BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Bahan dan Alat 1. Bahan
Bahan yang digunakan adalah daun kenikir (C. caudatus ); untuk uji aktivitas antivirus digunakan telur ayam berembrio yang berumur 9 – 11 hari, virus inaktif avian influenza (A/chicken/Jogjakarta/MHW/2010) yang berasal dari koleksi drh. M Haryadi Wibowo, MP., eritrosit ayam; bahan kimia yang digunakan adalah etanol 96% teknis (brataco), alkohol 70% teknis (brataco), iodine tingture, kalium dihidrogen fosfat pa (Merck), Natrium hidroksida pa (Merck), parafin padat, asam asetat glasial 100% (Merck), asam borat pa (Merck), asam sitrat pa (Merck), rutin pa (Sigma), heksana pa (Merck), etil asetat pa (Merck), asam asetat anhidrida pa (Merck), asam sulfat 97% pa (Merck), Toluena pa (Merck), vanilin pa (fluka), metanol pa (Merck), oseltamivir 75 mg (Indofarma), aquabides,
2. Alat
a. Alat-alat yang digunakan dalam pembuatan serbuk yaitu : blender, pengayak, alat gelas.
b. Alat – alat yang digunakan dalam pembuatan ekstrak : bejana untuk maserasi, alat timbang, sendok pengaduk, kain penyaring.
c. Alat uji Antivirus antara lain : oven, alat-alat gelas, autoklaf, timbangan analitik, inkubator, spuit injeksi, tabung reaksi, mikroplate dasar U, diluter, multimikro pipet, kanul, flakon, lampu spiritus, bor telur, pinset, gunting, lampu teropong, LAF (Laminar Air Flow).
d. Alat untuk deteksi senyawa menggunakan KLT : Alat – alat gelas, lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, bejana KLT, lempeng selulosa (Merck), lempeng silika gel F254 (Merck).
B. Batasan Variabel Operasional
Definisi operasional penelitian :
1. Variabel Bebas adalah variasi konsentrasi ekstrak daun kenikir (C. caudatus ) 2. Variabel tergantung yang digunakan yaitu persentase hambatan virus AI
3. Variabel terkendali pada penelitian ini adalah telur ayam kampung berembrio yang telah dieramkan 9-11 hari, diberi virus AI dan diinkubasi selama 2-3 hari
C. Cara Kerja
1. Determinasi Tanaman Kenikir (C. caudatus)
Determinasi tanaman kenikir (C. caudatus) dilakukan di laboratorium Morfologi dan Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jendral Soedirman Purwokerto. 2. Pembuatan Ekstrak
a. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan
Pada penelitian ini digunakan daun segar dari tanaman kenikir (C. caudatus) yang diambil langsung dari petani di Desa Blambangan, Kecamatan Bawang, Banjarnegara. Daun dipetik pada siang hari pukul 09:00-11:00. Daun yang telah dikumpulkan dicuci dengan air yang mengalir untuk menghilangkan kotoran atau kontaminan yang menempel. Setelah daun kenikir (C. caudatus) dibersihkan lalu diangin-anginkan dan dikeringkan dalam almari pengering dengan suhu 60˚C sampai daun mudah untuk dihancurkan ketika diremas. Simplisia daun kenikir yang diperoleh, diserbuk menggunakan blender.
b. Pengayakan Simplisia
Serbuk yang diperoleh diayak menggunakan ayakan mesh 20/40, kategori serbuk kasar yaitu simplisia kering daun kenikir (C. caudatus) sebanyak 70% lolos pada ayakan mesh 20, dan sebanyak 30% simplisia kering daun kenikir lolos pada ayakan mesh 40. Kemudian serbuk yang diambil untuk diekstraksi adalah serbuk yang lolos pada ayakan mesh 20 dan mesh 40.
c. Pembuatan Ekstrak
Serbuk diekstraksi dengan teknik maserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Ekstraksi dilakukan selama 2 x 24 jam. Menggunakan perbandingan penyari dengan simplisia (1:10) untuk hari pertama yaitu 500 gram simplisia dilarutkan dalam 5 L etanol 96%. Kemudian disaring dengan kain penyaring selanjutnya ampas diekstraksi
kembali dengan penyari etanol 96% (1:4) untuk hari kedua yaitu residu serbuk simplisia dilarutkan dalam 2 L etanol 96%. Maserat diuapkan penyarinya hingga diperoleh ekstrak kental kenikir (C. caudatus). Ekstrak yang diperoleh digunakan untuk melakukan uji aktivitas terhadap virus AI.
3. Identifikasi Golongan Senyawa dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis
Disiapkan larutan uji, kemudian ditotolkan dengan pipa kapiler pada lempeng kromatografi lapis tipis silika gel F254 dan lempeng selulosa dengan ukuran 2 x 10 cm dan jarak eluasi 8 cm. Lempeng sebelumnya telah dipanaskan pada oven dengan suhu 110˚C selama 30 menit. Lempeng kemudian dimasukkan dalam bejana berisi fase gerak yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan cara ditutup dengan kaca dan diolesi dengan vaselin. Elusi dilakukan sampai tanda batas elusi. Kemudian dikeluarkan, dikeringanginkan dan hasilnya diidentifikasi. Identifikasi masing – masing dengan menggunakan pengamatan pada lampu UV 254 nm dan 366 nm. Selanjutnya dilakukan perhitungan harga Rf dari masing – masing bercak, kemudian diidentifikasi golongan senyawa yang terkandung di dalamnya.
Identifikasi golongan senyawa kimia dari profil kromatografi hasil KLT dilakukan dengan cara memberikan pereaksi penampak bercak untuk masing – masing golongan senyawa. Hasilnya diidentifikasi dengan melihat warna bercak, baik dengan sinar ataupun dengan sinar UV 366 nm. Reaksi positif ditunjukkan dengan warna.
a. Cara Pembuatan Pereaksi 1) Asam Asetat 15%
Asam asetat 15% dibuat dengan cara 15 mL asam asetat glasial 100% dilarutkan hingga 100 mL aquadest.
2) Sitroborat
Pereaksi sitroborat dibuat dengan cara 0,5 gram asam borat dan 0,5 gram asam sitrat dilarutkan dalam etanol sebanyak 50 mL.
3) Vanilin – asam sulfat
Vanilin asam sulfat dibuat dengan melarutkan 0,5 mL vanilin dengan 10 mL asam asetat glasial. Kemudian ditambah dengan 85 mL metanol dan 5 mL asam sulfat pekat.
Pereaksi ini dibuat dengan 5 mL asam asetat anhidrida ditambah dengan 5 mL asam sulfat pekat. Kemudian ditambah dengan 50 mL etanol.
5) Rutin 0,1 %
Rutin 0,1 % dibuat dengan menimbang 0,1 g rutin kemudian dilarutkan dalam 100 mL etanol 96%.
6) Eugenol 0,1%
Eugenol yang dibuat dilarutkan dalam toluol. Sebanyak 1 mL eugenol pekat dilarutkan dalam 10 mL toluol.
b. Identifikasi Flavonoid
Deteksi senyawa flavonoid dilakukan sebagai berikut : Fase diam : selulosa
Fase gerak : asam asetat 15 % Pereaksi semprot : sitroborat
Pembanding : rutin 0,1%
Positif : warna kuning pada sinar tampak
(Harborne, 1987) c. Identifikasi Triterpenoid
Deteksi senyawa Triterpenoid dilakukan sebagai berikut : Fase diam : silika gel F 254
Fase gerak : heksana : etil asetat (1:1) Pereaksi semprot : Lieberman-Burchard
Positif : warna hijau-biru pada sinar tampak
(Harborne, 1987) d. Identifikasi Minyak Atsiri
Deteksi senyawa Minyak Atsiri dilakukan sebagai berikut : Fase diam : silika gel F254
Fase gerak : toluena : etil asetat (93 : 7) Pembanding : eugenol 0,1 %
Pereaksi semprot : vanilin – asam sulfa
Positif : warna coklat jingga, positif eugenol
e. Identifikasi Saponin
Deteksi senyawa Saponin dilakukan sebagai berikut : Fase diam : silika gel F254
Fase gerak : kloroform : metanol : air (64 : 50 : 10) Pereaksi semprot : vanilin – asam sulfat
Positif : warna hijau-biru pada sinar tampak
(Depkes, 1987) 4. Uji Aktivitas Antivirus Ekstrak Etanol (C. caudatus) Terhadap Avian Influenza
a. Sterilisasi alat
Alat – alat gelas dan alat untuk inokulasi yang akan digunakan dicuci bersih dan dikeringkan. Kemudian dibungkus lalu disterilkan menggunakan oven dengan suhu 170˚C selama 1 jam untuk alat – alat gelas yang tahan pemanasan tinggi, dan autoklaf pada suhu 120˚C selama 20 menit untuk alat – alat yang tidak tahan terhadap pemanasan tinggi.
b. Pembuatan Larutan Uji
1) Cara Pembuatan PBS (Phosphate Buffer Saline) pH 7,2
Kalium dihidrogen fosfat 0,2 N sebanyak 50 mL ditambah dengan natrium hidroksida 0,2 N sebanyak 34,7 mL dalam labu takar 200 mL. Ditambahkan aqua bebas CO2 hingga garis batas, kemudian dicek pH.
2) Cara Pembuatan Larutan Vaksin
Uji ini dibagi dalam 4 kelompok perlakuan pada semua ekstrak, masing – masing kelompok terdiri dari 3 telur ayam berembrio. Virus Avian influenza yang diinjeksikan pada telur ayam berembrio sebanyak 0,2 mL virus inaktif Avian influenza yang mengandung 210 (1024 HAU) hemaglutinasi unit.
3) Cara Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak etanol kenikir (C. caudatus) ditimbang sebanyak 50 mg kemudian dilarutkan dalam PBS sebanyak 10 mL, diperoleh konsentrasi 5 mg/mL. Kemudian diencerkan lagi dengan mengambil 0,2 mL ditambahkan dengan PBS hingga 1 mL sehingga didapat konsentrasi 1 mg/mL. Kemudian, 0,1 mL dari larutan tersebut ditambahkan dengan PBS hingga 1 mL sehingga konsentrasinya 100 µg/mL. Dari 100 µg/mL diambil 0,1 mL ditambahkan dengan PBS hingga 1
mL, didapatkan konsentrasi yang kedua yaitu 10 µg/mL. Pada konsentrasi 10 µg/mL diambil 0,1 mL kemudian ditambahkan dengan PBS hingga 1 mL sehingga diperoleh konsentrasi ketiga yaitu 1 µg/mL.
Oseltamivir digunakan sebagai kontrol positif. Bobot isi kapsul sebesar 168 mg yang menggandung 75 mg oseltamivir. Pembuatan larutan ujinya dengan menimbang isi kapsul sebanyak 50 mg kemudian dilarutkan dalam PBS sebanyak 10 mL, diperoleh konsentrasi oseltamivir 2,232 mg/mL. Konsentrasi 2,232 mg/mL diambil 0,2 mL menggunakan pipet ukur 1 mL kemudian diencerkan dengan PBS hingga tepat 5 mL, sehingga konsentrasi yang didapatkan 0,0892 mg/mL.
a) Kelompok 1 :
Diberi ekstrak daun kenikir 1 µg/ mL sebanyak 0,1 mL dan virus inaktif Avian influenza sebanyak 0,2 mL
b) Kelompok 2 :
Diberi ekstrak daun kenikir 10 µg/mL sebanyak 0,1 mL dan virus inaktif Avian influenza sebanyak 0,2 mL
c) Kelompok 3 :
Diberi ekstrak daun kenikir 100 µg/ mL sebanyak 0,1 mL dan virus inaktif Avian influenza sebanyak 0,2 mL
d) Kelompok 4 :
Diberi virus inaktif Avian influenza sebanyak 0,2 mL e) Kelompok 5 :
Diberi kontrol positif oseltamivir 0,0892 mg/mL sebanyak 0,1 mL dan virus inaktif Avian influenza sebanyak 0,2 mL
Cara kerja uji ini adalah sebagai berikut: c. Uji Aktivitas Antivirus
1) Persiapan Telur Uji
Telur ayam berembrio yang didapat dari laboratorium susu dan daging di Bakulan, Parangtritis, Yogyakarta. Telur berembrio yang digunakan telah dieramkan 9-11 hari mempunyai bentuk dan berat yang hampir sama, kemudian diperiksa dengan lampu di dalam kamar gelap. Warna kuning telur tanpa
vasculature (bintik hitam) menandakan embrio yang hidup. Bagian kepala embrio dan batas rongga hawa diberi tanda dengan pensil. Telur ditempatkan pada inkubator dengan suhu 37˚C.
2) Inokulasi Virus dan Sampel ke Dalam Ruang Alantois
Kutub telur yang mengandung rongga hawa dan di sekitar kepala embrio terlebih dahulu disterilkan dengan cara menyeka permukaan menggunakan kain kasa yang telah direndam alkohol 70%, kemudian dibuat lubang dengan bor pada titik yang sudah ditandai sebelumnya. Sebanyak 0,2 mL suspensi virus diinokulasikan ke dalam ruang alantois menggunakan kanul yang cukup halus pada kedalaman 1,2 cm. Setelah inokulasi virus, dengan cara yang sama, masing-masing sampel dengan berbagai seri kadar diinokulasikan ke dalam ruang alantois. Lubang kanul ditutup dengan parafin padat yang dicairkan, kemudian telur berembrio dieramkan dalam mesin tetas selama 2-3 hari pada suhu 37˚C. 3) Membuka Telur Berembrio yang Diinokulasi Virus
Setelah dieramkan selama 2-3 hari, telur disimpan dalam almari es semalam (18 jam). Kutub tumpul telur berembrio disterilkan dengan alkohol 70%. Kerabang telur dipecahkan dengan pinset tajam, kemudian dibuat lubang sebesar atau lebih kecil dari rongga hawa. Embrio ditekan ke samping dengan pinset, cairan alantois yang terdapat di sisi embrio dihisap dengan spuit 5 mL. Sebanyak 0,25 mL cairan diteteskan di atas pelat agar darah untuk menguji ada tidaknya pertumbuhan virus. Sisanya disimpan dalam refrigerator.
4) Uji Hemaglutinasi
Uji hemaglutinasi (HA test) dapat digunakan untuk mendeteksi virus yang memiliki hemaglutinin. Adanya hemaglutinin akan dapat mengaglutinasi eritrosit dari beberapa spesies unggas, mamalia maupun manusia (Dewi, dkk., 2007). Pengujian hemaglutinasi (HA test) mikroteknik memerlukan suspensi eritrosit ayam dengan konsentrasi 0,5%. Cara mendapatkan yaitu darah ayam diambil melalui vena branchialis dengan menggunakan spuit dan needle diambil sebanyak 3 mL kemudian dimasukkan dalam tabung venoject yang telah diisi dengan antikoagulan. Darah tersebut disentrifuge selama 1 menit dengan kecepatan 3000 rpm (rotasi per menit). Supernatan dibuang sisa endapannya dicuci dengan menambahkan PBS (Phosphate buffer saline), kemudian disentrifuge lagi selama 1 menit. Setelah terjadi endapan kembali, supernatannya dibuang. Pencucian tersebut diulang sampai tiga kali dengan cara yang sama hingga didapatkan suspensi eritrosit ayam dengan konsentrasi 100%. Suspensi eritrosit ayam dengan konsentrasi 0,5% didapatkan dengan menambahkan PBS (Phosphate Buffer Saline) hingga konsentrasi 0,5%.
Uji hemaglutinasi dilakukan dengan menggunakan mikroplat dengan dasar “U” mempunyai 96 sumuran. Mengisi lubang sumuran dengan PBS (Phosphat Buffer Saline) sebanyak 0,5 mL mulai dari lubang sumuran 1-12 pada baris A sampai D, lubang mikroplat pada baris D digunakan sebagai kontrol virus. Lubang sumuran 1 pada baris A sampai C diisi dengan cairan alantois pada masing – masing seri konsentrasi sebanyak 0,5 mL dari telur ayam berembrio yang telah mengandung ekstrak etanol daun kenikir dan virus Avian influenza, dan pada baris D diisi dengan cairan alantois telur ayam berembrio yang tidak diberi ekstrak (kontrol virus). Lakukan pencampuran menggunakan mikrotiter masing – masing konsentrasi dengan cara digoyang selama 12 putaran dimulai dari lubang 1 sampai 12. Tambahkan sebanyak 0,5 mL eritrosit ayam 0,5% pada lubang 1 baris A sampai D, mikroplat tersebut dibiarkan pada suhu kamar selama 15-20 menit. Pembacaan uji hemaglutinasi dengan melihat terjadinya endapan
eritrosit ayam, apabila tidak terjadi endapan seperti pada lubang kontrol negatif (kontrol virus) dinyatakan negatif HA.
5) Perhitungan Titer Uji Hemaglutinasi
Perhitungan hemaglutinasi dilakukan dengan cara menghitung lubang yang positif adanya endapan eritrosit ayam pada dasar sumuran dimulai dari enceran yang paling pekat (lubang 1). Apabila terjadi sampai pada lubang ke-6, maka titer hemaglutinasi dinyatakan dengan nilai 2 6 yaitu sama dengan 64.
D. Pengolahan dan Analisa Data
Dilakukan perhitungan titer dari cairan alantois, dengan sistem Hemaglutinasi (HA) menggunakan plat mikro. Hemaglutinasi yang ada pada sumuran plat mikro dihitung persentase penghambatannya. Perhitungan persentase penghambatan oleh ekstrak daun Kenikir (C. caudatus) yang digunakan, menggunakan rumus :
100%
Dimana :P = Persentase penghambat infeksi
A = Jumlah titer pada telur ayam berembrio tanpa perlakuan ekstrak etanol daun kenikir. B = Jumlah titer pada telur ayam berembrio dengan perlakuan ekstrak etanol daun kenikir.
Data persentase hambatan antiviral dapat dianalisis secara statistik menggunakan SPSS. Analisis data menggunakan uji Anava satu arah, untuk mengetahui perbedaan hasil perhitungan dari masing – masing konsentrasi. Kemudian dilanjutkan dengan uji BNT untuk mengetahui signifikasi masing – masing konsentrasi ekstrak etanol daun Kenikir (Cosmos caudatus) dengan taraf kepercayaan 95%.
