RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 1 Kinetika Reaksi Enzim
Pada tahun 1902, Victor Henri mengajukan suatu teori kinetika enzim yang kuantitatif, tapi data eksperimen yang diajukan tidak berguna karena belum menitikberatkan konsentrasi ion hidrogen. Setelah konsep buffer dan penentuan skala pH logaritmik ditemukan oleh Peter Lauritz Sørensen pada tahun 1909, maka Leonor Michaelis, seorang kimawan Jermn dan murid bimbingan pascadokotoralnya Maud Leonora Menten yang berasal dari Kanada, mengulangi eksperimen Henri dan mengkonfirmasi persamaan Henri. Persamaan yang dikembangkan tersebut kemudian dikenal dengan Kinetika Henri-Michaelis-Menten (lebih sering hanya disebut sebagai kinetika Michaelis-Menten). Hasil penelitian mereka kemudian dikembangkan lebih jauh oleh G. E. Briggs dan J. B. S. Haldane. Penurunan persamaan kinetika yang diturunkan oleh Henri-Michaelis-Menten masih digunakan sampai sekarang. .
Salah satu kontribusi utama Henri pada kinetika enzim adalah memandang reaksi enzim sebagai dua tahapan. Pada tahap pertama, subtrat terikat pada enzim secara reversibel, membentuk kompleks enzim-substrat (ES). Kompleks ini sering disebut sebagai kompleks Michaelis. Enzim kemudian mengatalisasi reaksi kimia dan melepaskan produk.
Kurva kejenuhan suatu reaksi enzim menunjukkan relasi antara konsentrasi substrat (S) dengan kecepatan reaksi (V) (Gambar 1).
Mekanisme reaksi enzimatik untuk sebuah subtrat tunggal, Enzim (E) mengikat substrat (S) menghasilkan kompleks ES dan menghasilkan produk P.
k1 k2
E + S ES P + E k-1 k-2
Dari Gambar 1 dapat dijelaskan sebagai berikut:
RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 2 Dari Gambar 1 dapat dijelaskan sebagai berikut.
1. Kecepatan reaksi berbanding lurus terhadap konsentrasi substrat pada saat konsentrasi substrat rendah, sehingga reaksi mendekati karakteristik reaksi orde 1.
2. Kecepatan reaksi tidak bergantung konsentrasi substrat pada saat konsentrasi substrat yang tinggi, sehingga reaksi mendekati karakteristik reaksi orde 0.
3. Orde reaksi antara batas konsentrasi, berkurang secara berkesinambungan dari 1 menjadi 0 dengan naiknya konsentrasi.
Persamaan Michaelis-Menten
Vmax S
V0 = Km + S
S, Vo, Vmax dan Km (tetapan Michaelis) ditentukan melalui eksperimen.
Berikut ini akan disampaikan dasar logika dan tahap-tahap secara aljabar dalam turunan modern persamaan Michaelis-Menten, yag termasuk di dalamnya asumsi keadaan-tetap (steady state) yang diperkenalkan oleh Briggs dan Haldane. Penurunan dimulai dari dua tahap dasar pembentukan dan pemutusan kompleks ES.
Gambar 2. Teori keadaan tetap (steady state) (Stryer L, et al 2003, Biochemistry 5th ed, WH Freeman Company, New York, USA)
Pada awal reaksi konsetrasi produk masih sangat kecil sekali sehingga P dapat diabaikan dan demikian P → S juga dapat diabaikan, sehinga keseluruhan reaksi menjadi
RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 3 k1 k2
E + S ES P k-1
V0 ditentukan oleh pemutusan ES membentuk produk;
V0 = k2ES ... (1) Karena ES tidak mudah diukur, maka dicari cara alternatif untuk menentukannya.
Etotal adalah konsentrasi enzim total yang merupakan jumlah enzim bebas E dan enzim yang berikatan dengan substrat, ES. Dengan demikian enzim bebas atau enzim yang tidak berikatan dengan substrat adalah sama dengan Etotal - ES.
Kecepatan reaksi pembentukan dan pemutusan ES ditentukan olehkonstanta kecepatan k1 dan k-1 + k2 berdsarkan persamaan di bawah ini
Kecepatan pembentukan kompleks ES = k1 (Etotal - ES)S ...(2) Kecepatan pemutusan kompleks ES = k-1ES + k2ES ...(3)
Dengan membuat asumsi bahwa kecepatan awal merefleksikan keadaan tetap dimana ES
adalah konstan, sehingga kecepatan pembentukanES sama dengan kecepatan pemutusan ES.
Hal ini dikenal sebagai steady-state assumption.
Oleh karena itu, persamaan (2) dan (3) dapat dituliskan sebagai berikut:
k1(Etotal - ES)S = k-1ES + k2ES ...(4) Dengan tahap-tahap persamaan aljabar dapat dibuat persamaan untuk ES
k1EtotalS - k1ESS = (k-1 + k2)ES ...(5)
Dengan menambahkan k1ES pada kedua sisi, persamaan menjadi;
k1EtotalS = (k1S + k-1 + k2)ES ...(6) maka dapat diperoleh persamaan untuk ES:
k1EtotalS
ES = ...(7) k1S + k-1 + k2)
RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 4 Persamaan (7) dapat disederhanakan sebagai berikut:
EtotalS
ES = ...(8) S + (k-1+ k-2)/k1
(k-1+ k-2)/k1 adalah tetapan Michaelis = Km
Persamaan(10) disederhanakan menjadi:
EtotalS
ES = ………...(9) S + Km
Sekarang, V0 dapat diekspresikan dengan ES. Dengan menggantikan sisi kanan persamaan (9) untuk ES dalam persamaan (1) maka,
k2 EtotalS
V0 = ... ……….. (10) Km + S
Persamaan (10) dapat disederhanakan lebih lanjut. Karena kecepatan maksimum terjadi pad saat enzim saturasi dimana ES = Etotal , Vmax dapat didefinisikan sebagai k2Etotal, maka persamaan (12) menjadi:
Vmax S
V0 = Persamaan Michaelis-Menten ………...(11) Km + S
Persamaan Michaelis-Menten merupakan persamaan kecepatan reaksi untuk reaksi yang dikatalisa enzim dengan satu substrat. Persamaan Michaelis-Menten menggambarkan hubungan kuantitatif antara kecepatan awal V0, kecepatan maksimum, Vmax dan konsentrasi substrat awal, S. Semua dihubungkan melalui tetapan Michaelis, Km.
Km memiliki unit/satuan konsentrasi, molar.
Hubungan numerik yang penting yang diturunkan dari persamaan Michaelis-Menten adalah pada keadaan dimana V0 tepat setengah dari Vmax (V0 = ½ Vmax):
Vmax Vmax S
= ...(12) 2 Km + S
RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 5 Kedua sisi pada persamaan (12) dibagi dengan Vmax
1 S
= ...(13) 2 Km + S
Dari persamaan (13), Km dapat didefinisikan sebagaiberikut Km + S = 2S → Km = S pada saat V0 = 1/2Vmax
Gambar 3. Kebergantungan kecepatan awal terhadap konsentarsi substrat (Lehninger Principles of Biochemstry,6th Ed 2008 W.H.Freeman and Company)
Kurva pada Gambar 3 menunjukkan parameter kinetik yang menentukan limit kurva pada konsentrasi substrat rendah dan tinggi. Pada S rendah, Km >> S dan S sebagai penyebut pada persamaan Michaelis-Menten menjadi tidak signifikan. Persamaan disederhanakan menjadi V0 = Vmax S/Km, dan V0 memiliki hubungan yang linier dengan S.
Pada S tinggi, dimana S >> Km, nilai Km pada persamaan Michaelis-Menten menjadi tidak signifikan dan persamaan disederhanakan menjadi V0 = Vmax, hal ini konsisten dengan kurva yang plateu pada Gambar 3. Persamaan Michaelis-Menten konsisten dengan pengamatan bahwa V0 bergantung pada S dan bentuk kurva ditentukan oleh Vmax/Km pada S rendah dan Vmax pada S tinggi.
Setiap enzim memiliki nilai Km yang berbeda-beda untuk suatu substrat, hal tersebut menunjukkan seberapa kuatnya pengikatan substrat terhadap enzim. Konstanta lainnya yang juga berguna adalah kcat, yang merupakan jumlah molekul substrat yang dapat berikatan pada sisi aktif enzim per detik, yang disebut juga sebagai turnover number.
RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 6 Pada persamaan Michaelis-Menten:
kcat = Vmax/Etotal ………... (14)
maka persamaan (11) menjadi:
kcatEtotalS
V0 = ... (15) Km + S
Efisiensi suatu enzim diekspresikan oleh nilai kcat/Km yang dikenal sebagai konstanta kespesifikan. Konstanta kespesifikan mencerminkan kemampuan katalitik dan afinitas, yang dapat digunakan untuk membandingkan enzim yang satu dengan enzim yang lain, ataupun enzim yang sama dengan substrat yang berbeda. Konstanta kespesifikan maksimum teoritis disebut limit difusi yang nilainya sekitar 108 sampai 109 M-1 s-1. Pada titik ini, setiap tumbukan enzim dengan substrat akan menyebabkan katalisis, dan laju pembentukan produk tidak dibatasi oleh laju reaksi, melainkan oleh laju difusi. Enzim dengan sifat demikian disebut secara katalitik sempurna ataupun secara kinetika sempurna. Contoh enzim yang memiliki sifat seperti ini adalah karbonat anhidrase, asetilkolinesterase, katalase, fumarase, β-laktamase dan superoksida dismutase.
Persamaan Michaelis-Menten dapat ditransformasikan menjadi persamaan yang lebih berguna dalam menganalisa data. Transformasi umum untuk persamaan adalah dengan melakukan reciprocal pada kedua sisi persamaan Michaelis-Menten.
Vmax S
V0 = Km + S
1 Km + S
= ... (16) V0 Vmax S
Dengan memisahkan pembilang pada sisi kanan, maka persamaan (16) menjadi
1 Km S
= + ...(17) V0 Vmax S Vmax S
RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 7 Persamaan (17) disederhanakan menjadi
1 Km 1
= + ...(18) V0 Vmax S Vmax
Persamaan (18) disebut sebagai persamaan Lineweaver-Burk.
Untuk enzim yang menuruti persamaan Michaelis-Menten, plot 1/V0 terhadap 1/S (double reciprocal V0 vs S) akan menghailkan garis linier. Garis linier tersebut memiliki slope Km/Vmax, dan intercept 1/Vmax pada aksis 1/V0 dan intercept -1/Km pada aksis 1/S.
(Gambar 4)
Gambar 4. Double-reciprocal atau Lineweaver-Burk plot (Lehninger Principles of Biochemstry,6th Ed 2008 W.H.Freeman and Company)
Inhibisi Reaksi Enzim
Inhibisi reaksi enzim terbagi dalam 2 kategori utama: reversibel dan irreversibel. Inhibisi reversibel terbagi lagi ke dalam ada 3 jenis; inhibisi kompetitif (competitive inhibition), inhibisi tidak kompetitif (uncompetitive inhibition) dan inhibisi campuran (mixed-inhibition).
Competitive Inhibition
Inhibitor kompetitif mengikat enzim secara reversibel, menghalangi pengikatan substrat pada enzim, dan pengikatan substrat juga menghalangi pengikatan inhibitor.
RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 8 Pada inihibisi kompetitif, inhibitor dan substrat berkompetisi untuk berikatan dengan enzim pada sisi aktif enzim. Seringkali inhibitor kompetitif memiliki struktur yang sangat mirip dengan substrat asli enzim yang disebut sebagai substrat analog. Pada inhibisi kompetitif, kecepatan reaksi maksimal (Vmax) tidak berubah, tapi memerlukan konsentrasi substrat yang lebih tinggi untuk mencapai Vmax tersebut, sehingga meningkatkan nilai Km
Gambar 5. Inhibisi kompetitif (Competitive inhibition) (Lehninger Principles of Biochemstry,6th Ed 2008 W.H.Freeman and Company)
Uncompetitive inhibition
Inhibitor berikatan bukan pada sisi aktif enzim, tapi berikatan dengan kompleks ES menghasilkan kompleks EIS. Kompleks EIS yang terbentuk kemudian menjadi tidak aktif. Jenis inhibisi ini sangat jarang, namun dapat terjadi pada enzim-enzim multimerik.
Gambar 6. Uncompetitive inhibition
(Lehninger Principles of Biochemstry,6th Ed 2008 W.H.Freeman and Company)
RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 9 Inhibisi Campuran (mixed inhibition)
Non-competitive inhibition merupakan inhibisi campuran. Non-competitive inhibitor dapat mengikat enzim pada saat yang sama substrat berikatan dengan enzim. Baik kompleks EI dan EIS tidak aktif. Karena pengaruh inhibitor tidak dapat dhilangkan dengan peningkatan konsentrasi substrat. Pada inhibisi non-kompetitif, Vmax reaksi berubah, tapi karena substrat masih dapat mengikat enzim, maka nilai Km tidak berubah ( =’)
Mixed-inhibition mirip dengan inhibisi non-kompetitif, tetapi kompleks EIS memiliki aktivitas enzimatik residual.
Gambar 6. Inhibisi Campuran (Mixed-inhibition)
(Lehninger Principles of Biochemstry,6th Ed 2008 W.H.Freeman and Company)
Pengaruh inhibitor reversible secara kuantitatif dapat disimpulkan pada Tabel 1 di bawah ini:
Tabel 1. Pengaruh inhibitor reversible terhadap apparent Vmax dan apparent Km
Tipe inhibitor Apparent Vmax Apparent Km
Tanpa inhibitor Vmax Km
Kompetitif Vmax Km
Unkompetitif Vmax/’ Km/’
Mixed Vmax/’ Km/’
RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 10 Inhibisi Irreversibel
Inhibitor irreversibel berikatan secara kovalen dan merusak gugus fungsi enzim yang penting untuk aktivitas enzim, atau membentuk asosiasi non-kovalen yang stabil. Inhibisi irreversibel berguna dalam mempelajari mekanisme reaksi.
Inhibisi irreversibel dibagi dalam 3 kategori:
1. Group-specific
inhibitor yang bereaksi dengan rantai samping asam amino yang spesifik yag terdapat pada sisi aktif.
2. Affinity labels atau reactive substrate analogs
inhibitor yang berikatan kovalen pada sisi aktif. Struktur inhibitor mirip dengan substrat dan memodifikasi secara kovalen residu pada sisi aktif.
3. Suicide inhibitors
berikatan dengan enzim sebagai substrat dan dikatalisa oleh enzim, menghasilkan intermediet yang aktif secara kimia serta menginaktivasi enzim melalui modifikasi kovalen.
Referensi
1. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko and Lubert Stryer L, 2003, Biochemistry 5th ed, WH Freeman Company, New York, USA.
2. David L. Nelson and Michael M. Cox, 2013, Lehninger: Principles of Biochemistry, 6thed., Freeman Company, New York, USA.
