BAB II
TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Kofein
2.1.1 Sifat Fisikokimia Rumus struktur
Rumus Molekul : C8H10N4O2
Berat Molekul : 194,19
Pemerian : Serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya menggumpal, tidak berbau, rasa pahit, larutan bersifat netral terhadap kertas lakmus.
Kelarutan : Agak sukar larut dalam air dan etanol, mudah larut dalam kloroform, sukar larut dalam eter (Ditjen POM, 1995).
2.1.2 Efek Farmakologi
Kadar kofein yang tinggi dapat menyebabkan takikardia, bahkan pada individu yang sensitif mungkin menyebabkan aritmia, ini disebabkan terjadinya stimulasi langsung jaringan miokardial yang mengakibatkan meningkatnya laju dan kekuatan kontraksi (Foye, 1995 dan Sunaryo, 1995)
Penggunaanya sebagai zat penyegar bila digunakan terlalu banyak, dapat bekerja adiktif.Bila dihentikan sekaligus dapat mengakibatkan sakit kepala sebagai gejala penarikan (Tjay dan Rahardja, 2002).
2.2 Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan dimana analit-analit dalam sampel terdistribusi antara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa bahan padat dalam bentuk molekul kecil atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding kolom.Fase gerak dapat berupa gas atau cairan.Jika gas digunakan sebagai fase gerak, maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas.Dalam kromatografi cair dan juga kromatografi lapis tipis, fase gerak yang digunakan selalu cair (Rohman, 2009). 2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
mudah menguap (non-volatil); pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit, dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap suatu masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
Menurut Mulja dan Suharman (1995), untuk tercapainya maksud dan tujuan analisis dengan KCKT maka diperlukan penatalaksanaan yang betul-betul sudah dipersiapkan dan diperhitungkan, antara lain :
- Dipilih pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur yang sesuai untuk komponen yang dipisahkan
- Berkaitan dengan pemilihan pelarut pengembang (solvent) maka kolom yang dipakai juga harus diperhatikan.
- Detektor yang memadai
- Pengetahuan dasar KCKT yang baik serta pengalaman dam keterampilan kerja yang baik.
Keuntungan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi antara lain : - dapat dilaksanakan pada suhu kamar
- pelarut pengembang yang dapat dipakai berulangkali, demikian juga dengan kolomnya.
- detektror KCKT dapat divariasi
Maksud dan tujuan analisis dengan KCKT hanya ada dua hal yaitu didapatnya pemisahan yang baik dalam waktu proses yang relatif singkat.
2.4 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solute-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel (Gandjar san Rohman, 2007).
2.5 Jenis-jenis Kromatografi
Menurut Gandjar dan Rohman (2007) jenis-jenis kromatografi yaitu : 2.5.1 Kromatografi Padatan Cair (LSC)
2.5.2 Kromatografi Partisi
Partisi merupakan proses adsorpsi yang analog dengan proses ekstraksi pelarut. Fase diam cair diikatkan pada padatan lapis tipis yang lemban (inert).teknik ini tergantung pada partisi zar padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai fase diam dan yang lainnya sebagai fase gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), fase diamnya dibuat dengan cara yang sama dengan pendukung pada kromatografi gas (GC). fase diam (polar atau non polar) dilapisi suatu pendukung inert dan dipak dalam suatu kolom. kemudian fase gerak dilewatkan melalui kolom. bentuk kromatogram partisi ini disebut kromatografi cair-cair (LLC).
Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah dikembangakan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert. bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC= Bonded Phase Chromatography). BPC dapat dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling popular dari KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut “fase normal” Bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan “fase terbalik” bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam.
2.5.3 Kromatografi penukar ion
2.5.4 Kromatografi eksklusi
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasigel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.fase diam yang digunakan dapat berupa silica atau polimar yang bersifat porus sehingga solute dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. molekul solute yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. hal ini disebabkan solute dengan BM yang jauh lebih besar, tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara fase diam. dengan demikian, dalam pemisahan dengan ekslusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solute dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
2.5.5 Kromatografi Pasangan Ion (IPC)
2.6 Komponen Kromatografi cair kinerja tinggi
Menurut Rohman (2009) Sistem peralatan KCKT pada dasarnya terdiri atas : 2.6.1 Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
2.6.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut, yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.
2.6.3 Tempat penyuntikan sampel
2.6.4 Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
2.6.5 Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu : detektor universal(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif.
2.6.6 Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir kedetektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram (Johnson dan Stevenson, 1991).
Guna Kromatogram : 1. Kualitatif
Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatogram yang sama dapat digunakan untuk identifikasi
2. Kuantitatif
2.7 Analisa Kualitatif dan Kuantitatif 1. Analisa Kualitatif
Ada tiga pendekatan untuk analisis kualitatif yaitu :
a. Perbandingan antara data retensi solute yang tidak diketahui dengan data retensi baku yang sesuai (senyawa yang diketahui) pada kondisi yang sama. Waktu retensi atau volume retensi senyawa baku dan senyawa yang tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi dengan cara berurutan dalam kondisi alat yang stabil dengan perbedaan waktu pengoperasian antara keduanya sekecil mungkin.
b. Dengan cara spiking
Untuk Kromatografi yang melibatkan kolom, spiking dilakukan dengan menambah sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan diselidiki dengan senyawa baku pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan dengan cara : pertama, dilakukan proses kromatografi sampel yang tidak di spiking. kedua, sampel yang telah di spiking dengan senyawa baku dilakukan proses kromatografi. Jika pada puncak tertentu yang diduga mengandung senyawa yang diselidiki terjadi peningkatan tinggi puncak/luas puncak setelah di spiking dibandingkan dengan tinggi puncak/luas puncak yang tidak dilakukan spiking maka dapat diidentifikasi bahwa sampel mengandung senyawa yang kita selidiki.
c. Menggabungkan alat kromatografi dengan spektrometer massa
spektro yang ada di database computer atau diinterupsi sendiri. Cara ini dapat dilakukan untuk solute yang belum ada baku murninya
(Rohman, 2009). 2. Analisa Kuantitatif
Untuk menjamin kondisi yang digunakan dalam analisis kuantitatif stabil dan reprodusible, baik pada penyiapan sampel atau proses kromatografi, berikut beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam analisa kuantitatif :
a. Analit (solut) harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari komponen-komponen lain dalam kromatogram
b. Baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus tersedia c. Prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan
Sementara Kromatografi yang melibatkan kolom, kuantifikasi dapat dilakukan dengan cara : Luas puncak atau dengan tinggi puncak. Tinggi puncak atau luas puncak berbanding langsung dengan banyaknya solute yang dikromatografi, jika dilakukan pada kisaran detektor yang linear. 2.8 Validasi Metode
akurasi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifisitas, linieritas dan rentang, kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan (Robutness).
Presisi merupakan ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel homogen yang sama.
Akurasi merupakan kedekatan antara nilai terukur (nilai rata-rata hasil analisis) dengan nilai yang diterima sebagai nilai sebenarnya.
Batas deteksi (limit of detection atau LOD) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat terdeteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi.
Batas kuantitasi (limit of quantitation atau LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.
Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik.
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan.
Kekasaran (Ruggedness) merupakan tingkat reprodusibilitas hasil yang diperoleh di bawah kondisi yang bermacam-macam.
Ketahanan (Robutness) merupakan kapasitas metode analisis untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil
