V. HASIL PENGAMATAN
Tabel 1. Hidrolisis Enzim Beta-Fruktofuranosidase
Tabung [S] A V = ( ) 1/S (x) 1/V (y) 11 150 0,409 0,001136 0,00667 880,281 12 120 0,688 0,001911 0,00833 523,286 13 90 0,930 0,00258 0,011 387,597 14 60 1,264 0,00351 0,0167 284,90 15 30 1,363 0,00379 0,033 263,852
Hasil regresi kalkulator : A = 715,55 B = -16351,79 A = 1 715,55 = 1 Vmax = 1,398x10-3 B = -16351,79 = 1,398x10−3 Km = -22,852 0 200 400 600 800 1000 0,00667 0,00833 0,011 0,0167 0,033 1/V 1/S Kurva standar untuk larutan glukosa dengan
VI. PEMBAHASAN
Invertase dikenal sebagai β-fructofuranoside fructohydrolase merupakan sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa yang menghasilkan fruktosa dan glukosa (gula invert). Sukrosa merupakan produksi akhir asimilasi karbon (C) pada proses fotosintesis yang terjadi di daun (Kim et al. 2000) dan bentuk karbohidrat yang mudah ditransportasikan ke jaringan simpan atau sink tissues (Cheng et al .1996).
Enzim invertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung khamir
Saccharomyces ceriviseae. Invertase diproduksi oleh bakteri, fungi, tumbuhan
tingkat tinggi, dan beberapa sel hewan (Lee Huang et al. 2000). Tetapi banyak penelitian dilakukan pada produksi invertase yang dihasilkan oleh khamir
Saccharomyces cereviceae. Khamir ini banyak terkandung pada ragi roti,
dan secara komersil banyak dijual dipasaran. Khamir atau Yeast merupakan mikroorganisme uniseluler berbentuk ellips, bulat atau silindris, yang ukurannya 5-10 kali lebih besar dari bakteri. Enzim invertase yang dihasilkan oleh
Saccharomycees ceriviceae mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 4,5 dan
temperatur 30ºC (Bergamasco et al. 2000).
Pada praktikum kali ini diawali dengan pemurnian enzim fruktofuranosidase kemudian hidrolisis sukrosa dengan β-enzm dan uji benedict. Langkah-langkah yang dilakukan dalam pemurnian enzim fruktofuranosidase ialah sebanyak 0,5 gram yeast dihaluskan kemudian ditambahkan 50 ml buffer pH 4,7 kemudian dilakukan sentrifius dan diambil filtratnya. Untuk melakukan hidrolisis sukrosa, maka sukrosa, ditambahkan akuadest dan buffer dengan jumlah tertentu. Kemudian campuran tersebut dipanaskan pada suhu 370C selama 5 menit. Lalu sebanyak 2 ml suspensi yeast 1% di tambahkan ke dalam campuran tersebut dan campuran tersebut diinkubasi pada suhu 370C selama 6 menit. Suhu tersebut di atur agar tidak terlalu panas, karena suhu yang terlalu panas maka mikroorganisme penghasil enzim intervase akan mati, sehingga enzim tidak akan diperoleh. Setelah selesai masa inkubasi, larutan tersebut ditambahkan 1 ml NaOH 1%. Pemecahan sel dilakukan setelah proses inkubasi. Hal ini dikarenakan enzim invertase termasuk enzim yang berada di dalam sel (intraseluler), maka perlu dilakukan proses pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan enzim di
dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih banyak. Fungsi dari penambahan NaOH ini adalah untuk membantu proses pemecahan sukrosa.
Satu unit aktivitas enzim merupakan banyaknya μmol gula pereduksi yang dihasilkan oleh 1 ml enzim pada setiap menit (Bayramolu et al., 2003). Gula invert merupakan campuran antara glukosa dan fruktosa yang diperoleh dari hasil hidrolisisi sukrosa. Sukrosa bukan merupakan gula pereduksi sedangkan glukosa dan fruktosa merupakan gula pereduksi, maka dari itu pada praktikum ini dilakukan uji benedict. Uji benedict ini digunakan untuk membedakan gula reduksi berdasarkan ion cupri dalam suasana alkalis dengan indicator yaitu adanya perubahan warna khususnya menjadi merah bata, bila kadar gula reduksinya lebih rendah maka akan tampak warna biru, hijau, merah atau merah kekuningan. Pengujian ini berdasarkan dari reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh karbohidrat yang mempunyai gugus aldehid (-CHO) atau keton bebas (-CO-). Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya pengendapan CaCO3 dalam larutan Na-karbonat pada larutan benedict. Pereaksi kupri sulfat, natrium sitrat, dan natrium karbonat. Monosakarida segera mereduksi senyawa-senyawa pengoksidasi seperti ferisianida, gen peroksida, atau ion kupri (Cu2+). Pada reaksi seperti ini, gula direduksi pada gugus karbonil dan senyawa pengoksidasi menjadi tereduksi. Adapun reaksi yang berlangsung sebagai berikut.
O O ║ ║
R—C—H + Cu2+ 2OH- → R—C—OH + Cu2O Gula Pereduksi Endapan Merah Bata Adapun struktur dari glukosa dan sukrosa adalah sebagai berikut:
Untuk melakukan uji benedict ini maka sebanyak 3 ml larutan yang diperoleh dari hasil hidrolisis sukrosa tersebut ditambahkan 1 ml benedict kemudian dipanaskan pada suhu 960C selama 2 menit untuk memperjelas warna yang menunjukkan adanya gula invert. Setelah dipanaskan maka larutan tersebut didinginkan dengan hasil berupa larutan berwarna hijau. Semakin tinggi konsentrasi gula invert maka warna hijau semakin dominan. Agar absorbansinya dapat diukur oleh spektrofotometer maka larutan tersebut diencerkan terlebih dahulu dengan cara menambahkan aquadest lalu dikocok sehingga warna yang dihasilkan tidak terlalu pekat dan menjadi hijau muda. Setelah itu, larutan hasil pengenceran dipindahkan ke dalam kuvet untuk dilakukan pengukuran absorbansinya dengan menggunakan λ 630 nm.
Adapun hasil pengamatan dari praktikum ini dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Hidrolisis Enzim Beta-Fruktofuranosidase
Tabung [S] A V = ( ) 1/S (x) 1/V (y) 11 150 0,409 0,001136 0,00667 880,281 12 120 0,688 0,001911 0,00833 523,286 13 90 0,930 0,00258 0,011 387,597 14 60 1,264 0,00351 0,0167 284,90 15 30 1,363 0,00379 0,033 263,852
Sumber: Dokumentasi pribadi, 2011
Berdasarkan data di atas dapat dilihat bahwa nilai absorbansi atau A untuk setiap tabung berbeda. Semakin rendah nilai S maka semakin tinggi nilai A dan semakin tinggi pula nilai V. Setiap enzim mempunyai nilai tetapan Michaelis-Menten tertentu, dimana nilai Km dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah substrat yang diperlukan agar reaksi enzimatis berjalan efisien. Dengan mengetahui nilai Km dan Vm suatu enzim, maka dapat dilakukan optimalisasi penggunaan enzim tersebut sebagai biokatalisator reaksi pemecahan substrat menjadi produk. Laju reaksi meningkat saat suhu mencapai nilai optimum dan
berkurang saat suhunya maksimum. Sedangkan aktivitas enzim akan meningkat dengan meningkatnya kadar substrat (Lehinger 1982).
Jika dibuat hubungan antara laju (V) dengan konsentrasi substrat (S) maka penambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi dikarenakan aktivitas enzim invertase semakin besar. Akan tetapi pada batas konsentrasi tertentu tidak akan terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi substrat diperbesar dikarenakan enzim sudah jenuh dengan substratnya. Atau dengan kata lain tidak terdapat lagi sisi aktif enzim karena hampir semua enzim telah membentuk kompleks enzim-substrat [ES]. Harga Vm dan Km dapat ditentukan dengan menggunakan persamaan Lineweaver Burk (Lehninger, 1997), sebagai berikut: 1 0 = 1 + . 1 [ ]
Penentuan kinetika enzim intervase (Vmax dan Km) didasarkan pada plot grafik hubungan antara konsentrasi enzim dan substrat (Fayyaz et al. 1995; Dinu, 2001). Selanjutnya dibuat tabel V dan [S] dan dikonversikan menjadi 1/V dan 1/[S] seperti pada tabel 1 di atas. Lalu ditentukan nilai Vmaks dan Km yang didasarkan atas persamaan kurva Lineweaver Burk, dengan cara:
Bahwa dari persamaan: 1= 1 + . 1
[ ] di atas, Bila 1
= Y dan 1
[ ]= X, maka rumusnyadapat ditulis menjadi: Y = a + bX, sehingga: a = 1 dan b = Dengan demikian, bila harga 1 diketahuimaka nilai Vmaks didapat, begitu
pula nilai Km akan juga didapat dari persamaan b .
Berdasarkan persamaan tersebut dan dengan menggunakan data yang diperoleh dari praktikum maka diperoleh kurva standar untuk larutan glukosa dengan perlakuan benedict sebagai berikut:
Berdasarkan kurva hubungan 1
V dengan 1
[S] untuk larutan glukosa dengan perlakuan reagen benedict di atas, maka diperoleh intersep sebesar 715,55 dan nilai slope sebesar -16351,79 sehingga diperoleh persamaan regresi Y= 715,55 - 16351,79x, dengan demikian diperoleh nilai Vmax sebesar 1,398 x 10-3 μmol/ml.menit dan nilai Km sebesar -22,852. Nilai R2 dari kurva di atas adalah 0,4794. Hal ini menunjukkan bahwa kelinearan kurva standar baik karena hampir mendekati +1 dimana titik-titik pada kurva standar melewati garis lerengnya.
Aktivitas enzim invertase yang mula-mula meningkat secara signifikan sejalan dengan meningkatnya konsentrasi substrat, tetapi tidak signifikan setelah konsentrasi substrat ditingkatkan lagi. Hal ini terjadi karena suatu reaksi enzimatisakan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat [S], akan tetapi setelah [S] meningkat lebih lanjut akan sampai pada kecepatan yang tetap. Pada kondisi dimana kecepatan reaksi enzimatis tidak dapat bertambah lagi dengan bertambahnya [S] disebut kecepatan maksimum (Vmaks) (Wiesman, 1989).
Penentuan Vmaks akan menghasilkan gambaran tentang sifat-sifat kinetika enzim lain, ½Vmaks, yaitu suatu konsentrasi substrat yang separuh lokasi aktifnya telah terisi atau bila kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai setengah dari kecepatan maksimum, yang dikenal dengan Km (tetapan Michaelis-Menten). Nilai Km digunakan selain sebagai ukuran afinitas E-S juga berhubungan dengan tetapan keseimbangan disosiasi kompleks E-S menjasi E dan S. Fayyaz (1995) menambahkan bila nilai Km kecil berarti kompleks E-S mantap dan afinitas enzim terhadap substrat tinggi, sedangkan bila nilai Km besar afinitasnya menjadi
0 200 400 600 800 1000 0,00667 0,00833 0,011 0,0167 0,033 1/V 1/[S] Kurva standar untuk larutan glukosa dengan
rendah. Harga Km enzim sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat, keadaan lingkungan dan kekuatan ion. Pada percobaan kali ini didapat Vmax mendekati nol artinya reaksi berjalan sangat lambat. Serta didapatkan Km bernilai negatif artinya konsentrasi substrat yang dibutuhkan untuk mencapai ½ Vmax sangat sedikit sekali karena reaksi yang terjadi berjalan sangat lambat.
VII. KESIMPULAN
Invertase dikenal sebagai β-fructofuranoside fructohydrolase merupakan sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa yang menghasilkan fruktosa dan glukosa (gula invert).
Enzim invertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung khamir Saccharomyces ceriviseae.
Untuk menentukan konstanta Michaelis-Menten (Km) maka dilakukan pemurnian enzim fruktofuranosidase kemudian hidrolisis sukrosa dengan β-enzm dan uji benedict.
Dari hasil praktikum diperoleh nilai Vmax sebesar 1,398 x 10-3 μmol/ml.menit dan nilai Km sebesar -22,852.
Vmax mendekati nol artinya reaksi berjalan sangat lambat.
Km bernilai negatif artinya konsentrasi substrat yang dibutuhkan untuk mencapai ½ Vmax sangat sedikit sekali karena reaksi yang terjadi berjalan sangat lambat.
DAFTAR PUSTAKA
Bayramolu, G., Akgol, S., bulut, A., Denizli, A. And Yakup, A.M. (2003), Covalent immobilization of invertase onto a reactive film composed of 2-hydroxyethyl methacrylate and glicidyl methacrylate, Biochemical Engineering Journal, 14: 117-126
Bergamasco R., Bassetti FJ, Moraes FF, ZaninGM. 2000. Characterization of free andimmobilized invertase regarding activity andenergy of activation. Brazilian Journal of Chemical Engineering: 873-880
Cheng, WH, Im KH, Chourey PS. 1996. Sucrose phosphate synthase expression at the cell andtissue leve1 is coordinated with sucrose sink-tosource transitions in maize leaf. Plant Physiol 111 : 1021-1029
Dinu D. 2001. Enzymatic hydrolysis of pectic acidand pectins by polygalacturonase from Aspergillus niger. Roum Biotechnol 6 (5) :397-402
Fayyaz A, Asbi BA, Ghazali HM, Che-Man YB,Jinap S. 1995. Kinetics of papaya pectinesterase. Jurnal of Food Chemistry 53 :129-135
Kim J.Y., Mahe A, Brangeon J, Prioul JL. 2000.Amaize vacuolar invertase , IVR2, is induced by water stress. Organ/tissue specificity anddiurnal modulation of expression. Plant Physiol 124:71-84
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilidke-1. Maggy Thenawidjaja; penerjemah.Terjemahan dari: Principles Of Biochemistry.Erlangga: Jakarta Wiseman A. 1989. Handbook of Enzyme Biotechnology. 2nd. Edition. New
