POLA DISTRIBUSI DAN PRODUKSI ENERGI MITOKONDRIA SEL-SEL TROFOBLAS BLASTOSIS MENCIT(Mus musculus albinus) ROZA HELMITA

(1)

POLA DISTRIBUSI DAN PRODUKSI ENERGI

MITOKONDRIA SEL-SEL TROFOBLAS BLASTOSIS

MENCIT(Mus musculus albinus)

ROZA HELMITA

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2007

(2)

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudulpola distribusi dan produksi energi mitokondria sel-sel trofoblas blastosis mencit (Mus musculus albinus) adalah benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2007

Roza Helmita NRP B051050051

(3)

ABSTRAK

ROZA HELMITA. Pola distribusi dan produksi energi mitokondria sel-sel trofoblas blastosis mencit (Mus musculus albinus). Dibimbing oleh ITA DJUWITA, BAMBANG PURWANTARA dan ADI WINARTO.

Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari (1) tingkat kegagalan nidasi dan perlekatan sel-sel trofoblas pada substrat dalam kultur in vitro, (2) kemampuan pertumbuhan dan diferensiasi sel-sel trofoblas pada blastosis nidasi dan gagal nidasi, (3) aktivitas NADH-CoQ reductase sel-sel trofoblas dari blastosis nidasi dan gagal nidasi serta (4) pola distribusi mitokondria dari sel-sel trofoblas yang mengalami nidasi dan gagal nidasi dalam medium kultur in vitro. Blastosis dikoleksi dari kornua uterus mencit pada hari keempat setelah fertilisasi dan dibagi menjadi tiga kelompok blastosis yaitu: (1) nidasi dalam waktu 24 jam, (2) nidasi dalam waktu 48 jam dan (3) gagal nidasi. Masing-masing kelompok dikultur dalam medium DMEM yang diberi tambahan 50µg/ml gentamicin, NBCS 20%, 1µl/ml ITS (kandungan insulin 5µg/ml, tranferin 10µg/ml, selenium 5µg/ml; Sigma St Louis USA) dan ß-mercaptoethanol 14,3 mM (Sigma St Louis USA) pada inkubator CO2 5% suhu 37 °C selama 10 hari. Terhadap monolayer

trofoblas dilakukan pengukuran pertumbuhan (outgrowth) dengan menggunakan eyespiece micrometer, pewarnaan Giemsa untuk melihat morfologi sel yang berdiferensiasi dan pewarnaan histokimia untuk menganalisis NADH-CoQ reduktase, serta imunositokimia untuk mengetahui distribusi mitokondria. Hasil yang diperoleh menunjukkan terdapat perbedaan kemampuan nidasi blastosis dan perlekatan sel-sel trofoblas. Pertumbuhan (outgrowth) sel-sel trofoblas dari blastosis 24 jam nidasi berbeda secara signifikan dengan sel-sel trofoblas dari blastosis 48 jam nidasi dan blastosis gagal nidasi. Hasil pewarnaan Giemsa menunjukkan bahwa sel-sel trofoblas dari blastosis 24 jam dan 48 jam nidasi mampu berdiferensiasi menjadi sitotrofoblas, sinsitiotrofoblas dan spongiotrofoblas lebih banyak dibanding sel-sel trofoblas dari blastosis gagal nidasi. Aktivitas NADH-CoQ reduktase sel-sel trofoblas dari blastosis 24 jam dan 48 jam nidasi berbeda secara signifikan dengan sel-sel trofoblas dari blastosis gagal nidasi dan pola distribusi mitokondria sel-sel trofoblas pada blastosis nidasi dalam waktu 24 dan 48 jam menunjukkan keadaan normal dengan pola yang homogen yaitu tersebar merata di dalam sitoplasma, sedangkan blastosis gagal nidasi mempunyai pola distribusi mitokondria yang heterogen (abnormal) dan mengelompok dalam sitoplasma sel-sel trofoblas. Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh disimpulkan bahwa pola distribusi mitokondria yang abnormal dan gangguan produksi energi mitokondria dapat menyebabkan kegagalan nidasi dan implantasi.

(4)

ABSTRACT

ROZA HELMITA. The Pattern of Distribution and Energy Production of Mitochondrial in Trophoblast Cells of Mouse Blastocyst. Under the direction of ITA DJUWITA, BAMBANG PURWANTARA and ADI WINARTO

The objectives of this study were to investigate: (1) the failure of ability of blastocyst to hatch and attachment of trophoblast cells, (2) the outgrowth and differentiation of trophoblast cells in in vitro cultured undergo hatch and no hatch blastocyst, (3) the activity of mitochondria NADH-CoQ reductase and (4) the pattern of mitochondrial distribution. Blastocysts were collected from uterine horn of mice at day-4 of pregnancy. The animal were divided into 3 groups: blastocysts hatched within 24 hours, 48 hours and non hatching. Embryos were cultured in DMEM medium supplemented with 50µg/ml gentamicin, NBCS 20%, 1µl/ml ITS (kandungan insulin 5µg/ml, tranferin 10µg/ml, selenium 5µg/ml; Sigma St Louis USA) dan ß-mercaptoethanol 14,3 mM (Sigma St Louis USA) in 5% CO2

incubator at 37°C for 10 days. The outgrowth of trophoblast cells were measured using eyespiece micrometer. The trophoblasts monolayer were processed for Giemsa staining, histochemistry analysis of NADH-tetrazolium reductase activity and imunocytochemistry to examine the pattern of mitochondrial distribution. Results of this experiment showed that the ability of blastocyst hatching in in vitro was different. The outgrowth trophoblast diameter of 24 h hatched blastocyst was significantly higher than the 48 h hatched and non hatched blastocyst. Morphological examination using light microscope showed that the trophoblast monolayers of 24 h hatched blastocyst differentiated into cytotrophoblast, syncytioptrophoblast and spongiotrophoblast after 10 days of cultured. The activity of NADH-CoQ reductase of 24 h and 48 h hatched blastocysts showed higher staining intensity than the non hatched blastocysts. The distribution of mitochondrial within trophoblast cell cytoplasma of 24 h and 48 h hatched blastocyst were homogen around nucleus whereas those of non hatched blastocyst were clustered and heterogen. In conclusion, the failure of blastocysts hatching and implantation was due to the impairment of mitochondria to produce energy and the abnormal pattern of mitochondrial distribution.

Keywords: trophoblast Cells, blastocyst, mitochondrial, energy, distribution mitochondrial

(5)

RINGKASAN

ROZA HELMITA. Pola distribusi dan produksi energi mitokondria sel-sel trofoblas blastosis mencit (Mus musculus albinus). Dibimbing oleh ITA DJUWITA, BAMBANG PURWANTARA dan ADI WINARTO

Perkembangan embrio praimplantasi ada kalanya mengalami gangguan sehingga tidak semua embrio praimplantasi dapat mengalami nidasi dan implantasi. Diantara banyak faktor yang dapat mempengaruhi terjadinya kegagalan nidasi dan implantasi blastosis diantaranya adalah: (1) gangguan pada organel sel, misalnya pada mitokondria yang dapat mengakibatkan proses pembentukan energi tidak berfungsi dengan baik, (2) ketebalan zona pelusida, yakni semakin tebal zona pelusida maka energi dan tekanan yang dibutuhkan akan semakin besar untuk dapat menembus zona pelusida, (3) aktivitas enzim proteolitik yang berperan penting dalam mencerna zona pelusida sehingga zona pelusida menjadi tipis dan blastosis dapat dengan mudah keluar dari zona pelusida, dan (4) faktor penuaan (aging) yang dapat berkontribusi dalam perkembangan kualitas embrio praimplantasi. Kegagalan ini menyebabkan embrio dalam tahap blastosis tidak dapat nidasi atau berkontak dengan endometrium sehingga implantasi dan kebuntingan tidak dapat terjadi. Oleh karena itu tujuan dari penelitian ini untuk mempelajari dan memperoleh informasi mengenai: (1) tingkat kegagalan nidasi dan perlekatan sel-sel trofoblas pada substrat dalam kultur in vitro, (2) kemampuan pertumbuhan dan diferensiasi sel-sel trofoblas pada blastosis nidasi dan gagal nidasi dan (3) aktivitas NADH-CoQ reduktase sel-sel trofoblas dari blastosis nidasi dan gagal nidasi serta (4) pola distribusi mitokondria dari sel-sel trofoblas yang mengalami nidasi dan gagal nidasi dalam medium kultur in vitro.

Penelitian ini menggunakan blastosis mencit yang dibagi kedalam tiga perlakuan, yaitu: (1) blastosis yang nidasi cepat (24 jam), (2) blastosis yang nidasi lambat (48 jam) dan (3) blastosis yang gagal nidasi. Masing-masing kelompok dikultur sampai membentuk monolayer selama 10 hari, selanjutnya diukur penjuluran sel-sel trofoblas pertumbuhan (outgrowth), diidentifikasi morfologi sel-sel trofoblas yang mengalami diferensiasi dan aktivitas NADH-CoQ reductase secara histokimia serta distribusi mitokondria secara imunositokimia. Masing-masing perlakuan menggunakan minimal 10 embrio. Data tingkat nidasi blastosis dan perlekatan, pertumbuhan (outgrowth) serta aktivitas NADH-CoQ reductase sel-sel trofoblas diuji dengan analisis keragaman dan dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) menggunakan software Statistic Analyses System (SAS 2000). Data morfologi sel-sel trofoblas yang mengalami diferensiasi dan pola distribusi mitokondria sel-sel trofoblas dianalisis secara deskriptif.

Hasil pengamatan terhadap 99 blastosis yang dikultur dalam TCM 199 menunjukkan kecepatan nidasi yang berbeda, yaitu terdapat blastosis yang nidasi dalam waktu 24 dan 48 jam masing-masing sebesar 28% dan 17%, tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Namun jumlah kedua kelompok perlakuan tersebut (24 dan 48 jam) menunjukkan perbedaan yang nyata jika dibandingkan dengan blastosis yang mengalami gagal nidasi sebanyak 55%. Blastosis yang gagal nidasi dibantu keluar dari zona pelusida menggunakan pronase 0,05% sehingga sel-sel trofoblas dapat melekat pada dasar cawan petri. Akan tetapi,

(6)

blastosis yang nidasi tidak semuanya dapat melakukan perlekatan (attachment). Hasil pengamatan terhadap 28 blastosis nidasi dalam waktu 24 jam yang mampu melekat sebanyak 15 (54%) embrio, sedangkan 17 blastosis yang nidasi dalam waktu 48 jam sebanyak 7 (41%) embrio (Tabel 1). Hal ini menunjukkan bahwa walaupun secara morfologi blastosis yang dikultur memiliki kualitas yang sama, namun setelah kultur in vitro menunjukkan viabilitas yang berbeda.

Kemampuan pertumbuhan sel-sel trofoblas dari blastosis nidasi dan gagal nidasi sangat berbeda yang ditunjukkan oleh rataan pertumbuhan sel-sel trofoblas. Hasil pengukuran pada hari ke-10 kultur menunjukkan bahwa rataan pertumbuhan sel-sel trofoblas yang dihasilkan oleh blastosis nidasi dalam 24 jam mencapai 652,6 ± 306µm, berbeda nyata (P < 0,05) dengan blastosis yang nidasi dalam 48 jam dan gagal nidasi, masing-masing 322,9 ± 87µm dan 180,2 ± 60µm (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa kegagalan nidasi yang terjadi pada individu blastosis juga berkaitan erat dengan kemampuan pertumbuhan sel khususnya sel-sel trofoblas. Pertumbuhan sel-sel trofoblas dapat dijadikan indikasi dalam menentukan keberhasilan proses implantasi. Semakin luas pertumbuhan sel-sel trofoblas menunjukkan kemampuan invasi sel trofoblas yang tinggi. Invasi sel-sel trofoblas penting untuk membentuk anchoring vili yang menjadi perantara hubungan antara maternal dan fetus.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat perbedaan kemampuan diferensiasi antara blastosis yang nidasi (24 dan 48 jam) dengan blastosis yang gagal nidasi. Pada blastosis nidasi (24 dan 48 jam ) ditemukan sekitar 50% sitotrofoblas, 30% sinsitiotrofoblasdan 15% spongiotrofoblas dari jumlah total sel yang berdiferensiasi. Sedangkan blastosis yang gagal nidasi mempunyai kemampuan berdiferensiasi yang rendah, ditunjukan dari hasil pengamatan terhadap monolayer sel trofoblas yang mengalami diferensiasi menjadi sinsitiotrofoblas sekitar 10-30%, selebihnya berdiferensiasi menjadi sitotrofoblas serta tidak ditemukan spongiotrofoblas dan glikogen trofoblas.

Pada perkembangan embrio dari blastosis sampai pasca implantasi, terjadi peningkatan kebutuhan energi (ATP). Energi yang diambil berasal dari hasil fosforilasi oksidasi. Energi (ATP) yang dihasilkan dari reaksi fosforilasi oksidasi lebih banyak dibandingkan dengan glikolisis atau siklus Kreb. Hasil identifikasi secara histokimia terhadap aktivitas enzim NADH-CoQ reduktase pada sel-sel trofoblas menunjukkan perbedaan intensitas warna yang nyata (P < 0,05) antara blastosis yang nidasi 24 dan 48 jam dengan blastosis gagal nidasi (Tabel 3). Hasil pengamatan terhadap 15 blastosis yang nidasi pada 24 jam kultur dan 10 blastosis yang nidasi pada 48 jam kultur menunjukkan intensitas warna biru tua (skor 3) (100%). Disisi lain, 11 dari 12 blastosis yang gagal nidasi (91,67 %) tidak menunjukkan intensitas warna biru (skor 0) dan hanya satu blastosis (0,08 %) menunjukkan intensitas warna biru muda (skor 1). Berdasarkan hasil tersebut menunjukkan bahwa aktivitas NADH-CoQ reduktase pada sel-sel trofoblas blastosis yang nidasi lebih tinggi dibandingkan dengan blastosis gagal nidasi. Hal ini berarti bahwa sel-sel trofoblas dari blastosis gagal nidasi mengalami gangguan atau disfungsi mitokondria, terutama dalam proses pembentukkan energi (sistem transpor elektron atau fosforilasi oksidasi). Produksi energi yang kurang pada awal implantasi dapat menghambat proliferasi dan diferensiasi sel-sel trofoblas. Pembentukkan energi (ATP) dalam mitokondria pada sistem transpor elektron atau fosforilasi oksidasi sangat tergantung pada aktivitas enzim-enzim yang

(7)

terdapat dalam matriks mitokondria, misalnya enzim NADH-CoQ reduktase. Adanya gangguan pada komponen kunci rantai transpor elektron yaitu pada kompleks I (NADH-CoQ reduktase) dapat mengakibatkan terganggu atau tidak terbentuknya elektron sehingga energi (ATP) tidak dapat dihasilkan dengan efisien dan dapat mengganggu fisiologis sel. Selanjutnya mengakibatkan sel mengalami lisis atau apoptosis sehingga sel tidak dapat tumbuh dan berdiferensiasi ke proses selanjutnya. Hasil imunositokimia terhadap mitokondria pada sel-sel trofoblas dari blastosis nidasi dan gagal nidasi terdapat perbedaan pola distribusi mitokondria di sitoplasma sel-sel trofoblas. Pada sel-sel trofoblas yang nidasi mempunyai pola distribusi mitokondria yang homogen yaitu mitokondria tersebar secara merata disekitar nukleus, sedangkan pola distribusi mitokondria dari sel-sel trofoblas yang gagal nidasi yaitu heterogen, tidak tersebar merata tetapi mitokondria tersebar secara acak dan mengelompok pada satu tempat. Pola distribusi mitokondria yang heterogen pada sel-sel trofoblas dari blastosis gagal nidasi mengindikasikan adanya gangguan distribusi energi (ATP) ke dalam nukleus sehingga nukleus kekurangan energi (ATP) yang diperlukan untuk menjalankan fungsinya, seperti proliferasi dan diferensiasi. Selain itu, pola distribusi mitokondria yang heterogen atau mengelompok dapat dijadikan sebagai indikasi sel akan atau mengalami apoptosis. Hal ini disebabkan dalam proses apoptosis melibatkan mitokondria. Sel yang mengalami apoptosis mempunyai energi (ATP) yang rendah atau menurun. Dengan demikian ATP yang tersedia menjadi sedikit dan berdampak pada pertumbuhan dan aktivitas sel-sel trofoblas.

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa rendahnya aktivitas NADH-CoQ reduktase dan pola distribusi mitokondria abnormal (heterogen) mengakibatkan kemampuan pertumbuhan dan diferensiasi sel-sel trofoblas rendah yang selanjutnya dapat berdampak pada kegagalan nidasi dan implantasi.

(8)

© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2007

Hak cipta dilindungi Undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber

a. pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah.

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

(9)