2.6 Metode Transformasi Genetik dan Rekayasa
2.6.1 Transformasi Biolistik
Transformasi biolistik adalah metode transfer gen ke sel atau jaringan utuh melalui penggunaan mikroproyektil seperti tungsten dan emas yang dilapisi DNA (Jahne et al. 1995). Sistem biolistikmelibatkanpenggunaanperangkatuntukmempercepat partikel berkecepatan tinggi melalui dinding dan membran sel, yang selanjutnya diintegrasikan ke dalam nukleus dan jaringan.
Sistem biolistik pertama kali diperkenalkan oleh Sanford et al. (1987). Penggunaan serbuk mesiu yang dirancang untuk meningkatkan keberhasilan transformasi genetik berbagai spesies tumbuhan telah dilakukan di beberapa laboratorium (Sanford 1990). Namun kelemahan dari teknik ini adalah bubuk mesiu dari proses penembakan tidak terkendali sehingga merusak sel target dan membatasi stabilitas tanaman yang ditransformasi. Masalah utama dalam melakukan transformasi genetik adalah terbatasnya inklusi DNA eksogen secara efektif.
Berdasarkan penelitian sebelumnya, tanaman ekonomi penting seperti serealia dan kacang-kacangan menunjukkan ketahanan terhadap metode transformasi Agrobacterium. Masalah ini dapat diatasi dengan penggunaan metode biolistik (Wilde et al.
1992), hingga metode biolistik dianggap sebagai metode terpenting kedua setelah Agrobacterium (Gray & Finer 1993).
Keistimewaan metode biolistik adalah cocok untuk transfer gen pada jaringan tanaman, baik dikotil maupun monokotil (Sanford 1990; Jahne et al. 1995) dan merupakan metode yang sederhana dan cepat (Sanford 1990) serta tidak bergantung pada jaringan. (Dines 1991).
Beberapa tanaman penting yang resisten terhadap infeksi Agrobacterium, tetapi berhasil dilakukan dengan metode
biolistik, di antaranya adalah gandum (Vasil 1994), jagung (Koziaketal.1993).BenihrepmudahdiubaholehAgrobacterium.
Untuk beberapa tanaman seperti kedelai (Christou et al. 1989), kapas (Finer & Mc. Mullen 1990) telah berhasil diregenerasi.
Keunggulan biolistik dibandingkan dengan Agrobacterium adalah tidak terbatas pada kisaran inang dan tidak bergantung pada kultur jaringan (Dines 1991). Namun, jika dibandingkan dengan transformasi yang diperantarai Agrobacterium, metode ini meningkatkan produksi chimera pada meristem tanaman (Jones & Cassells 1995). Terjadinya multipel sel pada integrasi dan penataan ulang berdasarkan tidak adanya atau lemahnya ekspresi setelah transfer gen secara biolistik (Christou et al. 1988; Jahne et al. 1994; Spangenberg et al. 1995), sehingga menyebabkan delesi, metilasi atau korepresi antara beberapa salinan transgen (De Carvalho et al. 1992). Efisiensi transformasi sel dapat ditingkatkan ketika membran nukleus dihilangkan (Yamashita et al. 1991). Perlakuan sel dengan larutan yang memiliki tekanan osmotik tinggi dapat meningkatkan efektivitas ekspresi gen yang terintegrasi secara biolistrik (Ye et al. 1990).
Di antara faktor penting untuk menentukan frekuensi ekspresi gen transien ke dalam jaringan target adalah ukuran dan komposisi mikroproyektil, proses pelapisan DNA ke mikroproyektil, kecepatan mikroproyektil terhadap jaringan target, tingkat cedera yang dialami oleh jaringan selama proses iradiasi, konstruksi vektor yang digunakan, ukuran, umur dan posisi jaringan tanaman. Faktor-faktor tersebut harus dioptimalkan sesuai dengan spesies untuk mendapatkan frekuensi transformasi yang tinggi (Sanford et al. 1993).
Ukuranpartikeldalampenggunaanmikroproyektilberkisar antara satu hingga empat mikron. Biasanya mikroproyektil terbuat dari tungsten atau emas yang memiliki sifat tidak aktif
Dr. Fathurrahman, SP., M.Sc
atau tidak memiliki aktivitas reaksi terhadap DNA. Selain itu, tidak menyebabkan toksisitas pada jaringan target. Proses pelapisan DNA vektor ekspresi pada partikel mikro digunakan sebagai berikut; partikel tungsten dilapisi oleh co-presipitasi dengan CaCl2 dan spermidine (Klein et al. 1988), sedangkan untuk partikel emas, DNA diendapkan pada permukaan partikel sebelum dibiarkan mengering. Penggunaan CaCl2 dan spermidine untuk mengendapkan DNA pada partikel emas dapat meningkatkan ekspresi transien gen GUS pada kalus embriogenik (Parveez et al. 1997). Untuk meningkatkan laju transformasi yang tinggi, penggunaan alat biolistik dan teknik pengendapan DNA sangat penting.
Gambar 2.3 menunjukkan skema sistem biolistik untuk pemberian dosis. Awalnya mikroproyektil yang dilapisi DNA ditempatkan pada permukaan makrocarrier yang dipercepat oleh pelat penghenti. Gaya yang digunakan untuk mempercepat proyektil dapat dihasilkan melalui beberapa cara yaitu gelombang gas helium, tekanan udara, pelepasan listrik. Pada pelat penghenti terdapat pelat layar untuk memungkinkan mikroproyektil yang dilapisi DNA dapat mencapai dan menembus jaringan target. Selanjutnya, DNA yang dilapisi pada partikel akan diekspresikan secara sementara atau diintegrasikan ke dalam genom tanaman. Kecepatan mikroproyektil dapat dikontrol dengan mengubah jarak antara stop plate dan jaringan target. Keseimbangan harus dicapai antara penetrasi partikel yang optimal dan cedera jaringan yang responsif. Namun, kurangnya kecepatan dalam transfer gen sering merusak jaringan melalui kerusakan microcarrier, ledakan udara dan kejutan akustik (Birch dan Franks 1991).
Menurut Fitch et al. (1990) plasmid berukuran besar lebih dari 10 kb dapat mengalami fragmentasi selama proses pemisahan yang menyebabkan laju ekspresi gen menjadi rendah.
46
Sel yang terpilih harus mampu mengekspresikan gen asing yang diintroduksikan padanya, mampu membelah sel dengan mudah dan sempurna serta mampu berdiferensiasi untuk proses pertumbuhan menjadi tumbuhan utuh. Oleh karena itu, sel target harus dalam keadaan aktif membelah dan tahan terhadap tekanan saat penyinaran dilakukan. Dalam melakukan penyinaran, sel target tidak boleh mengalami fragmentasi. Konsentrasi osmotik perlu ditingkatkan agar partikel DNA dapat menembus sel target dalam jumlah yang lebih besar. Hal ini telah dibuktikan oleh Vain et al. (1993) bahwa perlakuan osmotik dapat membantu meningkatkan pembentukan transient transforman yang stabil pada tanaman jagung. Penggunaan jaringan yang berbeda dapat menyebabkan perbedaan parameter optimal, misalnya kondisi optimal untuk transformasi tanaman kelapa sawit (E. guineensis Jacq) telah teridentifikasi pada dua jenis jaringan. Penggunaan biolistrik tipe PDS-1000/He telah menunjukkan bahwa tekanan piringan pecah setinggi 1100 psi, dengan jarak 6 mm antara piringan pecah dan makro pembawa, jarak antara makro pembawa dan pelat berhenti adalah 6 mm, jarak 75 mm antara stop plate dan jaringan target, tekanan vakum 28”Hg mampu menghasilkan ekspresi optimal pada kalus embriogenik kelapa sawit (Parveez et al. 1997). Sedangkan Ruslan et al. (1996) melaporkan bahwa tekanan pecahnya cakram setinggi 900 psi; dengan jarak 6 mm antara makro pembawa dan stop plate, sedangkan jarak antara stop plate dan jaringan target 60 mm dan tekanan vakum 26”Hg mengoptimalkan transformasi pada embrio belum matang sawit
Frekuensi transformasi stabil dalam sistem biolistik rendah dibandingkan dengan sistem ekspresi transien dan produksi beberapa integrasi gen selalu mengalami fragmentasi dan penataan ulang (Wan & Lemaux 1994). Di sisi lain dari
Dr. Fathurrahman, SP., M.Sc
48
teknik ini, DNA dari vektor plasmid selalu ditransformasikan menjadi inti sel tanaman bersama dengan gen yang diinginkan.
Jika transgen ganda terbentuk pada tanaman transgenik, terjadi kosupresi yang mengakibatkan inaktivasi transgen dan gen inang (Genevieve & Chilton 1996). Karena itu banyak gen yang dimasukkan ke dalam sel jika terhubung secara genetik mungkin tidak dapat diregenerasi untuk pemuliaan berikutnya.
2.6.2 Transformasi yang dimediasi oleh Agrobacterium