MIKROSKOP
B. Jenis Mikroskop
Jenis mikroskop berikut ini digunakan untuk pemeriksaan mikroorganisme:
1. Mikroskop Cahaya
56
Sebagai sumber cahaya, mikroskop cahaya menggunakan sinar matahari atau cahaya buatan. Daya resolusi (resolving power) adalah komponen penting dari mikroskop cahaya. Hal ini merupakan kemampuan sistem lensa untuk membedakan dua objek yang ditempatkan berdekatan sebagai entitas yang berbeda dan terpisah. Hal ini bergantung pada panjang gelombang cahaya yang digunakan untuk menerangi objek dan pada bukaan numerik mikroskop setengah dari panjang gelombang yang digunakan (Parija, 2012).
Tipe mikroskop cahaya:
(a) Mikroskop medan terang (bright-field microscopy)
Mikroskop jenis ini merupakan mikroskop yang paling umum digunakan. Pada mikroskop ini bidang pandang sangat terang sehingga organisme dan struktur lainnya berada terlihat berlawanan karena kepadatannya yang berbeda. Mikroskop ini terutama digunakan pada preparat yang telah diwarnai. Pewarnaan diferensial dapat digunakan tergantung pada sifat-sifat struktur dan organisme yang berbeda (WHO, 1999).
Spesimen disinari oleh sumber cahaya di dasar mikroskop dan kemudian diperbesar terlebih dahulu oleh lensa objektif, sebelum diperbesar kembali oleh lensa okuler (Gambar 5.2a).
Perbesaran total yang dicapai adalah perkalian perbesaran kedua lensa (Murphy, 2001). Spesimen biasanya divisualisasikan karena perbedaan kontras antara spesimen itu sendiri dan lingkungan sekitarnya. Oleh sebab itu, pewarnaan merupakan konsep penting dalam mikroskop. Bright-field microscopy akan bekerja cukup baik untuk melihat mikroba yang lebih besar (yaitu protozoa, alga) tanpa warna, namun bakteri yang tidak diwarnai hampir tidak terlihat. Bakteri yang berwarna akan tampak gelap dengan latar belakang terang. Hal inilah yang menjadi alasan dinamakan bright- field microscopy (Gambar 5.3b) (Bruslind, 2020).
57
(a) (b)
Gambar 5.2 (a) Prinsip kerja bright-field microscopy (Sibilia, 1988), (b) Model bright-field microscopy (Bruslind, 2020) b) Mikroskop lapangan gelap (Darkfield microscopy)
Mikroskop ini menggunakan apa yang dikenal sebagai dark-field stop, sebuah piringan buram yang menghalangi cahaya tepat di bawah spesimen sehingga cahaya dapat menjangkaunya dari samping (gambar 5.3a). Hasilnya hanya cahaya yang dipantulkan atau dibiaskan oleh spesimen yang akan dikumpulkan oleh lensa objektif, sehingga menghasilkan sel yang tampak terang dengan latar belakang gelap (Bruslind, 2020). Kondensor khusus digunakan yang menyebabkan cahaya dipantulkan spesimen pada suatu sudut.
Ini digunakan untuk mengamati bakteri seperti treponema (yang menyebabkan sifilis) dan leptospira (yang menyebabkan leptospirosis) (WHO, 1999).
c) Mikroskop fase kontras (Phase-contrast microscopy)
Mikroskop fase kontras memanfaatkan sistem optik tertentu yang mengubah perbedaan fase dalam suatu organisme menjadi perbedaan intensitas cahaya sehingga menghasilkan kontras terang dan gelap pada gambar (Parija, 2012). Mikroskop ini juga
58
menggunakan cincin buram atau penahan annular, namun mikroskop ini memiliki cincin transparan yang hanya mengeluarkan cahaya dalam kerucut berongga. Prinsip mikroskop ini berhubungan dengan indeks bias dan fakta bahwa sel memiliki indeks bias yang berbeda dari lingkungannya, sehingga menghasilkan cahaya yang fasenya sedikit berbeda. Perbedaannya diperkuat oleh cincin fase yang ditemukan. Perbedaan fase dapat diartikan menjadi perbedaan kecerahan, sehingga menghasilkan gambar gelap di tengah latar belakang terang. Hal ini memungkinkan pengamatan sel hidup yang tidak terwarnai, dan berguna untuk mengamati motilitas atau organel eukariotik (gambar 5.3b) (Bruslind, 2020).
(a) (b)
Gambar 5.3 (a) Prinsip Darkfield microscopy, (b) Prinsip Mikroskop Fase Kontras (Parija, 2012)
d) Differential Interference Contrast (DIC) Microscope
Mikroskop jenis ini merupakan mikroskop cahaya yang digunakan untuk menunjukkan organel sel. Hal ini juga berguna untuk pengukuran kuantitatif unsur kimia sel, seperti protein, lipid, dan asam nukleat (Parija, 2012). Differential Interference Contrast (DIC) Microscop beroperasi dengan prinsip yang hampir sama dengan
59
mikroskop fase kontras, yaitu memanfaatkan perbedaan indeks bias suatu spesimen dan lingkungannya. Tapi mikroskop ini menggunakan cahaya terpolarisasi yang kemudian dipecah menjadi dua sinar oleh sebuah prisma. Satu berkas cahaya melewati spesimen, berkas lainnya melewati area sekitar. Gambar yang dihasilkan hampir memiliki efek 3D, berguna untuk mengamati sel hidup yang tidak terwarnai (Bruslind, 2020).
e) Mikroskop fluoresen (fluorescence microscope)
Mikroskop fluoresensi adalah alat utama yang digunakan untuk memantau fisiologi sel. Meskipun konsepnya fluoresensi dan pemisahan optiknya menggunakan filter tetap sama, desain mikroskop bervariasi sesuai dengan tujuan untuk meningkatkan kontras gambar dan resolusi spasial (Sanderson, et. al., 2014). Pada mikroskop fluoresensi, spesimen diwarnai dengan fluorokrom/
kompleks fluorokrom. Cahaya berenergi tinggi atau panjang gelombang pendek (dari lampu halogen atau lampu uap merkuri) kemudian digunakan untuk merangsang molekul dalam spesimen atau molekul pewarna yang melekat padanya. Molekul memancarkan cahaya dengan panjang gelombang berbeda, seringkali berwarna cemerlang (WHO, 1999).
Proses yang mendasari fluoresensi melibatkan penyerapan energi cahaya (foton) oleh sebuah indikator yang diikuti dengan emisi sebagian energi cahaya (sebagai foton lain) beberapa nanodetik. Karena sebagian energi hilang dalam proses ini, foton yang dipancarkan memiliki energi lebih sedikit dibandingkan foton yang diserap. Cahaya dengan panjang gelombang pendek (ke arah biru) memiliki energi lebih tinggi dibandingkan Cahaya dengan panjang gelombang yang panjang (ke arah merah). Oleh karena itu, cahaya yang dipancarkan dari suatu indikator biasanya mempunyai panjang gelombang yang lebih panjang dibandingkan cahaya yang diserap (eksitasi). Perubahan ini disebut pergeseran Stokes. Transisi
60
molekuler yang menjelaskan proses ini dapat digambarkan dalam bentuk diagram energi Jablonski (Sanderson, et. al., 2014)
2. Mikroskop Elektron
Mikroskop elektron mampu melakukan pembesaran objek hingga dua juta kali menggunakan elektro statik dan elektro magnetik untuk mengatur pencahayaan dan tampilan gambar serta memiliki kemampuan pembesaran objek dan resolusi yang jauh lebih bagus dari pada mikroskop cahaya. Mikroskop elektron ini menggunakan lebih banyak energi dan radiasi elektro magnetik yang lebih pendek dibandingkan mikroskop Cahaya (Ramadhani, 2020).
Terdapat dua jenis utama mikroskop elektron yaitu Scanning Electron Microscope (SEM) dan mikroskop elektron transmisi (TEM) (Hogg, 2005).
a. Scanning Electron Microscope (SEM)
Prinsip kerja mikroskop scanning electron yaitu sinar dari lampu dipancarkan pada lensa kondensor, sebelum masuk pada lensa kondensor terdapat pengatur dari pancaran sinar elektron yang ditembakkan. Sinar yang melewati lensa kondensor tersebut diteruskan ke lensa objektif yang dapat diatur maju mundurnya.
Lensa objektif yang dilewati sinar, diteruskan pada spesimen yang diatur miring pada pencekamnya, spesimen ini disinari oleh deteksi x-ray yang menghasikan sebuah gambar yang diteruskan pada layar monitor (Respati, 2008) (gambar 5.4).
61
Gambar 5.4 Scanning Electron Microscope (SEM) (Bruslind, 2020) b. Mikroskop elektron transmisi (TEM)
Mikroskop elektron transmisi menggunakan berkas elektron yang diarahkan ke spesimen dengan menggunakan elektromagnet.
Area padat menyebarkan elektron, menghasilkan area gelap pada gambar, sedangkan elektron dapat melewati (atau
“mentransmisikan”) melalui area kurang rapat, sehingga menghasilkan bagian lebih terang. Gambar dihasilkan pada layar berpendar dan kemudian dapat ditangkap. Karena elektron mudah dihamburkan oleh spesimen yang sangat tebal, sampel harus diiris hingga ketebalan 20-100 nm, biasanya dengan cara ditanamkan ke dalam beberapa jenis plastik dan kemudian dipotong dengan pisau berlian menjadi bagian yang sangat tipis. Gambar yang dihasilkan mewakili satu irisan atau bidang spesimen (Gambar 5.5) (Bruslind, 2020).
62
Gambar 5.5 Mikroskop elektron transmisi (TEM) (Bruslind, 2020) C. Cara Kerja Mikroskop
Secara umum, mikroskop dengan jenis mikroskop cahaya (bukan mikroskop elektron) dapat digunakan dengan tahapan berikut ini:
1. Mikroskop diletakkan pada meja yang datar, kokoh, stabil, dan tidak mudah goyah.
2. Kabel mikroskop dipastikan dapat menjangkau sumber listrik, Jika mikroskop menggunakan sumber listrik untuk media pengamatan objek.
3. Objek yang akan diamati dengan mikroskop disediakan dan diletakkan pada mikroskop.
4. Agar penempatan objek pada meja preparat bisa dilakukan dengan mudah, maka kendurkan terlebih dahulu makrometer.
5. Objek yang akan diamati dengan mikroskop harus dipreparasi terlebih dahulu kemudian letakan pada meja preparate.
6. Revolver diputar untuk memilih perbesaran sesuai kebutuhan (4x, 10x, 40x atau 100x) untuk mengamati objek.
63
7. Lampu untuk mengamati objek pada meja preparate dinyalakan, jika menggunakan mikroskop dengan bantuan cahaya matahari, perlu dilakukan setting cermin untuk memfokuskan cahaya pada objek.
8. Objek yang telah ditempatkan pada meja preparat dapat diamati, jika menggunakan mikroskop tipe monokuler, pengamatan dilakukan dengan salah satu mata. Jika menggunakan mikroskop tipe binokuler pengamatan dilakukan dengan kedua mata.
9. Preparat (digeser kanan dan kiri) untuk menempatkannya pada posisi yang sesuai.
10. Makrometer atau mikrometer pada lengan mikroskop (geser atas-bawah) diputar untuk memfokuskan objek yang sedang diamati.
11. Lampu pada mikroskop kemudian diatur tingkat kecerahannya (terang-redup).
12. Revolver lensa untuk memilih perbesaran yang diinginkan diatur, ketika mengatur revolver lensa perbesaran dipastikan jarak antara lensa objektif dan meja preparat cukup jauh, sehigga tidak terjadi gesekan antara keduanya.