KROMATOGRAFI (TLC, HPLC, GC-MS, DAN LC-MS)
B. HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
118
1. Pelat KLT (plate): Sebaiknya yang sudah jadi dengan fase diam:
merupakan pelat yang stabil dan inert secara kimiawi, di mana lapisan tipis fase diam (stationary pahse) diaplikasikan pada seluruh lapisan permukaannya. Fase diam pada pelat memiliki ketebalan yang seragam dan dalam ukuran partikel yang halus.
2. Ruang TLC (chamber/ tank): Chamber mempertahankan lingkungan yang seragam di dalam untuk pengembangan bintik-bintik yang tepat. Ini juga mencegah penguapan pelarut, dan menjaga proses yang aman dan bebas dari debu.
3. Fase gerak (mobile phase): Terdiri dari campuran pelarut atau pelarut fFase gerak yang digunakan harus bebas partikulat dan memiliki kemurnian tertinggi untuk pengembangan bintik-bintik KLT yang tepat. pelarut yang direkomendasikan secara kimiawi inert dengan sampel, fase diam.
4. Kertas saring: Bagian yang dibasahi dalam fase gerak, untuk ditempatkan di dalam ruang/ chamber, ini membantu peningkatan/kenaikan yang seragam dalam fase gerak.
B. HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
119
Gambar 9.3 Komponen HPLC (analitika.co.id/) Bagian dari HPLC secara umum tersusun atas:
1. Chamber Fase gerak, serta Fase gerak itu sendiri
Wadah fase gerak harus bersih dan lembap (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Pada fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
2. Pompa (pump)
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
120
tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.
3. Tempat Penyuntikan Sampel (Injector)
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Gambar Sample Loop dapat dilihat berikut:
Gambar 9.4 Sample Loop (Ahuja et al. 2005) 4. Kolom (Column)
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solute/analit.
121
Gambar 9.5 Column HPLC (analitika.co.id/)
Terdapat beberapa keuntungan dengan penggunaan Column mikrobor dibandingkan dengan penggunaan yang konvensional yaitu:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal pada sampel klinis.
5. Detektor (Detector)
Detektor yang terdapat pada HPLC terbagi atas 2 jenis utama yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Ada beberapa ciri yang harus dipenuhi pada detektor HPLC secara umum yaitu:
a) Detektor harus memiliki respon terhadap solute yang cepat dan reprodusibel, dan tidak lambat.
b) Sensitifitas detektor harus tinggi, dan tidak lemah, artinya mampu mendeteksi solute pada kadar yang sangat kecil atau konsentrasi yang rendah sekalipun.
c) Stabil dalam proses dan pengopersiannya.
d) Detektor harus memiliki sel volume yang kecil agar dapat meminimalkan pelebaran pita yang terbentuk.
e) Signal yang dihasilkan oleh detektor harus berbanding lurus dengan konsentrasi solute pada kisaran yang luas (dinamis linier).
f) Detektor harus tidak peka/ tidak mudah terganggu akibat perubahan suhu atau karena kecepatan alir dari fase gerak yang terbentuk pada proses.
Prinsip kerja HPLC pada dasarnya yaitu: suatu reaksi atau proses pemisahan analit-analit berdasarkan pada tingkat kepolarannya, alatnya
122
terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan solution tertentu sebagai fase geraknya (mobile phase). Hal yang juga membedakan HPLC dengan jenis kromatografi lain yaitu HPLC menggunkan tekanan tinggi (high- performance) untuk mendorong fase geraknya. Campuran analit akan terpisah sesuai dengan tingkatan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai ke dektetor (waktu retensi/ retention time), hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah (chromatogram) yang terbentuk.
Sebagai alat kromatografi yang canggih, HPLC memiliki beberapa kelebihan dan kekurangan. Beberapa kelebihan dari alat HPLC antara lain: mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi, dapat menghindari adanya risiko terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis, dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi, kolom dapat digunakan kembali, waktu analisa cukup singkat, akurat dan presisi, HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil, dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya/ jumlahnya, dan teknik penggunaan dan operasi HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar. Selain begitu banyaknya kelebihan HPLC, beberapa kelemahan dari alat HPLC juga perlu diperhatikan antara lain: harga sebuah alat HPLC cukup mahal, dan perlu teknisi yang berpengalaman dalam pengoprasiannya, sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor (sehingga perlu maintainance yang ekstra), pada bagian kolom HPLC dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran (residu), jadi harus seringkali dicuci (clearing) dan kemurnian larutan harus dijaga agar proses analisis tetap akurat dan valid.
C. GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY