BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan mulai Nopember 2011 sampai dengan Maret 2012 di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan dan Laboratorium Fisiologi dan Toksikologi Serangga Departemen Proteksi Tanaman IPB, dan di Laboratorium Bakteriologi dan Laboratorium Biomolekuler Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian.
Penyediaan Isolat dan Karakterisasi Bakteri Xanthomonas campestris pv. campestris
Analisis Ciri Morfologi dan Fisiologi Bakteri
Bakteri Xcc yang digunakan adalah isolat bakteri koleksi Balai Penelitian Tanaman Hias, Segunung, Cianjur, Jawa Barat yang diidentifikasi oleh Ir.
Hanudin. Isolat bakteri Xcc koleksi Balai Penelitian Tanaman Hias diuji ciri morfologi dan fisiologinya berupa warna dan karakter koloni pada media Yeast extract, Dextrose, CaCO3 (YDC), uji Gram, oksidase, katalase, aerob/anaerob, pertumbuhan 40 oC dan reaksi hipersensitif pada tanaman tembakau.
Analisis Ciri Molekuler Bakteri Menggunakan Teknik PCR
Konfirmasi isolat secara molekuler dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer spesifik untuk Xcc XCF (5’-CGA TTC GGC CAT GAA TGA CT-3’) dan XCR (5’CTG TTG ATG GTG GTC TGC AA-3’) yang akan menghasilkan pita DNA dengan ukuran 535 bp (Park et al. 2004).
Ekstraksi DNA dilakukan dengan mengikuti prosedur protokol Qiagen yang dimodifikasi dengan penggunaan proteinase-K untuk optimasi ekstraksi DNA yang berasal dari kultur murni (Wulandari I 12 Maret 2010, komunikasi pribadi).
Satu loop penuh bakteri berumur 48 jam dimasukkan dalam tabung ependorf 1.5 ml berisi 400 µl akuades steril, ditambahkan 400 µl bufer AP1 dan 4 µl RNAse.
Suspensi ditambahkan 4 µl proteinase-K setelah diinkubasi pada 65oC selama 10 menit. Suspensi diinkubasi kembali pada 37oC selama 1 jam untuk mengoptimalkan proteinase-K dalam memecah protein pada sel bakteri. Prosedur
ekstraksi berikutnya mengikuti langkah-langkah ekstraksi menurut protokol Qiagen (Lampiran 15).
DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan total reaksi sebanyak 25 µl, terdiri dari 2 µl DNA hasil ekstraksi, 12.5 µl master mix (FermentasTM), 8.5 µl ddH2O, dan 1 µl primer (20 pmol/µl). Reaksi PCR dijalankan sebanyak 35 siklus, terdiri dari denaturasi pada 94oC selama 15 detik, annealing pada 58oC selama 30 detik, extension pada 72oC selama 15 detik dengan pra denaturasi pada 94oC selama 5 menit, dan final extension 72 oC selama 5 menit. Hasil amplifikasi dianalisis melalui elektroforesis gel agarosa 1.5% dalam buffer TAE 1x, voltase 70 V selama 45 menit. Gel agarosa direndam dalam larutan etidium bromida selama 15 menit kemudian diamati dengan UV transiluminator.
Deteksi X. campestris pv. campestris pada Benih Lima Kultivar Kubis Benih kubis yang diuji adalah empat kultivar benih yang diperoleh dari pintu pemasukan karantina Pelabuhan Laut Tanjung Priok yaitu Green Hero, Green Nova, Green Coronet, dan ITTO serta benih kubis hibrida komersial kultivar Grand 22 produksi PT Bisi International Tbk.
Sebanyak 4.5 g benih (setara 1000 butir benih) disterilisasi permukaan menggunakan 0.5% natrium hipoklorit selama 3 menit dan dibilas 3 kali menggunakan akuades steril. Benih digerus dalam 45 ml SX broth, kemudian dikocok menggunakan shaker pada suhu ruang selama satu malam. Suspensi dipindahkan ke tabung steril dan dilakukan pengenceran berseri 100-10-5. Sebanyak 100µl dari setiap pengenceran disebar pada media semiselektif SX.
Selanjutnya media diinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari.
Pengamatan dilakukan dengan menghitung koloni bakteri yang tumbuh pada media SX. Bakteri digores ulang pada media YDC. Koloni bakteri yang menunjukkan karakter koloni berwarna kuning, cembung, dan mukoida kemudian diidentifikasi dengan teknik PCR.
Penyediaan Ekstrak Bahan Tumbuhan dan Kitosan
Ekstraksi bahan tumbuhan yaitu daun sirih, bunga cengkih, daun binahong, dan rimpang kunyit dilakukan di Laboratorium Fisiologi dan Toksikologi
Serangga IPB. Kitosan yang digunakan diperoleh dari Departemen Teknologi Hasil Perikanan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB.
Ekstraksi bahan tumbuhan dilakukan dengan metode maserasi (perendaman). Daun sirih, bunga cengkih, daun binahong, dan rimpang kunyit terlebih dahulu dikering anginkan. Setiap bahan dipotong kemudian digiling menggunakan blender. Hasil penggilingan dimasukkan dalam tabung erlenmeyer dan direndam dengan metanol hingga terendam sempurna selama 24 jam.
Rendaman masing-masing bahan tumbuhan disaring pada corong gelas yang dialasi kertas saring. Hasil penyaringan kemudian diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator pada tekanan 500-700 mmHg dan suhu 50oC untuk mendapatkan ekstrak kasar. Proses perendaman diulangi kembali menggunakan metanol hasil penguapan. Setelah itu filtrat diuapkan dalam kamar asap, ekstrak kasar yang diperoleh disimpan pada 4oC hingga saat digunakan dalam pengujian.
Uji Keefektifan Ekstrak Tumbuhan dan Kitosan terhadap X. campestris pv. campestris secara In Vitro
Suspensi stok ekstrak tumbuhan dilarutkan dalam akuades steril dan tween 20 (5%) sebagai pengemulsi kemudian dihomogenkan menggunakan vortex.
Kitosan dilarutkan dalam asam asetat 1%. Pengujian dilakukan dengan prinsip pengenceran berseri (Khunaifi 2010). Enam tabung reaksi diisi 4 ml media NB.
Larutan ekstrak sebanyak 4 ml dimasukkan dalam tabung pertama, dihomogenkan menggunakan vortex kemudian diambil 4 ml dimasukkan dalam tabung kedua dan seterusnya hingga tabung terakhir sehingga konsentrasi media setengah dari konsentrasi semula.
Konsentrasi ekstrak tumbuhan yang diuji adalah 10%, 5%, 2.5%, 1.25%, 0.625%, dan 0.3125%. Kitosan dilarutkan dalam asam asetat 1% dengan konsentrasi 2 % dengan prinsip yang sama yaitu pengenceran berseri sehingga didapatkan konsentrasi 2%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%, dan 0.0625% Kontrol adalah media NB yang dicampur dengan pelarut. Tabung diisi 1 ml suspensi bakteri Xcc dengan kepadatan koloni 108 cfu/ml (OD: 0.15). Media diinkubasi dalam shaker pada suhu ruang selama 24 jam dengan kecepatan 150 rpm.
Pengujian pengaruh penghambatan oleh ekstrak tumbuhan dan kitosan terhadap bakteri dilakukan dengan metode pengenceran berseri dan dicawankan pada media NA. Pengamatan dilakukan dengan menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada media NA setelah diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam.
Konsentrasi ekstrak tumbuhan dan kitosan yang menunjukkan tingkat penghambatan terhadap bakteri Xcc digunakan lebih lanjut dalam pengujian pengaruh konsentrasi ekstrak tumbuhan dan kitosan terhadap Xcc secara in vitro.
Percobaan dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap dengan 3 kali ulangan.
Uji Pengaruh Konsentrasi Ekstrak Sirih dan Cengkih serta Kitosan terhadap X. campestris pv. campestris secara In Vitro
Taraf konsentrasi diuji berdasarkan hasil uji pendahuluan keefektifan ekstrak tumbuhan dan kitosan secara in vitro. Pada uji keefektifan ekstrak tumbuhan dan kitosan terhadap bakteri Xcc didapatkan konsentrasi yang menunjukkan penghambatan 100% terhadap bakteri Xcc untuk sirih 2.5%, cengkih 5%, dan kitosan 0.5%. Konsentrasi tersebut kemudian diturunkan menjadi lima konsentrasi dengan interval konsentrasi yang lebih rendah.
Konsentrasi yang diuji pada ekstrak sirih adalah 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, dan 0.5%.
Konsentrasi cengkih 5%, 4%, 3%, 2%, dan 1%. Konsentrasi kitosan yang diuji adalah 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, dan 0.1%. Media yang digunakan sebagai kontrol adalah media yang dicampur dengan pelarut tanpa ekstrak tumbuhan dan kitosan.
Tabung diisi 1 ml suspensi bakteri Xcc dengan kepadatan koloni 108 cfu/ml (OD: 0.15). Media diinkubasi dalam shaker pada suhu ruang selama 24 jam.
Pengamatan penghambatan ekstrak tumbuhan dan kitosan terhadap bakteri dilakukan dengan metode pengenceran berseri dan dicawankan pada media NA.
Jumlah koloni yang tumbuh pada media NA dihitung setelah diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam.
Konsentrasi ekstrak tumbuhan dan kitosan yang menunjukkan penghambatan 100% terhadap bakteri digunakan lebih lanjut dalam pengujian perlakuan benih. Percobaan dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap dengan 3 ulangan.
Perlakuan Benih Kubis Menggunakan Ekstrak Tumbuhan dan Kitosan
Pengujian perlakuan benih kubis dilakukan dengan menggunakan benih yang diinfeksi secara buatan. Benih kubis hibrida kultivar Grand 22 disterilisasi permukaan menggunakan natrium hipoklorit 0.5% selama 3 menit untuk menghilangkan patogen permukaan menggunakan akuades steril. Selanjutnya benih dibilas 3 kali untuk menghilangkan sisa natrium hipoklorit. Benih direndam selama 1 jam dengan suspensi bakteri (1:1) (w/v). Suspensi bakteri dengan kepadatan 108 cfu/ml (OD: 0.15) berasal dari biakan bakteri Xcc berumur 48 jam.
Benih dikeringanginkan selama 24 jam sampai mendekati tingkat kekeringan semula. Benih kemudian disimpan pada suhu ruang selama 1 minggu hingga saat penggunaan untuk penelitian lebih lanjut (Sumarti 2009).
Perlakuan dilakukan dengan perendaman benih yang telah diinokulasi buatan pada ekstrak sirih 2%, cengkih 3%, dan kitosan 0.5%. Pengujian dilakukan dengan membandingkan lima kisaran waktu perendaman benih yaitu 10, 20, 30, 40, dan 50 menit. Dua gram benih yang telah diinokulasi buatan direndam pada larutan ekstrak sebanyak 4 ml. Selanjutnya benih ditiriskan dan dikeringanginkan pada laminar air flow selama 3 jam. Benih disimpan selama 3 hari pada suhu ruang untuk memastikan bahwa perlakuan tidak memacu perkecambahan benih. Kontrol yang digunakan adalah benih yang telah diinokulasi buatan tanpa perlakuan perendaman. Percobaan dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap dengan 3 ulangan. Pengamatan yang dilakukan adalah pengaruh waktu perendaman terhadap kepadatan inokulum, tingkat infeksi dan viabilitas benih.
Pengaruh Waktu Perendaman Ekstrak Tumbuhan dan Kitosan terhadap Kepadatan Inokulum X. campestris pv. campestris pada Benih
Penghitungan kepadatan koloni dilakukan dengan pencucian benih. Satu gram benih dari setiap perlakuan dan kontrol dicuci menggunakan 10 ml bufer saline (0.85% NaCl) dengan cara dikocok menggunakan shaker selama 4 jam.
Hasil pencucian diencerkan secara berseri 100-107. Sebanyak 100µl dari setiap pengenceran disebar pada media NA, dan diinkubasi pada suhu ruang selama 48
jam. Pengamatan dilakukan dengan menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada media NA.
Pengaruh Waktu Perendaman Ekstrak Tumbuhan dan Kitosan terhadap Tingkat Infeksi X. campestris pv. campestris pada Benih
Pengamatan tingkat serangan bakteri dilakukan dengan menanam 25 benih dari setiap perlakuan dan kontrol pada media NA. Pengamatan dilakukan setelah 5 hari inkubasi. Benih yang masih terinfeksi akan menunjukkan gejala layu, kotiledon menghitam, dan tumbuhnya bakteri berwarna kuning pada media NA.
Pengaruh Waktu Perendaman Ekstrak Tumbuhan dan Kitosan terhadap Viabilitas Benih
Viabilitas benih setelah perlakuan dievaluasi dengan menguji tingkat perkecambahan benih dibandingkan dengan kontrol (tanpa perlakuan). Sebanyak 100 butir dari setiap perlakuan dengan ekstrak tumbuhan dan kitosan ditanam pada nampan yang dialasi tissue lembab. Nampan ditutup menggunakan plastik wrap dan diinkubasi selama tujuh hari. Pengamatan dilakukan dengan menghitung persentase perkecambahan benih dari masing-masing perlakuan.
Pengolahan Data
Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis menggunakan analisis ragam (Anova) dan apabila ada perbedaan pengaruh, dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil pada taraf nyata 5% (Gomes & Gomes 1995). Analisis data dilakukan menggunakan program Minitab 16.
