4.6 Analisa Molekul
4.6.2 Reaksi rantai polimerase (PCR)
Proses amplifikasi PCR dilakukan untuk memperolehi jujukan gen yang dikehendaki dengan menggunakan alat Thermal cycler 406 keluaran Perkin Elmer iaitu model Gene Amp® PCR yang mempunyai 48 telaga (Gambar 4.3 dan 4.4) Reaksi PCR atau amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan Thermal Cycler 406 (Perkin Elmer Cetus).
Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen desaturase stearoyl-ACP endogen dan eksogen ditunjukkan pada Tabel 3.2. Campuran reaksi terdiri dari buffer reaksi berikut: 5 µl 10x Taq buffer (50
Gambar 4.3 Siklus PCR terdiri atas tiga tahap untuk pereplikaan DNA (Sumber : wikipedia.org/wiki/Reaksi_berantai_polimerase) 106
mM KCl, 10 mM Tris, Cl. pH 8.3), 2 µl MgCl2 , 1 µl 50 mM larutan dNTP, 1 µl Taq enzim polimerase dan 1 µl (20 pmoles/
µl) masing-masing untuk primer depan dan primer mundur.
Untuk templat DNA, digunakan 50 ng DNA plasmid dan 400 ng DNA genomik. Air suling steril ditambahkan untuk membuat volume akhir 50 µl dalam tabung eppendoft. Untuk mencegah penguapan, 30 µl minyak mineral ditambahkan untuk melapisi larutan reaksi.
Gambar 4.4 Mesin Thermal Cycle untuk amplifikasi PCR (Sumber:
Biostellar-Classic-Thermal-Cycler-PCR-Machine).
Untuk duplikasi gen desaturase stearoyl-ACP, kondisi berikut digunakan; reaksi dimulai dengan tahap pre-annealing DNA pada suhu 94°C selama 3 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus annealing template DNA pada suhu 94°C selama 2 menit, annealing primer pada suhu 58°C selama 1 menit dan pemanjangan pada suhu 72°C selama 1 menit. Pada siklus terakhir, diinkubasi pada suhu 72°C selama 7 menit. Hasil amplifikasi PCR dielektroforesis menggunakan agarosa 1% (b/
v) dan diwarnai dengan etidium bromida dan diamati lebih lanjut di bawah sinar ultraviolet.
Metode rekayasa genetika tanaman merupakan kemajuan dalam bidang bioteknologi tanaman. Metode ini dapat menghasilkan tanaman transgenik melalui transfer gen asing
Dr. Fathurrahman, SP., M.Sc
108
ke dalam jaringan target yang selanjutnya diintegrasikan dan diekspresikan dalam genom tanaman. Rekayasa genetika secara modern memberikan kontribusi yang signifikan untuk meningkatkan teknik pemuliaan konvensional yang sudah ada, khususnya untuk tanaman kelapa sawit. Peningkatan kualitas minyak sawit dapat dilakukan dengan menggunakan metode rekayasa genetika, salah satunya adalah peningkatan kualitas minyak, baik itu peningkatan asam lemak jenuh maupun asam lemak tak jenuh. Dalam penelitian ini yang ingin dicapai adalah kandungan minyak yang memiliki kadar asam lemak jenuh yang lebih tinggi.
Fokus utama dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan sistem transformasi yang efisien pada pohon dura. Pohon dura merupakan sumber pohon induk sawit betina yang perlu ditingkatkan kualitasnya. Penetapan sistem ini penting untuk memungkinkan minyak sawit yang telah ditransformasi disilangkan untuk menentukan apakah gen-gen tersebut ditransfer dengan cara Mendel.
Tujuan akhir adalah untuk melihat pengaruh integrasi dan ekspresi gen desaturase dalam susunan antisense pada genom dura Insert pTD7 cDNA adalah gen tidak lengkap yang mengkode ∆9-stearoyl-ACP desaturase minyak sawit dan gen ini adalah yang pertama diisolasi (Rashid 1997). Plasmid pADST35 digunakan untuk mengubah embrio yang belum matang (EBM) menggunakan metode biolistik.Konstruk pADST35 mengandung gen desaturase stearoyl-ACP dalam susunan antisense. Enzim ini terlibat dalam menghambat atau mereduksi sintesis asam lemak jenuh C:18 menjadi asam lemak tak jenuh C:18,1 dan rantai karbonnya yang lebih panjang. Di sisi lain konstruk ini dapat mengarahkan lebih banyak sintesis asam lemak jenuh. Studi tentang pohon dura untuk meningkatkan kualitas minyaknya ini merupakan studi percontohan.
Penentuan media kultur jaringan yang tepat untuk regenerasi eksplan penting dilakukan. Pertumbuhan sel yang aktif dan sempurna memungkinkan eksplan beregenerasi dengan baik. Media kultur jaringan yang paling cocok untuk regenerasi berdasarkan analisis pengaruh ketiga media kultur adalah media Y3. Media ini telah digunakan untuk proses transformasi dan regenerasi eksplan yang telah ditransformasi.
Embrio kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq dura) yang belum menghasilkan berumur 10 minggu ditransformasikan dengan vektor pADST35 menggunakan metode biolistik. Ada dua jenis jaringan target yang disinari, pertama; jaringan target embrio yang belum matang ditembak dan dihasilkan langsung ke pohon, kedua; jaringan target kalus setelah peledakan dihasilkan menjadi kalus embriogenik. Jaringan target embrio yang belum matang pada media Y3 yang mampu menghasilkan tanaman lengkap tidak terlalu bermasalah. Namun, ada eksplan yang setelah ditembak, pertumbuhannya terhambat dan mati. Selain itu eksplan yang telah tumbuh daun tetapi tidak dapat menghasilkan akar, karena titik tumbuh akar mengalami nekrosis dan akar tidak dapat tumbuh sehingga menyebabkan pertumbuhan eksplan terhambat. Ini mungkin karena kerusakan jaringan oleh iradiasi, serta eksplan yang peka oleh media yang mengandung penanda seleksi PPT.
Untuk kalus yang telah ditembak dan dihasilkan menjadi kalus embriogenik, terdapat masalah yaitu terhambatnya jaringan kalus berkembang menjadi kalus embriogenik. Hal ini kemungkinan karena media kultur tidak sesuai, kemudian jaringan kalus mengalami stress akibat tersengat iradiasi, juga karena sensitivitas kalus yang tinggi terhadap penanda seleksi PPT. Pembentukan kalus menjadi kalus embriogenik sangat sedikit dan untuk menghasilkan kalus menjadi tanaman utuh memerlukan waktu yang lama.
Dr. Fathurrahman, SP., M.Sc
110
Dalam proses penyinaran jaringan target dilakukan dengan 3 (tiga) kali penyinaran dengan waktu yang berbeda.
Interval waktu antara dosis pertama dan kedua adalah enam (6) bulan, dosis kedua dan ketiga adalah 7 bulan. Eksplan yang ditembakkan, kemampuan tumbuh pada media seleksi dan generasinya seperti pada Tabel 4.2.
Berdasarkan Tabel 4.2 di atas, jumlah jaringan target yang ditembak pada tahap I, II dan III berturut-turut adalah 60, 65 dan 95 eksplan. Namun setelah dilakukan pembakaran, jumlah eksplan yang berhasil bertahan pada tahap I, II dan III masing-
Tabel 4.2 Jumlah tahapan, jumlah tunas eksplan, jumlah eksplan setelah ditembak pada media seleksi dan Tanaman dura lengkap pada media Y3.
masing sebanyak 25, 32 dan 49 eksplan. Jumlah eksplan yang hidup setelah perlakuan mengalami penurunan karena sebagian eksplan terhambat pertumbuhannya dan sebagian terkontaminasi jamur atau bakteri. Keterlambatan pertumbuhan eksplan dapat disebabkan oleh marka seleksi (herbisida) yang mengandung PPT atau sel jaringan dapat tertekan akibat proses iradiasi. Selanjutnya untuk eksplan yang dihasilkan menjadi pohon utuh yang ditanam dalam polybag di dalam rumah kaca banyak yang mengalami kematian sehingga jumlah pohon yang mampu hidup menjadi pohon normal di dalam rumah kaca dari ketiga tingkat di atas adalah sebanyak 62 pohon.
Jumlah total kalus yang dikulturkan pada media Y3 yang tertembak adalah sebanyak 60 kalus yang tertembak pada dua tahap waktu yang berbeda, masing-masing tahap sebanyak 30 kalus. Kelangsungan hidup kalus untuk menjadi hidup dan menghasilkan kalus embriogenik sangat sedikit. Mungkin penyebabnya adalah karena PPT dan tekanan proses biolistik seperti pada pembangkitan eksplan ke tanaman langsung di atasnya. Selanjutnya, jaringan kalus embriogenik dikulturkan di ruang kultur dan masih dalam proses pertumbuhan untuk membentuk pohon utuh dan sampel daun tidak cukup untuk analisis molekuler yaitu analisis PCR.