses imobilisasi enzim ini diharapkan memberikan beberapa keuntungan penggunaan enzim terimobil dibandingkan dengan enzim bebasnya.
Immobilisasi enzim protease dengan menggunkan kitosan film, digunakan protease anti-biofilm berbagai jenis yaitu Proteinase K yang diperoleh dari Tritirachium album, protease A dari aspergillus oryzae, protease B dari Bacillus licheniformis, Neutrase dari Bacillus amyloliquefaciens dan alcalase. Sedangkan biofilm yang digunakan yaitu staphylococcus aureus, staphylococcus aureus aureus, Pseudomonas aeruginosa dan Listeria monocytogenes.
Gambaran 2. % aktivitas enzim protease bebas dengan konsentrasi yang berbeda-beda terhadap biofilm :
Daftar Pustaka
Alexander, R.R. dan J. M Griffiths, 1993, Basic Biochemical Methods. Wiley-Liss, Inc.
Chaplin J, Buckle GB. 1990. Enzyme Immobilization Technology. New York: AVI Publishing.
Fatoni Amin, Zusfahair, Puji Lestari. 2008. Isolasi dan karakterisasi Protease Ekstraseluler dari Bakteri dalam Limbah Cair Tahu. Prog.study Kimia. Fakultas Sains dan teknik. Univ.Jendral Sudirman.
Henri Elchinger-Pierre, et.al. 2014. Immobilization of proteases on chitosan for the development of filmswith anti-biofilm properties. International Journal of Biological Macromolecules 72 (2015) 1063–1068
Knorr D. 1982. Functional properties of chitin and chitosan. Journal of Food Science 48:36-41.
Muchtadi DS, NS Palupi dan M Astawan. 1992. Enzim dalam Industri Pangan. Bogor: PAU Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor.
Nascimento, W.C.A & Meire, L.L.M. 2004. Production and Properties of an extracellular Protease from Thermophilic Bacillus Sp. Brazilian. Journal of microbiology. 35 : 91-96.
Pant Gaurav, Prakash Anil, Pavani JVP, Bera Sayantan, Deviram GVNS, Kumar Akaya, Panchpuri Mitali, Gyana Prasuna Ravi. 2014. Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis. Department of Microbiology, GITAM Institute of Science, GITAM University, Visakhapatnam, Andhra Pradesh and Department of
Pharmaceutical Sciences, H.N.B. Garhwal University (Central University), Srinagar, Uttarakhand, India. ScienceDirect.
Putri, S.Y. 2012. Skrining dan Uji Aktivitas Enzim Protease Bakteri dari Limbah Rumah Pemotongan Hewan. Departemen Biologi. Univ Airlangga.
Rao, M.B., A.M. Tanksal, M.S. Ghatge, and V.V. Deshpande. 1998. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Protease. Microbiology and Molecular Biology Reviews. India. http://mmbr.asm.org/cg/content/f ull/62/3/597#FN151.html. Tanggal akses 4 Maret 2004. Jam 07:40. Dalam Novita W, K.Arief, F.C.Nisa, dan U. Murdiyatmo. 2006. Karakterisasi Parsial Ekstrak Kasar Enzim Protease dari Bacillus Amylolique faciens. Jur.Teknik Hasil Pertanian. Univ. Brawijaya
Sadikin, M., 2002, Biokimia Enzim, Penerbit Widya Medika, Jakarta.
Smith JE. 1990. Prinsip Bioteknologi. Sumantri B, Subono A, penerjemah; Jakarta: PT. Gramedia.
Soehartono, M. T., 1989, Bioteknologi Enzim, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi antar Universitas, Jakarta. Suhartono, M. T., N. Andarwulan, I. Malikah dan Mariani. 1994. Daya Tahan Simpan
Protease. Buletin Teknologi dan Industri Pangan. Volume 5. Nomor 3. (Dalam jurnal W Novita, Arief K, Nisa F.C, dan Murdiyatma U. 2006.
Winarno, F. G., 1995, Enzim Pangan, Gramedia, Jakarta
