BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Parasitologi Veteriner dan Laboratorium Biomolekuler Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga, Laboratorium Biologi Fakultas Sains dan Teknologi untuk tera protein serta Institute Tropical Disease (ITD) Universitas Airlangga untuk pembacaan hasil indirect-ELISA. Penelitian ini dilaksanakan pada pada bulan Maret 2013 – Januari 2014.
3.2 Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan adalah true experimental dengan tujuan untuk mengetahui reaksi antara antigen R. tetragona dan antibodi R. tetragona yang dibandingkan dengan reaksi silang antara antigen R. tetragona dan antibodi A. galli menggunakan uji ELISA. Rancangan penelitian yang digunakan yaitu rancangan post test only control groups design (Zainudin, 2000 yang dikutip oleh Kusnoto, 2008).
3.3 Variabel Penelitian
Dalam penelitian ini terdapat tiga variabel yaitu variabel bebas (independent), variabel terikat (dependent) dan variabel kendali. Variabel bebas (independent) yaitu homogenat R. tetragona atau A. galli. Variabel terikat (dependent) adalah antigenisitas R. tetragona yang diekspresikan dalam bentuk
nilai optical density (OD), antibodi R. tetragona dan A. galli. Variabel kendali yaitu umur mencit, jenis kelamin mencit, kandang dan pakan.
3.4 Materi Penelitian 3.4.1 Hewan percobaan
Dalam penelitian ini hewan yang digunakan yaitu : 1) sebagai sumber cacing adalah usus halus ayam (dari beberapa pasar tradisional di Surabaya); 2) sebagai penghasil antibodi poliklonal adalah mencit perlakuan berjumlah 16 ekor dan mencit kontrol berjumlah 8 ekor.
3.4.2 Bahan penelitian
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah antigen WWE cacing R. tetragona dan A. galli serta serum R. tetragona dan A. galli. Bahan kimia yang dibutuhkan yaitu : phospate buffer saline (PBS, Merck), chloroform (Merck), destilate water (Merck), alkohol 70%, 85%, 95% (Merck), alkohol gliserin (Merck), Hung’s I, Hung’s II (Merck), larutan bibit charmine (Merck), alkohol asam, alkohol basa dan HCl (Gibco cat no. 1640-430-1800).
Bahan untuk indirect-ELISA antara lain : coating buffer (bufer karbonat, pH 9,6), PBS pH 7,4, PBS-Tween (PBS-T) yaitu PBS yang mengandung 0,05% Tween-20, washing buffer, blocking buffer, substrat p-NPP, substrat buffer, konjugat anti-mouse berlabel enzim alkalin fosfatase, serum kontrol positif yang didapat dari hewan yang telah diimunisasi dengan antigen R. tetragona dan A. galli, serum kontrol negatif yang dipanen dari hewan normal tanpa imunisasi dan larutan stopper (NaOH 4 N).
3.4.3 Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Petridis, alat bedah (scalpel, pinset, gunting bedah), object glass, cover glass, microtube 1,5 ml, mikroskop, nampan plastik, spuit disposible, pot obat kecil, hand glove, masker, tissu. Alat untuk ELISA yaitu microplate ELISA, pipet mono 50-200 µl, pipet mono 100-1000 µl, pipet mikro 0,5-10 µl, pipet berbagai ukuran, Erlenmeyer, gelas ukur, becker glass, magnetic stirer, magnetic bar, botol media, inkubator, pH meter, timbangan, yellow tip, blue tip, white tip dan ELISA reader.
3.5 Metode Penelitian
3.5.1 Koleksi cacing dewasa R. tetragona dan A. galli
Tahap pertama yang dilakukan yaitu membedah usus halus ayam menggunakan scalpel. Cacing dewasa berbentuk seperti pita dan panjang yang diduga Raillietina sp., sedangkan A. galli berbentuk panjang dan gilik diambil dan dimasukkan larutan NaCl fisiologis pada cawan Petri. Selanjutnya dilakukan proses identifikasi untuk memastikan spesies cacing tersebut. Usus halus dibeli dari beberapa pasar tradisional di Surabaya.
3.5.2 Identifikasi cacing R. tetragona dan A. galli
Cacing dewasa A. galli selanjutnya dimasukkan dalam pot obat yang berisi formalin 0,5%. Sedangkan cacing dewasa R. tetragona yang disimpan di NaCl fisiologis diambil satu persatu untuk dipisahkan skolek dan badan kemudian diidentifikasi bagian skolek. Skolek yang sudah dipisahkan di letakkan di object glass dan ditutup dengan cover glass, kemudian direndam dalam larutan alkohol
gliserin kurang lebih selama 24 jam. Selanjutnya dimasukkan dalam alkohol 70% selama 5 menit, lalu dimasukkan ke dalam larutan charmine selama kurang lebih 8 jam.
Skolek cacing yang telah direndam larutan charmine dilepas dari objek glass dan dimasukkan ke dalam alkohol asam selama 2 menit. Selanjutnya dimasukkan dalam alkohol basa selama 20 menit, kemudian alkohol 70%, 85%, dan 95% masing-masing selama 5 menit serta dilakukan proses mounting ke dalam larutan Hung’s I selama 20 menit. Skolek diambil dari larutan Hung’s dan diletakkan di atas objek glass untuk ditetesi larutan Hung’s II secukupnya kemudian ditutup dengan cover glass. Cacing diidentifikasi dengan menggunakan mikroskop perbesaran 100x. Pengamatan menggunakan mikroskop terlihat bentuk sucker R. tetragona berbentuk elips dengan dinding sucker tipis yang merupakan ciri khusus cacing pita tersebut. Identifikasi cacing hanya dilakukan sebagai pembelajaran agar dapat membedakan spesies cacing Raillietina spp.
3.5.3 Preparasi homogenat WWE R. tetragona dan A. galli
Cara pembuatan homogenat yaitu masing-masing 50 cacing dewasa R. tetragona dan A. galli digerus menggunakan mortar secara terpisah kemudian
masing-masing dimasukkan dalam tube 10 ml dan disuspensikan dengan 5 ml PBS, disonikasi frekuensi 35 kHz selama 3 x 60 detik dengan jarak istirahat 60 detik. Suspensi dihancurkan lagi dengan 10% detergen garam natrium N-lauroilsarkosin, selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 5.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang didapat dimasukkan ke dalam tube dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 25 menit kemudian pelet dan
supernatan dipisahkan. Supernatan yang diperoleh dilakukan peneraan protein untuk diketahui kadar protein selanjutnya disuntikkan ke mencit (Kusnoto dkk., 2011).
3.5.4 Pembuatan antibodi poliklonal R. tetragona dan A. galli
Pembuatan antibodi poliklonal dengan cara homogenat WWE R. tetragona dan A. galli masing-masing diinjeksikan pada 8 ekor mencit tiap perlakuan. Pada imunisasi awal sebanyak 200 µg/ekor homogenat yang ditambah Complete
Freund’s Adjuvant (CFA) dengan perbandingan yang sama. Homogenat R. tetragona dengan CFA sebanyak 300 µl : 300 µl dan homogenat A. galli
dengan CFA sebanyak 590 µl : 590 µl dan ditambah antibiotik penicillin streptomicin yang diberikan secara subcutan. Booster dilakukan 2 kali menggunakan dosis 200 µg/ekor homogenat WWE R. tetragona dan A. galli ditambah Incomplete Freund’s Adjuvant (IFA) dengan perbandingan yang sama. Homogenat R. tetragona dengan IFA sebanyak 300 µl : 300 µl dan homogenat A. galli dengan IFA sebanyak 590 µl : 590 µl dan ditambah antibiotik penicillin streptomicin yang diberikan secara subcutan.
Pengambilan serum darah dilakukan pada dua minggu setelah booster ketiga. Darah diambil melalui ekor mencit yang telah digunting kemudian dimasukkan microtube sebanyak 0,5 ml. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 5-10 menit. Serum yang terpisah diambil dengan mikrotiter dan dimasukkan pada mikrotube lain kemudian dilakukan uji indirect-ELISA (Kusnoto dkk., 2011).
3.5.5 Langkah indirect-ELISA
Coating antigen, microplate ELISA disiapkan kemudian larutan dibuat yang mengandung antigen R. tetragona dengan kadar 5µl/ml dalam pelarut bufer karbonat (coating buffer) sebanyak 10 ml. Larutan dimasukkan ke dalam well masing-masing 100 µl/well. Permukaan microplate ditutup dan diinkubasi pada suhu 4 ˚C selama kurang lebih 18 jam. Masing-masing well dicuci dengan
washing buffer, tiap well sebanyak 200 µl dan dilakukan 3 kali.
Blocking, tiap well diisi dengan 200 µl blocking buffer. Permukaan microplate ditutup, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 ˚Cselama 1 jam.
Masing-masing well dicuci dengan washing buffer sebanyak 200 µl/well sebanyak 3 kali..
Inkubasi serum, larutan dibuat yang mengandung antibodi R. tetragona, A. galli dan serum kontrol (30 µl Antibodi + 2970 µl PBS). Larutan
antibodi standard dimasukkan masing-masing sebanyak 100 µl/well pada kolom 1 – 4 dari well A - B (untuk antibodi R. tetragona) dan well B - C (untuk antibodi A. galli). Kontrol negatif dimasukkan pada well G - H. Sampel serum yang akan diperiksa diencerkan pada pengenceran 1:100 dengan PBS. Masing-masing sampel serum sebanyak 100 µl /well pada kolom 1 sampai 8. Permukaan microplate ditutup selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama 1 jam. Well
dicuci dengan washing buffer sebanyak 3 kali masing-masing 200 µl /well.
Larutan konjugat yang berlabel enzim alkalin fosfatase dan telah diencerkan dengan PBS pengenceran 1/1500 dimasukkan pada semua well sebanyak 100 µl/well. Permukaan microplate ditutup kemudian diinkubasi pada
37 ˚Cselama 1 jam. Masing-masing well dicuci dengan buffer washing sebanyak 3
kali masing-masing 200 µl /well.
Buffer substrat yang ditambahkan substrat p-NPP dimasukkan pada semua well sebanyak 100 µl /well dan diinkubasi di ruang gelap pada suhu kamar selama 15 – 30 menit. Larutan penghenti (larutan stopper) 4N NaOH ditambahkan pada semua well masing-masing 50 µl /well. Selanjutnya microplate dibaca pada ELISA reader dengan panjang gelombang 405 nm dan dihitung nilai OD (Suwarno dkk., 2010).
3.6 Analisis Data
Data diperoleh berupa optical density (OD) dianalisis menggunakan uji F (one way ANOVA) yang dilanjutkan dengan Duncan’s multiple range test 1%.
Gambar 3.1 Diagram alir penelitian.
Koleksi dan identifikasi cacing R. tetragona
Homogenat A. galli Homogenat R. tetragona
Penggerusan cacing dan sentrifugasi
Koleksi dan identifikasi cacing A. galli
Inisiasi imunisasi ke mencit + CFA
indirect-ELISA optical density (OD) Bedah usus halus ayam
Sentrifugasi 2000 rpm (10 menit) menit
Serum diambil Pengambilan darah mencit
Crude protein (Ag)R. tetragona Crude protein (Ag) A.galli
Ab R. tetragona Ab A. galli
Analisis data
Booster 1 IFA
Booster 2 IFA
Inisiasi imunisasi ke mencit + CFA Sonikasi
