VALIDASI & VERIFIKASI METODE UJI
Sesuai dengan ISO/IEC 17025
Laboratorium Pengujian dan Kalibrasi
UU No 19 Tahun 2002 Tentang Hak Cipta Fungsi dan Sifat hak Cipta Pasal 2
1. Hak Cipta merupakan hak eksklusif bagi pencipta atau pemegang Hak Cipta untuk mengumumkan atau memperbanyak ciptaannya, yang timbul secara otomatis setelah suatu ciptaan dilahirkan tanpa mengurangi pembatasan menurut peraturan perundang-undangan yang berlaku.
Hak Terkait Pasal 49
1. Pelaku memiliki hak eksklusif untuk memberikan izin atau melarang pihak lain yang tanpa persetujuannya membuat, memperbanyak, atau menyiarkan rekaman suara dan/atau gambar pertunjukannya.
Sanksi Pelanggaran Pasal 72
1. Barangsiapa dengan sengaja dan tanpa hak melakukan perbuatan sebagaimana dimaksud dalam pasal 2 ayat (1) atau pasal 49 ayat (2) dipidana dengan pidana penjara masing-masing paling singkat 1 (satu) bulan dan/atau denda paling sedikit Rp 1.000.000,00 (satu juta rupiah), atau pidana penjara paling lama 7 (tujuh) tahun dan/atau denda paling banyak Rp 5.000.000.000,00 (lima miliar rupiah).
2. Barangsiapa dengan sengaja menyiarkan, memamerkan, mengedarkan, atau menjual kepada umum suatu ciptaan atau barang hasil pelanggaran Hak Cipta sebagaimana dimaksud dalam ayat (1), dipidana dengan pidana penjara paling lama 5 (lima) tahun dan/atau denda paling banyak Rp 500.000.000,00 (lima ratus juta rupiah)
VALIDASI & VERIFIKASI METODE UJI
Sesuai dengan ISO/IEC 17025
Laboratorium Pengujian dan Kalibrasi
Katalog Dalam Terbitan (KDT) RIYANTO
Validasi & Verifikasi Metode Uji: Sesuai dengan ISO/IEC 17025 Laboratorium Pengujian dan Kalibrasi /oleh Riyanto.--Ed.1, Cet. 1-- Yogyakarta: Deepublish, Juni 2014.
xiv, 139 hlm.; 23 cm ISBN 978-Nomor ISBN
1. Laboratorium Kimia I. Judul 542.1
Desain cover : Unggul Pebri Hastanto Penata letak : Cinthia Morris Sartono
Gg. Elang 6, No 3, Drono, Sardonoharjo, Ngaglik, Sleman Jl.Kaliurang Km.9,3 – Yogyakarta 55581
Telp/Faks: (0274) 4533427 Hotline: 0838-2316-8088 Website: www.deepublish.co.id
e-mail: [email protected]
PENERBIT DEEPUBLISH (Grup Penerbitan CV BUDI UTAMA)
Anggota IKAPI (076/DIY/2012) Isi diluar tanggungjawab percetakan Hak cipta dilindungi undang-undang Dilarang keras menerjemahkan, memfotokopi, atau
memperbanyak sebagian atau seluruh isi buku ini tanpa izin tertulis dari Penerbit.
Alhamdulillah segala puji bagi Allah SWT yang telah memberikan rahmat-Nya sehingga Buku Validasi dan Verifikasi Metode Uji dapat terselesaikan. Validasi metode uji merupakan persyaratan yang wajib dilakukan oleh Laboratorium Pengujian dan Kalibrasi sesuai ISO 17025. Fokus buku ini yaitu membahas parameter Validasi dan Verifikasi metode uji yang terdiri dari Repeatability dan Reproducibility, Akurasi (ketepatan, accuracy), Perolehan kembali (recovery), Limit deteksi dan Limit kuantitasi, Ketidakpastian (uncertainty), Daerah linier pengukuran dan daerah kerja, Robustness terhadap pengaruh eksternal dan Konfirmasi identitas, selektifitas, spesifisitas.
Buku ini dimaksudkan untuk membekali mahasiswa dan tenaga laboratorium untuk mempermudah dalam melakukan validasi metode uji. Beberapa materi yang disampaikan dilengkapi dengan contoh-contoh hasil penelitian.
Penulis sangat mengharap kepada semua pihak untuk dapat memberikan masukan yang konstruktif demi kesempurnaan buku ini. Semoga buku ini dapat bermanfaat dan membantu dalam meningkatkan keahlian analisis kimia dan kualitas Laboratorium Pengujian dan Kalibrasi sesuai ISO 17025.
Yogyakarta, Juni 2014
Penulis
KATA PENGANTAR ... v
DAFTAR ISI ... vii
DAFTAR GAMBAR ... ix
DAFTAR TABEL ... xi
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Quality Assurance (QA) dan Quality Control (CQ) ... 1
1.2 Landasan Validasi Metode Uji ... 5
BAB II VALIDASI DAN VERIFIKASI ... 9
2.1. Perbedaan Validasi dan Verifikasi Metode Uji ... 9
2.2. Parameter validasi dan verifikasi metode uji ... 12
2.3. Pentingnya validasi metode ... 17
BAB III PRESISI DAN AKURASI ... 21
3.1 Pendahuluan ... 21
3.2 Presisi ... 23
3.3 Coefficient Variance Horwitz (CV Horwitz) ... 36
3.4 (Akurasi) Accuracy ... 39
BAB IV LINEARITAS DAN DAERAH KERJA ... 53
4.1 Linearitas dan Daerah Kerja ... 53
4.2 Kurva Standar Adisi ... 61
BAB V LIMIT DETEKSI (LOD) DAN LIMIT KUANTISASI (LOQ) ... 65
5.1 Pengertian LOD dan LOQ ... 65
5.2 Penentuan LOD dan LOQ ... 71
BAB VI KETAHANAN DAN KETANGGUHAN METODE
UJI ... 79
6.1. Ketangguhan (ruggedness) dan Kekuatan (Robustness) Metode Uji ...79
6.2. Penentuan Ketangguhan (ruggedness) dan Kekuatan (Robustness) ...81
BAB VII ESTIMASI KETIDAKPASTIAN PENGUKURAN ... 85
7.1 Estimasi Ketidakpastian Pengukuran ...85
7.2 Kesalahan dan Ketidakpastian ...88
7.3 Perhitungan ketidakpastian diperluas (expanded uncertainty) ...95
7.4 Penentuan Estimasi Ketidakpastian Pengukuran ...98
7.5 Estimasiketidakpastian dari berat molekul ...130
7.6 Penentuan Estimasi Ketidakpastian dari Kurva Kalibrasi ...133
DAFTAR PUSTAKA ... 137
Gambar 2.1. Parameter dalam validasi metode uji menurut
EUROCHEM ... 19
Gambar 3.1 Perbedaan presisi dan akurasi ... 22
Gambar 3.2 Skema untuk intra-laboratorium (Repeatability) ... 30
Gambar 3.3 Kurva variansi Horwitz hubungan konsentrasi dengan KV (%) ... 37
Gambar 3.4 Kurva reproduksibilitas Horwitz ... 37
Gambar 3.5 SRM 1950 Metabolit di Human Plasma ... 47
Gambar 3.6 SRM 2907 trace terrorist explosive simultans ... 48
Gambar 3.7 Contoh CRM untuk analisis lingkungan ... 49
Gambar 3.8 Contoh sertifikat CRM Aluminium produksi dari Sigma Aldrich ... 50
Gambar 3.9 Contoh sertifikat berbagai jenis CRM ... 51
Gambar 4.1 Perbandingan nilai R2 dengan data hasil pengukuran ... 54
Gambar 4.2 Kurva kalibrasi larutan standar Cu ... 58
Gambar 4.3 Kurva kalibrasi larutan standar Ni ... 59
Gambar 4.4 Kurva kalibrasi larutan standar Cr (VI) dengan spektrofotometer UV-Vis (Ahmed et al. 2011) ... 60
Gambar 4.5 Teknik pelaksanaan metode kurva adisi standar ... 61
Gambar 4.6 Kurva adisi standar ... 62
Gambar 4.7 Kurva adisi standar penentuan Fe dengan GFAAS ... 63
Gambar 5.1 Posisi LOD, LOQ dan rata-rata signal background ... 68
Gambar 5.2 Penentuan LOD dengan noise... 69
Gambar 5.3 Kurva kalibrasi vitamin C dengan voltammetri ... 72
Gambar 5.4 Kurva kalibrasi larutan standar fenol dengan
spektrofotometer UV-Vis...74
Gambar 7.1 Kurva distribusi normal ...91
Gambar 7.2 Kurva distribusi rectanguler ...92
Gambar 7.3 Kurva distribusi berbentuk U ...93
Gambar 7.4 Kurva mengikuti distribusi trianguler ...94
Gambar 7.5 Gabungan persamaan dan jenis distribusi ...95
Gambar 7.6 Jenis-jenis sumber ketidakpastian dan cara konversinya untuk mendapatkan ketidakpastian baku (μ) ...96
Gambar 7.7 Diagram tulang ikan penentuan konsentrasi Cd ...99
Gambar 7.8 Perbandingan penyumbang ketidakpastian ...102
Gambar 7.9 Distribusi rectangular ...103
Gambar 7.10 Distribusi trianguler ...104
Gambar 7.11 Jenis-jenis distribusi (A) bentuk distribusi uniform (B) bentuk distribusi rectanguler dan (C) distribusi trianguler...105
Gambar 7.12 Diagram tulang ikan penentuan konsentrasi nikel (Ni) ...107
Gambar 7.13 Diagram tulang ikan analisis Cr-T pada air limbah dengan FAAS ...121
Gambar 7.14 Kurva kalibrasi larutan standar Cu ...122
Gambar 7.15 Prosedur kerja penentuan nitrat ...125
Gambar 7.16 Diagram tulang ikan penentuan konsentrasi nitrat ...126
Gambar 7.17 Kurva kalibrasi penentuan nitrat ...127
Gambar 7.18 Diagram kostribusi masing-masing ketidakpastian ...129
Gambar 7.19 Kurva kalibrasi untuk penentuan ketidakpastian ...135
Tabel 3.1 Penentuan kadar Fe dalam AMDK dengan
spektrofotometer UV-Vis ... 24
Tabel 3.2 Penentuan kadar Au dalam batuan dengan AAS. ... 26
Tabel 3.3 Penentuan COD dalam air limbah ... 27
Tabel 3.4 Penentuan Cr dalam air limbah dengan AAS ... 27
Tabel 3.5 Presisi suatu metode uji ... 29
Tabel 3.6 Jenis-jenis presisi dan teknik pelaksanaannya ... 30
Tabel 3.7 Tingkat presisi berdasarkan konsentrasi analit ... 34
Tabel 3.8 Data hasil uji presisi pada sampel natrium hidroksida ... 34
Tabel 3.9 Hubungan Konsentrasi dengan RSD ... 36
Tabel 3.10 Data larutan standar Cu dan Pb dengan AAS ... 38
Tabel 3.11 Hasil uji presisi Penentuan Amonium dan Nitrat ... 38
Tabel 3.12 Nilai persen recovery berdasarkan nilai konsentrasi sampel ... 42
Tabel 3.13 Data hasil uji akurasi pada sampel natrium hidroksida ... 44
Tabel 3.14 SRM tanah dan kandungan elemen di sertifikat dan hasil analisis ... 47
Tabel 4.1 Data hasil pengukuran larutan standar Cu dengan AAS ... 57
Tabel 4.2 Data larutan standar Fe dengan GFAAS ... 62
Tabel 5.1 Data larutan standar vitamin C ... 71
Tabel 5.2 Data perhitungan LOD dengan kurva kalibrasi ... 72
Tabel 5.3 Data larutan standar fenol dengan spektrofotometer UV-Vis ... 73
Tabel 5.4 Data larutan blanko fenol dengan
spektrofotometer UV-Vis ...74
Tabel 5.5 Data hasil uji LOD pada sampel natrium hidroksida ...75
Tabel 5.6 Data hasil uji LOQ pada sampel natrium hidroksida ...76
Tabel 5.7 Data Hasil Uji LOQ pada Sampel Natrium hidroksida ...77
Tabel 6.1 Hasil studi Ketangguhan (ruggedness) ...82
Tabel 6.2 Hasil studi Kekuatan (Robustness) ...82
Tabel 6.3 Robustness pada metode uji dengan HPLC ...83
Tabel 6.4 Contoh hasil analisis pengujian ketegaran dengan HPLC konsentrasi standar 100%...84
Tabel 7.1 Nilai dan ketidakpastian ...101
Tabel 7.2 Sumber ketidakpastian kurva kalibrasi ...116
Tabel 7.3 Sumber ketidakpastian kadar Ni dalam NaOH 32% ...117
Tabel 7.4 Hasil nilai ketidakpastian kadar Nikel pada natrium hidroksida ...119
Tabel 7.5 Data hasil pengukuran larutan standar ...121
Tabel 7.6 Data penentuan ketidakpastian kurva kalibrasi Cu ...122
Tabel 7.7 Daftar sumber ketidakpastian ...124
Tabel 7.8 Data larutan standar nitrat ...127
Tabel 7.9 Data perhitungan LOD dan LOQ ...127
Tabel 7.10 Perhitungan repeatabilitas dan recovery ...128
Tabel 7.11 Penentuan relatif standar ketidakpastian ...128
Tabel 7.12 Daftar berat atom dan ketidakpastian terkait ...130
Tabel 7.13 Penentuan ketidakpastian standar masing masing elemen KMnO4 ...131
Tabel 7.14 Penentuan ketidakpastian standar masing masing elemen C8H5O4K ...132
Tabel 7.15 Perhitungan penentuan slope dan intersep ... 133 Tabel 7.16 Perhitungan penentuan ketidakpastian kurva
kalibrasi ... 134 Tabel 7.17 Perhitungan penentuan ketidakpastian kurva
kalibrasi logam Cu dengan AAS ... 134
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Quality Assurance (QA) dan Quality Control (CQ) Menurut EUROCHEM yang dimaksud dengan jaminan kualitas (QA) adalah tindakan yang direncanakan sistematis diperlukan untuk memberikan keyakinan yang memadai bahwa suatu produk atau jasa akan memenuhi persyaratan untuk kualitas yang diberikan. Quality control (QC) adalah kegiatan yang sehari-hari dilakukan yaitu operasional teknik dan kegiatan yang digunakan untuk memenuhi persyaratan kualitas. Validasi adalah proses yang menunjukkan bahwa prosedur laboratorium dapat diandalkan, dan direproduksi oleh personil dalam melakukan tes di laboratorium.
Quality assurance atau jaminan mutu merupakan bagian dari manajemen mutu yang difokuskan pada pemberian keyakinan bahwa persyaratan mutu akan dipenuhi. Secara teknis jaminan mutu pengujian dapat diartikan sebagai keseluruhan kegiatan yang sistematik dan terencana yang diterapkan dalam pengujian, sehingga memberikan keyakinan yang memadai bahwa data yang dihasilkan memenuhi persyaratan mutu sehingga dapat diterima oleh pengguna. Pengendalian mutu adalah suatu tahapan dalam prosedur yang dilakukan untuk mengevaluasi suatu aspek teknis pengujian.
Quality control (pengendalian mutu) adalah kegiatan untuk memantau, mengevaluasi dan menindaklanjuti agar persyaratan mutu yang ditetapkan tercapai (product, process, service, inspection, testing, sampling, measurement dan calibration). Sedangkan Quality assurance (penjaminan mutu) adalah semua tindakan terencana, sistematis dan didemonstrasikan untuk meyakinkan pelanggan bahwa persyaratan yang ditetapkan "akan dijamin" tercapai. Salah satu elemen dari QA adalah QC.
Elemen yang lain yaitu: planning, organization for quality, established procedure, supplier selection, corrective action, document control, training, audit dan management review.
Definisi menurut ISO 9000:2000 (QMS- Fundamentals and Vocabulary), adalah:
* Quality control (lihat section 3.2.10): part of quality management focused on fulfilling quality requirements
* Quality assurance (lihat section 3.2.11): part of quality management focused on providing confidence that quality requirements will be fulfilled.
Jadi kalau diterjemahkan, secara singkat QC terfokus pada pemenuhan persyaratan mutu (produk/service) sedangkan QA terfokus pada pemberian jaminan/keyakinan bahwa persyaratan mutu akan dapat dipenuhi. Atau dengan kata lain, QA membuat sistem pemastian mutu sedangkan QC memastikan output dari sistem itu memang benar-benar memenuhi persyaratan mutu.
Kegiatan-kegiatan inspeksi dan uji (in-coming, in-process, outgoing) akan masuk kategori QC, sedangkan hal-hal seperti perencanaan mutu, sertifikasi ISO, audit sistem manajemen, masuk kategori QA. Beberapa perusahaan, saat
ini tidak lagi membedakan antara QA dan QC di dalam operasional quality management-nya. Cukup disebut departemen Quality, di dalamnya ada kegiatan merancang jaminan bahwa persyaratan mutu akan dipenuhi dan sekaligus bagaimana memenuhi persyaratan mutu tersebut.
QA (Quality Assurance) tugasnya memahami spesifikasi customer dan standard atau spesifikasi yang berhubungan dengan produk, kemudian membuat/ menentukan cara inspectionnya (berupa prosedur) dan mendokumentasi hasil inspectionnya (manufacturing data report) QC (Quality Control): tugasnya melakukan inspection berda- sarkan procedure yang dibuat dan disyahkan oleh QA.
Kesimpulannya QA lebih banyak paper work, umumnya memiliki skill inspection yang baik dan skill menulis procedure dan familiar dengan engineering & industrial standards, Sedangkan QC lebih banyak melakukan inspection pada process manufacturing dan membuat laporannya.
Dalam perusahaan besar, biasanya QA dan QC dipisah dan memeliki pimpinan masing-masing. Sedang dalam perusahaan menengah/kecil biasanya digabung (perso-nilnya kebanyakan dwi fungsi). Beberapa jenis ISO yaitu:
• ISO 9001: Quality Management System
• ISO 14000 : Environmental Management System
• ISO 22000: Food Safety Management System
• ISO 27001: Information Security Management System
• SNI-ISO/IEC 17025:2008: (International Organization for Standardization/International Electrothecnical Commission) untuk Laboratorium Pengujian Dan Kalibrasi
• SNI- ISO 15189:2012: Medical laboratories.
Persyaratan mutu dan kompetensi laboratorium medik.
• OHSAS 18001: (Occupation Health and Safety Assessment Series)
• ISO 9241: Ergonomics of Human-Computer Interaction
• ISO 13485:2003: For Quality Management System Related to the Design, Production Assembly, Installation and Servicing of Psychological Assessment Tools
Faktor-faktor yang menentukan kebenaran dan kehandalan pengujian dan kalibrasi adalah faktor manusia, kondisi akomodasi dan lingkungan, metode pengujian, metode kalibrasi dan validasi metode, peralatan, ketertelusuran pengukuran, pengambilan contoh, pena- nganan barang yang diuji dan dikalibrasi. Konstribusi masing-masing faktor terhadap ketidakpastian pengukuran total berbeda pada jenis dari pengujian dan kalibrasi yang satu dan yang lainnya. Laboratorium harus memper- hitungkan faktor-faktor tersebut dalam mengembangkan metode dan prosedur pengujian dan prosedur kalibrasi, dalam pelatihan dan kualifiasi personil dan dalam pemi- lihan dan kalibrasi peralatan yang digunakan.
Laboratorium harus menggunakan metode dan prosedur yang sesuai untuk semua pengujian dan atau kalibrasi di dalam lingkupnya. Hal tersebut mencakup pengambilan sampel, penanganan transportasi, penyim- panan, dan penyiapan barang untuk diuji dan atau kalibrasi dan bila sesuai perkiraan dari ketidakpastian pengukuran serta teknik statistik untuk menganalisis data pengujian dan atau kalibrasi. Laboratorium harus memiliki instruksi
penggunaan dan pengoperasian semua peralatan yang relevan, dan penanganan serta penyiapan barang yang diuji dan atau dikalibrasi, atau kedua-duanya bila ketiadaan instruksi yang dimaksud dapat merusak hasil pengujian dan atau kalibrasi. Semua instruksi, standar, panduan dan data acuan yang relevan dengan pekerjaan laboratorium harus dijaga tetap mutakhir dan harus selalu tersedia bagi personil. Penyimpangan dari metode pengujian dan kalibrasi boleh terjadi hanya jika penyimpanan tersebut dibuktikan secara teknik telah dibenarkan, disahkan dan diterima oleh pelanggan.
1.2 Landasan Validasi Metode Uji
Pesyaratan yang harus dipenuhi untuk menjadi laboratorium Pengujian dan Kalibrasi berdasarkan Standard Internasional ISO/IEC 17025, Edisi kedua Tahun 2005, Persyaratan Umum Kompetensi Laboratorium Pengujian dan Laboratorium Kalibrasi yaitu persyaratan manajemen yang terdiri dari:
1. Organisasi
2. Sistem Manajemen 3. Pengendalian Dokumen
4. Kaji Ulang Permintaan Tender dan Kontrak 5. Subkontrak Pengujian
6. Pembelian Jasa dan Perbekalan 7. Pelayanan Pelanggan
8. Pengaduan
9. Pengendalian Pekerjaan Yand Tidak Sesuai 10. Peningkatan
11. Tindakan Perbaikan
12. Tindakan Pencegahan 13. Pengendalian Rekaman 14. Audit Internal
15. Kaji Ulang Manajemen
Selain itu laboratorium harus memenuhi 10 persyaratan teknis yang terdiri dari:
1. Umum 2. Personil
3. Kondisi Akomodasi dan Lingkungan
4. Metode Pengujian, Metode kalibrasi dan Validasi Metode
5. Peralatan
6. Ketertelusuran Pengukuran 7. Pengambilan Sampel
8. Penanganan Barang Uji
9. Jaminan Mutu Hasil Pengujian 10. Pelaporan Hasil
Berdasarkan persyaratan di atas, maka laboratorium pengujian dan kalibrasi harus melakukan validasi metode uji. Penggunaan metode yang tepat untuk pengu- jian/kalibrasi, termasuk pengambilan sampel, transportasi, penyimpanan, estimasi ketidakpastian. Ketersediaan ins- truksi kerja, standar, manual dan data di tempat kerja.
Penggunaan metode/prosedur yang telah diterbitkan dan metode laboratorium yang dikembangkan sendiri harus sudah divalidasi. Laboratorium harus menginformasikan kepada customer mengenai penggunaan metode yang tidak sesuai. Jika laboratorium akan melakukan pengem- bangan metode uji maka harus ada rencana pengem-
bangan metode pengujian/kalibrasi, penugasan kegiatan tersebut pada analis yang kompeten dan pembaharuan rencana hasil pengembangan. Penggunaan metode non standar harus tunduk pada perjanjian dengan customer metode tersebut harus sudah divalidasi sebelum digunakan.
Validasi adalah konfirmasi melalui bukti-bukti pemeriksaan dan telah sesuai dengan tujuan pengujian.
Validasi harus dilakukan terhadap metode non-standar dan metode yang dikembangkan laboratorium. Rentang ukur dan akurasi dapat diperoleh dari hasil validasi metode yang sesuai dengan kebutuhan customer. Validasi adalah kon- firmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi. Laboratorium harus memvalidasi:
1. Metode tidak baku
2. Metode yang didesain/dikembangkan laboratorium 3. Metode baku yang digunakan diluar lingkup yang
dimaksud
4. Metode baku yang dimodifikasi
5. Metode baku untuk menegaskan dan mengkonfirmasi bahwa metode itu sesuai untuk penggunaan yang dimaksudkan.
Estimasi ketidakpastian pengukuran merupakan prosedur untuk estimasi ketidakpastian pengukuran dalam pengujian, sedapat mungkin menggunakan metode statistik yang sesuai. Pertimbangan untuk semua kom- ponen estimasi ketidakpastian. Beberapa sebab metode uji perlu divalidasi yaitu:
1. Apabila metode tersebut baru dikembangkan untuk suatu permasalahan yang khusus
2. Apabila metode yang selama ini sudah rutin, direvisi untuk suatu pengembangan atau diperluas untuk memecahkan suatu permasalahan analisa yang baru 3. Apabila hasil QC menunjukkan bahwa metode yang
sudah rutin tersebut berubah terhadap waktu (QC charts)
4. Apabila metode rutin digunakan di laboratorium yang berbeda, atau dilakukan oleh analis yang berbeda atau dilakukan dengan peralatan yang berbeda
Parameter-parameter yang harus dilakukan untuk memvalidasi metode uji yaitu:
1. Repeatability dan Reproducibility 2. Akurasi (ketepatan, accuracy) 3. Perolehan kembali (recovery) 4. Limit deteksi dan limit kuantitasi 5. Ketidakpastian (uncertainty)
6. Daerah linier pengukuran dan daerah kerja 7. Robustness terhadap pengaruh eksternal 8. Konfirmasi identitas, selektifitas, spesifisitas 9. Sensitivitas silang gangguan dari matrik sampel
BAB II VALIDASI DAN VERIFIKASI
2.1 Perbedaan Validasi dan Verifikasi Metode Uji
Metode yang digunakan di laboratorium kimia analitik harus dievaluasi dan diuji untuk memastikan bahwa metode tersebut mampu menghasilkan data yang valid dan sesuai dengan tujuan, maka metode tersebut harus divalidasi. Setiap laboratorium direkomendasikan bahwa metode yang baik harus divalidasi ulang atau memverifikasi untuk memastikan bahwa metode tersebut bekerja benar dalam lingkungan lokal. Verifikasi melibatkan lebih sedikit parameter percobaan dibandingkan validasi.
Setiap metode baru yang diperkenalkan ke laboratorium juga harus didokumentasikan dan semua analis yang akan menggunakannya harus mendapatkan pelatihan yang memadai dan menunjukkan kompetensi mereka dalam metode sebelum memulai kerja kasus yang sebenarnya. Metode komersial juga perlu revalidation, atau setidaknya verifikasi. Prosedur yang direkomendasikan produsen 'harus diikuti sedekat mungkin. Jika perubahan yang signifikan dibuat, validasi penuh sangat diperlukan.
Jika metode dimodifikasi atau diterapkan ke situasi baru (misalnya, berbeda sampel matriks), revalidation atau
verifikasi akan diperlukan tergantung pada sejauh mana modifikasi dan sifat situasi baru.
Revalidation akan diperlukan, misalnya, ketika sebuah metode yang dirancang untuk bekerja untuk urine diterapkan untuk darah; verifikasi akan diperlukan bila kolom kromatografi dari sifat yang berbeda atau dimensi yang digunakan. Tidak ada tindakan yang diperlukan di mana modifikasi hanya kecil, misalnya ketika kolom kromatografi diubah untuk lain dari jenis yang sama.
Validasi atau verifikasi metode merupakan seperangkat standar eksperimental tes yang menghasilkan data yang berkaitan dengan akurasi, presisi dan lain-lain. Proses yang dilakukan harus ditulis sebagai prosedur operasi standar (SOP). Sekali metode telah divalidasi atau diverifikasi, mereka harus secara resmi disetujui untuk penggunaan rutin di laboratorium oleh orang yang bertanggung jawab, misalnya manajer laboratorium.
Dokumen yang ditetapkan dalam panduan mutu mencatat rincian metode dan data yang evaluasi yaitu:
1. Judul metode 2. Analit
3. Contoh matriks
4. Dasar ilmiah dari metode
5. Data hasil validasi (akurasi, presisi, selektivitas, rentang, LOD dan lain-lain)
6. Nama dan posisi orang otorisasi 7. Tanggal
Perhatikan bahwa SOP untuk memvalidasi atau memverifikasi metode, sama dengan semua SOP di manual mutu laboratorium, juga harus disahkan oleh manajer
laboratorium. Setelah metode tersebut ditetapkan, maka sangat penting bahwa semua SOP diikuti dengan tepat. Jika variasi yang dibuat, variasi harus didokumentasikan. Setiap variasi yang signifikan mengharuskan metode divalidasi ulang untuk kondisi baru. Untuk semua SOP versi terakhir yang disetujui harus digunakan. Dokumentasi laboratorium untuk sistem mutu yang kompleks di alam, dan karena itu laboratorium harus memiliki prosedur pengendalian dokumen yang tepat seperti yang direkomendasikan dalam
"Pedoman Implementasi Sistem Manajemen Mutu Pengujian Laboratorium". Sistem yang diusulkan dalam literatur untuk proses validasi dapat bervariasi dalam beberapa pedoman ini karena validasi selalu terikat dengan aplikasi.
Metode kuantitatif untuk pengujian validasi mengandung beberapa parameter yang ditentukan yaitu:
1. Kekhususan / selektivitas 2. Batas deteksi (LOD)
3. Presisi (di bawah dalam pengulangan laboratorium dan / atau dalam laboratorium kondisi
reproducibility)
4. Linearitas dan jangkauan kerja
5. Akurasi (bias) (di bawah dalam pengulangan laboratorium dan di dalam laboratorium kondisi reproducibility)
6. Recovery
7. Ketidakpastian pengukuran 8. Stabilitas
Parameter tambahan yang ditentukan tetapi tidak begitu penting yaitu batas bawah kuantisasi (LLOQ),
kekasaran dan ketahanan. Untuk kualitatif dan metode kuantitatif yang akan digunakan oleh lebih dari satu laboratorium, setiap laboratorium harus memverifikasi metode, dan presisi antar-laboratorium dan akurasi harus ditentukan.
Metode kuantitatif untuk pengujian harus dilakukan verifikasi dengan parameter yang akan ditentukan adalah:
1. Kekhususan/selektivitas dan LOD jika matriks sampel berbeda dari yang digunakan dalam pengembangan metode.
2. Akurasi (bias) (dalam kondisi pengulangan atau reproducibility)
3. Presisi (dalam kondisi pengulangan atau reproducibility)
2.2 Parameter validasi dan verifikasi metode uji
Parameter ini berkaitan dengan sejauh mana zat lain mengganggu identifikasi atau analisis kuantifikasi analit.
Ukuran dari kemampuan metode untuk mengiden- tifikasi/mengukur analit. Kehadiran zat lain, baik endogen maupun eksogen, dalam sampel matriks di bawah kondisi yang dinyatakan metode ini. Kekhususan ditentukan dengan menambahkan bahan-bahan yang mungkin dihadapi dalam sampel. Misalnya, tes spesifisitas metode imunologi untuk spesimen biologi dapat berpotensi zat bereaksi silang; uji spesifisitas tes tempat bisa termasuk berpotensi mengganggu zat yang dapat menghambat atau menutupi warna reaksi; metode kromatografi untuk penentuan konsentrasi obat penyalah- gunaan dalam sampel klinis harus bebas dari gangguan dari
yang diharapkan bersamaan diberikan obat terapi.
Spesifisitas adalah tergantung konsentrasi dan harus ditentukan pada akhir rendah dari kisaran kalibrasi. Validasi harus memenuhi tujuan metode dan memastikan bahwa efek dari kotoran, zat bereaksi silang, yang mungkin ada dalam matriks diketahui.
Batas deteksi (LOD). LOD adalah konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi dan diidentifikasi dengan mengingat tingkat kepastian. LOD juga didefinisikan sebagai konsentrasi terendah yang dapat dibedakan dari kebisingan latar belakang dengan tingkat kepercayaan tertentu. Ada beberapa metode untuk menentukan LOD, yang semuanya tergantung pada analisis spesimen dan pemeriksaan sinyal untuk rasio kebisingan blanko.
Minimum persyaratan untuk sinyal terhadap kebisingan dapat digunakan untuk menentukan LOD. LOD merupakan parameter yang dapat dipengaruhi oleh perubahan kecil dalam sistem analitis (misalnya suhu, kemurnian reagen, efek matriks, kondisi berperan). Oleh karena itu, penting bahwa parameter ini selalu dilakukan oleh laboratorium dalam memvalidasi metode.
Presisi adalah ukuran kedekatan hasil analisis diperoleh dari serangkaian pengukuran ulangan dari ukuran yang sama. Hal ini mencerminkan kesalahan acak yang terjadi dalam sebuah metode. Dua set diterima secara umum kondisi di mana presisi diukur adalah kondisi berulang dan direproduksi. Kondisi pengulangan terjadi ketika analis yang sama analisis sampel pada yang sama, hari dan instrumen yang sama (misalnya kromatografi gas) atau bahan (uji misalnya tempat reagen) di laboratorium
yang sama. Setiap variasi dari kondisi ini (misalnya berbeda analis, hari yang berbeda, instrumen yang berbeda, laboratorium yang berbeda) merupakan reproduksibilitas.
Presisi biasanya diukur sebagai koefisien variasi atau deviasi standar relatif dari hasil analisis yang diperoleh dari independen disiapkan standar kontrol kualitas. Presisi tergantung konsentrasi dan harus diukur pada konsentrasi yang berbeda dalam rentang kerja, biasanya di bawah, pertengahan dan bagian atas. Presisi diterima pada konsentrasi yang lebih rendah adalah 20%.
Linearitas dan jangkauan kerja, metode yang digambarkan sebagai linear ketika ada berbanding lurus hubungan antara respon metode dan konsentrasi analit dalam matriks selama rentang konsentrasi analit (jang- kauan kerja). Jangkauan kerja yang telah ditetapkan oleh tujuan metode dan mungkin mencerminkan hanya bagian dari rentang linier penuh. Sebuah koefisien korelasi yang tinggi (R2) dari 0,99 sering digunakan sebagai kriteria linearitas. Namun, ini tidak cukup untuk membuktikan bahwa hubungan linear ada, dan metode dengan koefisien determinasi kurang dari 0.99 mungkin masih cocok untuk tujuan. Parameter ini tidak berlaku untuk metode kualitatif kecuali ada ambang batas konsentrasi untuk pelaporan hasil.
Akurasi adalah ukuran perbedaan antara harapan hasil tes dan nilai referensi yang diterima karena metode sistematis dan kesalahan laboratorium. Akurasi biasanya dinyatakan sebagai persentase. Akurasi dan presisi bersama- sama menentukan Total kesalahan analisis. Akurasi ditentukan dengan menggunakan bahan Bahan Referensi
Bersertifikat (CRMS), metode referensi, studi kolaboratif atau dengan perbandingan dengan metode lain. Dalam prakteknya, CRMS jarang tersedia. Sebagai alternatif, referensi standar dari sebuah organisasi otoritatif seperti UNODC (United Nations Office on Drugs and Crime), Drug Enforcement Administration (DEA) atau penyedia komersial terkemuka dapat digunakan. Hal ini umum untuk memperkirakan akurasi dengan menganalisis sampel yang berbeda konsentrasi (rendah, sedang, tinggi) yang meliputi daerah kerja. Konsentrasi standar-standar ini harus berbeda dari yang digunakan untuk mempersiapkan kurva kalibrasi dan mereka berasal dari larutan yang berbeda.
Recovery dari suatu analit adalah respon detektor yang diperoleh dari jumlah analit ditambahkan dan diekstrak dari matriks, dibandingkan dengan respon detektor untuk konsentrasi benar murni otentik dari standar. Hal ini juga dapat dipahami sebagai persentase obat, metabolit, atau Standar internal awalnya dalam spesimen yang mencapai akhir prosedur. Dalam kasus spesimen biologi, blanko dari matriks biologis setelah akhir ekstrak telah diperoleh dapat dibubuhi dengan standar dengan konsentrasi sebenarnya dari murni otentik standar dan kemudian dianalisis. Pemulihan eksperimen harus dilakukan dengan mem-bandingkan hasil analisis untuk sampel diekstraksi pada tiga konsentrasi (Biasanya untuk mengendalikan sampel yang digunakan untuk mengevaluasi presisi dan akurasi). Recovery tidak harus 100%, namun tingkat recovery (analit dan standar internal) harus konsisten (untuk semua kon-sentrasi yang diuji).
Ketidakpastian pengukuran. Pengujian laboratorium harus memiliki dan menerapkan prosedur untuk memperkirakan ketidakpastian pengukuran. Mengingat ketidakpastian memberikan jaminan bahwa hasil dan kesimpulan dari metode dan skema analitis yang cocok untuk tujuan. Menurut metrologi ketidakpastian didefinisikan sebagai parameter yang terkait dengan hasil pengukuran yang mencirikan dispersi dari nilai-nilai yang cukup dapat dikaitkan dengan besaran ukuran. Dalam istilah yang lebih praktis, ketidakpastian dapat didefinisikan sebagai probabilitas atau tingkat keyakinan. Setiap pengukuran yang kita buat akan memiliki beberapa ketidakpastian yang berhubungan dengan dan interval ketidakpastian yang kami kutip akan menjadi kisaran dalam mana nilai sebenarnya terletak pada tingkat kepercayaan tertentu. Biasanya kita menggunakan tingkat kepercayaan 95% interval. Pemahaman ketidakpastian adalah dasar interpretasi dan pelaporan hasil. Laboratorium harus setidaknya mencoba untuk mengidentifikasi semua komponen ketidakpastian dan membuat suatu estimasi yang wajar, dan harus memastikan bahwa bentuk pelaporan hasilnya tidak memberikan kesan yang salah dari ketidakpastian.
Ketidakpastian pengukuran terdiri dari, secara umum, banyak komponen. Ketidakpastian dihitung dengan memperkirakan kesalahan yang terkait dengan berbagai tahap analisis, misalnya efek pra-analitis, homogenisasi, berat, pipetting, injeksi, ekstraksi, derivatisasi, pemulihan, kurva kalibrasi. Validasi data, ketepatan dan presisi, kondisi pengulangan/reproducibility sudah memperhitungkan
banyak faktor dan harus digunakan. Perkiraan ketidakpastian secara keseluruhan pada tingkat kepercayaan 95% dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
Dimana u1, u2, u3 dan seterusnya adalah ketidakpastian komponen individu. Ketidakpastian komponen individu yang kurang dari 20% dari komponen tertinggi ketidakpastian berdampak kecil terhadap keti- dakpastian secara keseluruhan dan dapat dihilangkan dari perhitungan.
Stabilitas. Validasi metode harus menunjukkan sejauh mana analit yang stabil selama prosedur analisis secara keseluruhan, termasuk penyimpanan sebelum dan sesudah analisis. Secara umum, ini dilakukan dengan memban-dingkan standar baru disiapkan diketahui konsentrasi dengan standar yang sama dipertahankan untuk periode waktu yang berbeda dan disimpan dalam berbagai kondisi.
2.3 Pentingnya validasi metode
Validasi metode sangat diperlukan karena beberapa alasan yaitu validasi metode merupakan elemen penting dari kontrol kualitas, validasi membantu memberikan jaminan bahwa pengukuran akan dapat diandalkan. Dalam beberapa bidang, validasi metode adalah persyaratan peraturan.
Menurut ISO 17025 validasi adalah konfirmasi dengan pemeriksaan dan penyediaan bukti obyektif bahwa
persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus yang terpenuhi. Menurut Quality Assurance Standards for Forensic DNA Testing Laboratories, validasi adalah proses dimana prosedur dievaluasi untuk menentukan kemanjuran dan keandalan untuk analisis. Untuk menunjukkan bahwa metode cocok untuk tujuan yang dimaksudkan .
Menurut EUROCHEM validasi adalah konfirmasi melalui pemeriksaan dan penyediaan bukti objektif bahwa persyaratan tertentu untuk penggunaan yang dimaksudkan tertentu terpenuhi. Metode validasi adalah proses pem- bentukan karakteristik kinerja dan keterbatasan metode dan identifikasi pengaruh yang mungkin mengubah karak- teristik ini dan sampai sejauh mana sekarang juga proses verifikasi bahwa suatu metode cocok untuk tujuan, yaitu, untuk digunakan untuk memecahkan analitis tertentu masalah. Beberapa tujuan validasi metode uji adalah:
1. Untuk menerima sampel individu sebagai anggota dari populasi yang diteliti.
2. Untuk mengakui sampel pada proses pengukuran 3. Untuk meminimalkan pertanyaan tentang keaslian
sampel
4. Untuk memberikan kesempatan bagi resampling bila diperlukan
Organisasi yang mengharuskan validasi metode uji adalah International Standards Organization (ISO) yaitu ISO 17025, AOAC International (Association of Official Analytical Chemists), ASTM International (American Society for Testing and Materials), ILAC (International Laboratory Accreditation Cooperation). Beberapa parameter yang harus
ditentukan dalam validasi metode uji menurut EUROCHEM seperti pada Gambar 2.1.
Gambar 2.1. Parameter dalam validasi metode uji menurut EUROCHEM
Metode uji divalidasi jika, metode baru yang akan digunakan dalam pekerjaan rutin, setiap kali kondisi berubah maka metode harus divalidasi, misalnya, instru- men yang berbeda dengan karakteristik yang berbeda, setiap kali metode berubah dan perubahannya di luar lingkup asli dari metode.
BAB III PRESISI DAN AKURASI
3.1 Pendahuluan
Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya. Validasi biasanya diperuntuk-kan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan. Sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku (misal dari AOAC, ASTM, dan lainnya), namun metode tersebut baru pertama kali akan digunakan di laboratorium tertentu, biasanya tidak perlu dilakukan validasi, namun hanya verifikasi. Tahapan verifikasi mirip dengan validasi hanya saja parameter yang dilakukan tidak selengkap validasi.
Verifikasi metode uji adalah konfirmasi ulang dengan cara menguji suatu metode dengan melengkapi bukti-bukti yang obyektif, apakah metode tersebut memenuhi persyaratan yang ditetapkan dan sesuai dengan tujuan.Verifikasi sebuah metode uji bermaksud untuk membuktikan bahwa laboratorium yang bersangkutan mampu melakukan pengujian dengan metode tersebut dengan hasil yang valid. Verifikasi bertujuan untuk membuktikan bahwa laboratorium memiliki data kinerja.
Parameter yang diuji dalam verifikasi metode penentuan
kadar nikel dalam NaOH dengan spektrofotometer UV-Vis antara lain presisi, akurasi, linieritas, LOD dan LOQ dan estimasi ketidakpastian.
Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya. Validasi biasanya diperuntukkan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan. Sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku (misal dari AOAC, ASTM, dan lainnya), namun metode tersebut baru pertama kali akan digunakan di laboratorium tertentu, biasanya tidak perlu dilakukan validasi, namun hanya verifikasi. Tahapan verifikasi mirip dengan validasi hanya saja parameter yang dilakukan tidak selengkap validasi. Perbedaan antara presisi dan akurasi dapat dilihat pada Gambar 3.1.
Gambar 3.1 Perbedaan presisi dan akurasi
Low Precision Low Accuracy
Low Precision High Accuracy
High Precision
Low Accuracy H igh Precision
H igh A ccuracy
3.2 Presisi
Presisi atau precision adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel- sampel yang diambil dari campuran yang homogen.
Presisi diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Precision dapat dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau reproducibility (ketertiruan).
Repeatability adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Repeatability dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal.
Reproducibility adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama.
Reproducibility dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan analis yang berbeda.
Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV) 2%
atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah
sampel, dan kondisi laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis.
Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat seiring dengan menurunnya konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar 2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2%.
Percobaan keseksamaan dilakukan terhadap paling sedikit enam replika sampel yang diambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen. Sebaiknya keseksamaan ditentukan terhadap sampel sebenarnya yaitu berupa campuran dengan bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) untuk melihat pengaruh matriks pembawa terhadap keseksamaan ini. Demikian juga harus disiapkan sampel untuk menganalisis pengaruh pengotor dan hasil degradasi terhadap keseksamaan ini. Contoh presisi penentuan konsentrasi Fe dengan spektrofotometer UV-Vis dintunjukkan pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1 Penentuan kadar Fe dalam AMDK dengan spektrofotometer UV-Vis
No. Kadar Fe dalam AMDK (mg/L)
1 0,54
2 0,55
3 0,57
4 0,52
No. Kadar Fe dalam AMDK (mg/L)
5 0,54
6 0,55
7 0,57
8 0,54
9 0,54
10 0,56
Jumlah 5,48
Rata-rata 0,548
SD 0,015491933
RSD(%) 2,826995143
Karena RSD (%) lebih dari 2%, maka metode uji tersebut mempunyai presisi yang tidak baik. Presisi pengukuran kuantitatif dapat ditentukan dengan menganalisis contoh berulang-ulang (minimal 6 x pengulangan), dan menghitung nilai simpangan baku (SD) dan dari nilai simpangan baku tersebut dapat dihitung nilai koefisien variasi dengan rumus:
Dari nilai KV yang diperoleh dibandingkan dengan KV Horwitz yaitu suatu kurva berbentuk terompet yang menghubungkan reproducibilitas (presisi yang inyatakan sebagai % KV) dengan konsentrasi analit. Presisi metode analisis diekspresikan sebagai fungsi dari konsentrasi melalui persamaan:
KV (%) = 2 1 - 0,5 log C
Dimana C merupakan fraksi konsentrasi dan dinyatakan sebagai pangkat dari 10.
Presisi suatu metode akan memenuhi syarat apabila KV yang diperoleh dari percobaan lebih kecil dari KV Horwitz.
Tabel 3.2 Penentuan kadar Au dalam batuan dengan AAS.
No. Kadar Au dalam Batuan (mg/kg)
1 5.55
2 5.55
3 5.57
4 5.52
5 5.54
6 5.55
7 5.57
8 5.54
9 5.54
10 5.56
Jumlah 55.49
Rata-rata 5.549
SD 0.015238839
RSD(%) 0.274623162
Karena dari hasil tersebut diperoleh RSD 0,275%, maka metode uji tersebut mempunyai presisi yang baik.
Tabel 3.3 Penentuan COD dalam air limbah No. COD dalam air limbah (mg/L)
1 51.55
2 52.55
3 51.57
4 52.52
5 53.54
6 51.55
7 51.57
8 51.54
9 51.54
10 51.56
Jumlah 519.49
Rata-rata 51.949
SD 0.692025208
RSD(%) 1.332124215
Karena dari hasil tersebut diperoleh RSD 1,332%, maka metode uji tersebut mempunyai presisi yang baik.
Tabel 3.4 Penentuan Cr dalam air limbah dengan AAS No. Cr dalam air limbah (mg/L)
1 0.0515
2 0.0825
3 0.0615
4 0.0525
5 0.0535
6 0.0515
7 0.0715
8 0.0519
No. Cr dalam air limbah (mg/L)
9 0.0516
10 0.0516
Jumlah 0.5796
Rata-rata 0.05796
SD 0.01079539
RSD(%) 18.62558655
Karena dari hasil tersebut diperoleh RSD 18,625%, maka metode uji tersebut mempunyai presisi yang tidak baik.
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandungbahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan.
Selektivitas metode ditentukan dengan mem- bandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi.
Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang
mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti kromatografi, analisis kelarutan fase, dan Differential Scanning Calorimetry.
Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivitas. Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan melalui perhitungan daya resolusinya (Rs).
Precision menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen.
Presisi menunjukkan tingkat keakuratan di antara individual hasil uji dalam suatu pengujian.
Tabel 3.5 Presisi suatu metode uji
Variabel Replicability Repeatability Reproducibility Sub-
sampel
S/B S/B B
Sampel S S S
Analisis S - B
Alat S 1B B
Hari S 2S S/B
Lab. S S B
Ket : S = sama; B = beda
Tabel 3.6 Jenis-jenis presisi dan teknik pelaksanaannya Keterangan Repeatability Intra-laboratory
repeatability
Reproducibility
Sampel Sama Sama Sama
Operator Sama Beda Beda
Instrument Sama Sama atau Beda Beda Periode
waktu
Pendek Panjang Panjang
Kalibrasi Sama Beda Beda
Laboratorium Sama Sama Beda
Gambar 3.2 Skema untuk intra-laboratorium (Repeatability) Presicion diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Precision dapat dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau reproducibility (ketertiruan). Repeatability adalah kesek- samaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu
yang pendek. Repeatability dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal.
Reproducibility adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama.
Reproducibility dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan analis yang berbeda.
Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV) 2%
atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis.
Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat seiring dengan menurunnya konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar 2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2%.
Percobaan keseksamaan dilakukan terhadap paling sedikit enam replika sampel yang diambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen. Sebaiknya keseksamaan ditentukan terhadap sampel sebenarnya yaitu berupa campuran dengan bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) untuk melihat pengaruh matriks pembawa terhadap keseksamaan ini. Demikian juga harus disiapkan sampel untuk menganalisis pengaruh pengotor dan hasil degradasi terhadap keseksamaan ini.
Presisi adalah ukuran yang menunjukkan kedekatan antara nilai hasil pengukuran dari sampel yang homogen pada kondisi normal (sampel yang sama diuji secara berurutan dengan menggunakan alat yang sama). Uji presisi berarti kedekatan antar tiap hasil uji pada suatu pengujian yang sama untuk melihat sebaran diantara nilai benar. Presisi dipengaruhi oleh kesalahan acak (random error), antara lain ketidakstabilan instrumen, variasi suhu atau pereaksi, keragaman teknik dan operator yang berbeda.
Presisi dapat dinyatakan dengan berbagai cara antara lain dengan simpangan baku, simpangan rata-rata atau kisaran yang merupakan selisih hasil pengukuran yang terbesar dan terkecil (Hidayat, 1989). Suatu nilai ketelitian dinyatakan dalam Relative Standar Deviation (% RSD). Besarnya RSD menyatakan tingkat ketelitian analis, semakin kecil % RSD yang dihasilkan maka semakin tinggi tingkat ketelitiannya.
Menurut Bievre (1998), presisi dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability), ketertiruan (reproducibility) dan presisi antara (intermediate precision). Parameter presisi tersebut antara lain :
1. Keterulangan (Repeatability)
Keterulangan adalah ketelitian yang diperoleh dari hasil pengulangan dengan menggunakan metode, operator, peralatan, laboratorium, dan dalam interval pemeriksaan waktu yang singkat. Pemeriksaan keterulangan bertujuan untuk mengetahui konsistensi analit, tingkat kesulitan metode dan kesesuaian metode.
2. Presisi Antara (Intermediate Precision)
Presisi antara merupakan bagian dari presisi yang dilakukan dengan cara mengulang pemeriksaan terhadap contoh uji dengan alat, waktu, analis yang berbeda, namun dalam laboratorium yang sama.
3. Ketertiruan(Reproducibility)
Ketertiruan yaitu ketelitian yang dihitung dari hasil penetapan ulangan dengan menggunakan metode yang sama, namun dilakukan oleh analis, peralatan, laboratorium dan waktu yang berbeda.
Presisi dari metode uji ditentukan dengan rumus : ̅ x
Keterangan
SD : Standar Deviasi ̅ : Nilai Rata-rata n : Ulangan
RSD : Relatif Standar Deviation
Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan nilai %RSD ≤ 2%. Kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang dianalisis, jumlah sampel dan kondisi laboratorium. Nilai RSD atau koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit yang
dianalisis (Harmita, 2004). Menurut american pre-veterinary medical assosiation (APVMA) (2004) tingkat presisi yang sebaiknya dipenuhi berdasarkan konsentrasi analit yang dianalisis dapat dilihat dalam Tabel 3.7.
Tabel 3.7 Tingkat presisi berdasarkan konsentrasi analit Jumlah komponen terukur dalam sampel
(x) Tingkat presisi (y)
x ≥ 10,00 % y ≤ 2 %
1,00 % ≤ x ≤ 10,00 % y ≤ 2 % 0,10 % ≤ x ≤ 1,00 % y ≤ 10 %
x ≤ 0,10 % y ≤ 20 %
Uji presisi dilakukan untuk mengetahui kedekatan atau kesesuaian antara hasil uji yang satu dengan yang lainnya pada serangkaian pengujian. Presisi hasil pengukuran digambarkan dalam bentuk persentase Relative Standar Deviation (%RSD). Uji presisi yang dilakukan termasuk jenis uji keterulangan (repeatability). Hasil uji presisi untuk sampel natrium hidroksidadengan berbagai konsentrasi yaitu, 32%; 48%; 98% dapat dilihat dalam Tabel 3.8.
Tabel 3.8 Data hasil uji presisi pada sampel natrium hidroksida
Pengulangan Penimbangan (g) Kadar Ni (ppm) 32% 48% 98% 32% 48% 98%
1 10,03 5,00 1,08 0,0144 1,2786 1,0814 2 10,01 5,07 1,06 0,0368 0,8251 1,1724 3 10,01 5,00 1,05 0,0211 1,2062 0,9170 4 10,02 5,01 1,07 0,0192 0,7621 0,9303 5 10,06 5,06 1,05 0,0109 0,9794 0,9170
Pengulangan Penimbangan (g) Kadar Ni (ppm) 32% 48% 98% 32% 48% 98%
6 10,01 5,00 1,04 0,0267 0,8346 0,8102 7 10,04 5,01 1,05 0,0276 0,7621 1,0936
Jumlah 0,1568 6,6479 6,9216
Rata-rata 0,0224 0,9497 0,9888
SD 0,0088 0,2137 0,1283
% RSD 0,39 % 0,22% 0,13%
Syarat keberterimaan untuk nilai % RSD < 2%
Berdasarkan data pada Tabel 3.8 diperoleh nilai relative standar deviasi (%RSD) sebesar 0,39 % (natrium hidroksida 32%), 0,22% (natrium hidroksida 48%) dan 0,13% (natrium hidroksida 98%). Hasil ini menunjukkan bahwa metode uji yang digunakan pada penentuan kadar nikel dalam sampel natrium hidroksida dengan spektrofotometer UV-Vis memiliki ketelitian yang baik untuk ketiga jenis sampel karena memenuhi syarat nilai %RSD yang diterima. Nilai ketelitian yang diperoleh dapat ditentukan dengan rumus 100% - %RSD. Nilai presisi dapat memberikan informasi bahwa metode ini dapat digunakan sebagai metode tetap pada laboratorium.
Adanya variasi pada hasil presisi untuk tiga sampel tersebut disebabkan kesalahan acak. Kesalahan ini disebabkan karena adanya faktor yang tidak dapat dikendalikan. Kesalahan acak merupakan kesalahan dalam pengukuran karena gangguan dan perbedaan kondisi setiap pengukuran hingga menghasilkan angka yang berbeda.
Faktor kesalahan acak ini sebenarnya dapat dikurangi dengan melakukan banyak pengulangan pengukuran.
3.3 Coefficient Variance Horwitz (CV Horwitz)
Pada tahun 1980 Horwitz, Kamps, dan Boyer menunjukkan bahwa: "pemeriksaan hasil lebih dari 50 penelitian kolaboratif antar laboratorium yang dilakukan oleh AOAC pada berbagai komoditas untuk berbagai analit menunjukkan hubungan antara koefisien rata-rata variasi (CV), dinyatakan sebagai kekuatan 2, dengan konsentrasi rata-rata yang diukur, dinyatakan sebagai pangkat 10, independen dari metode yang menentukan.
RSD% Horwitz = 2(1 – 0.5 log C)
Dimana C, adalah konsentrasi analit dinyatakan sebagai fraksi massa berdimensi (pembilang dan penyebut memiliki satuan yang sama); dan RSDR adalah koefisien variasi CV dalam kondisi reproducibility.
Tabel 3.9 Hubungan Konsentrasi dengan RSD
Konsentrasi Analit RSD
10% 2,8%
1 % 4,0 %
0,1 % 5,7 %
0,01 % 8,0 %
1 ppm 16 %
1 ppb 45 %
0,1 ppb 64 %
Gambar 3.3 Kurva variansi Horwitz hubungan konsentrasi dengan KV (%)
Gambar 3.4 Kurva reproduksibilitas Horwitz
Table 3.10 Data larutan standar Cu dan Pb dengan AAS No. Konsentrasi Cu (ppm) Konsentrasi Pb (ppm)
1 40,8658 1,0024
2 39,9516 0,9123
3 38,9490 1,0575
4 40,4530 0,9812
5 40,6004 1,0437
6 40,6004 1,0437
7 40,6004 1,0437
Rata-rata 40,1640 0,9994
CV Horwitz 9,1774 16,0014
Cara penentuan CV Horwitz CV Horwitz = 21-(0,5 x log C)
CV Horwitz = 21-(0.5 x log 40,164.10-6)
CV Horwitz = 21-(0.5 x (-4,3962)
CV Horwitz = 21-(-2,1981)
CV Horwitz = 23,1981 CV Horwitz = 9,1769
Contoh lain dalam penentuan presisi adalah:
Tabel 3.11 Hasil uji presisi Penentuan Amonium dan Nitrat
No. Konsentrasi rata-rata NH4+ (ppm)
Konsentrasi rata-rata NO3- (ppm)
1 1,860 29,58
2 1,765 29,73
3 1,900 29,12
4 1,855 29,31
5 1,805 29,94
6 1,870 29,16
7 1,870 29,16
Rata-rata 1,843 29,456
SD 0,0489 0,3544
KV (%) (RSD)
2,66 1,20
CV Horwitz 14,59 9,62
Cara penentuan CV Horwitz pada penentuan konsentrasi NH4+:
CV Horwitz = 21-(0,5 x log C)
CV Horwitz = 21-(0.5 x log 1,843.10-6)
CV Horwitz = 21-(0.5 x (-5,7344)
CV Horwitz = 21-(-2,8672)
CV Horwitz = 23,8672 CV Horwitz = 14,5929
Cara penentuan CV Horwitz pada penentuan konsentrasi NO3-:
CV Horwitz = 21-(0,5 x log C)
CV Horwitz = 21-(0.5 x log 29,456.10-6)
CV Horwitz = 21-(0.5 x (-4,5308)
CV Horwitz = 21-(-2,2654)
CV Horwitz = 23,2654 CV Horwitz = 9,62
3.4 (Akurasi) Accuracy
Accuracy adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya.
Accuracy dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Accuracy dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method).
Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam plasebo (semua campuran reagent yang digunakan minus analit), lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar
standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya).
Recovery dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan divalidasi. Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo karena matriksnya tidak diketahui seperti obat-obatan paten, atau karena analitnya berupa suatu senyawa endogen misalnya metabolit sekunder pada kultur kalus, maka dapat dipakai metode adisi.
Dalam metode adisi (penambahan baku), sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa (pure analit/standar) ditambahkan ke dalam sampel, dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan).
Pada metode penambahan baku, pengukuran blanko tidak diperlukan lagi. Metode ini tidak dapat digunakan jika penambahan analit dapat mengganggu pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan menyebabkan kekurangan pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar.
Dalam kedua metode tersebut, recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Biasanya persyaratan untuk recovery adalah tidak boleh lebih dari 5%.
Accuracy menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Accuracy dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Accuracy dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) atau
metode penambahan baku (standard addition method).
Perhitungan perolehan kembali dapat juga ditetapkan dengan rumus sebagai berikut:
% Perolehan kembali (recovery) = – x 100
C1 = konsentrasi dari analit dalam campuran contoh + sejumlah tertentu analit
C2 = konsentrasi dari analit dalam contoh
C3 = konsentrasi dari analit yang ditambahkan kedalam contoh
Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam plasebo (semua campuran reagent yang digunakan minus analit), lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya).
Recovery dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan divalidasi. Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo karena matriksnya tidak diketahui seperti obat-obatan paten, atau karena analitnya berupa suatu senyawa endogen misalnya metabolit sekunder pada kultur kalus, maka dapat dipakai metode adisi.
Dalam metode adisi (penambahan baku), sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa (pure analit/standar) ditambahkan ke dalam sampel, dicampur
