UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN JAMBU METE (Anacardium occidentale L.) TERHADAP
PERTUMBUHAN BAKTERI Escherichia coli DAN Staphylococcus aureus
OLEH:
GINA SONYA NIM. F202101004
PROGRAM STUDI S1 FARMASI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS MANDALA WALUYA KENDARI
2025
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Penilitian ini merupaka peneltian yang menggunakan studi eksperimental. Sampel yang digunakan pada penelitian ini yaitu bakteri E.coli dan S. aureus dengan antibakteri ekstrak etanol daun jambu mete menggunakan metode Difusi Agar atau Disc Diffusion.
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian 3.2.1 Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari-April 2025.
3.2.2 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Fitokimia dan Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Farmasi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Mandala Waluya Kendari.
3.3 Populasi dan Sampel 3.3.1 Populasi
Populasi yang digunakan adalah bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus pada kultur murni yang terdapat di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Mandala Waluya Kendari pada periode 2025.
3.3.2 Sampel
Sampel yang digunakan adalah total keseluruhan populasi bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Mandala Waluya Kendari. Kemudian bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus ditanamkan dalam Nutrient Agar. Pada penelitian
ini, menggunakan sebanyak 3 formula. Ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak daun jambu mete dengan variasi konsentrasi 1.5%, 2%, dan 2,5% dengan menggunakan pelarut etanol 95%. Kontrol negatif (Aquadest steril) dan control positif digunakan (Kloramfenikol).
3.4 Variabel Penelitian 3.7.1 Variabel Bebas
Ekstrak daun Jambu Mete (Anacardium occidentale L.) dengan konsentrasi
3.7.2 Variabel Terikat
Pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
3.7.3 Variabel Kontrol
Suhu inkubasi, sterilisasi alat dan ruang kerja, kontaminasi miroorganisme lain, ketebalan media pertumbuhan bakteri, bakteri, umur dan kondisi daun jambu mete, waktu, komposisi media dan pH media.
3.5 Alat dan Bahan 3.5.1 Alat
Alat untuk ekstraksi terdiri dari: timbangan analitik, spatula, erlenmeyer, botol maserasi, alumunium foil, corong, labu evaporator, cawan penguap, hairdryer, kaca arloji, pipet, blender dan alat-alat gelas standar laboratorium.
Alat untuk uji antibakteri terdiri dari: erlenmeyer, tabung reaksi, rak tabung reaksi, spatula, gelas ukur, autoklaf, cawan petri, jarum ose, batang L, pinset, mikropipet dan tip, lampu spiritus, kapas steril, vortex, hot plate dan magnetic stirer (Daiki Kblee 5001), oven, lemari pendingin (Sanyo Medicool), laminar air flow LAF (EACI), inkubator (Gallenkamp), cakram kosong steri, jangka sorong.
3.5.2 Bahan
Bahan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah simplisia dau jambu mete (Annacardium Occidentale L.) diperoleh dari daerah Labokeo, Kabupaten Konawe Selatan, Sulawesi Tenggara. Tanaman dideterminasi di Kebun pribadi untuk memastikan bahan uji yang akan digunakan, etanol 95%, Nutrient Agar (NA), antibiotik kloramfenikol, aquadest steril, NaCl fisiologis, DMSO, pereaksi Dragendorff, Hcl, pereaksi Lieberman-Bouchardat NaOH, asam sulfat, kloroform, asam asetat anhidrat, FeC13, etanol 70%, spirtus.
3.6 Pemeriksaan Kandungan Kimia Daun Jambu Mete
Penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui metabolit sekunder yang terkandung di dalam ekstrak etanol 96% kulit batang kayu jawa (Lannea coromandelica). Metabolit sekunder yang diuji secara kualitatif ini antara lain alkaloid, flavonoid, saponin, glikosida, triterpenoid dan steroid, fenol, dan tanin.
1. Uji alkaloid
Sebanyak 0,5 gram ekstrak dilarutkan dalam larutan HCl encer kemudian disaring. Kedalam filtrat ditambahkan 2 ml larutan ammonia, kemudian ditambahkan kloroform 5 ml dan dikocok perlahan-lahan untuk mengekstraksi basa alkaloid. Lapisan kloroform diambil lalu diekstraksi dengan 10 ml asam asetat, kemudian dibagi menjadi 2 bagian. Pada bagian pertama ditambahkan reagen Mayer dan bagian kedua ditambahkan reagen Dragendorff. Terbentuk warna putih dengan reagen Mayer dan endapan coklat kemerahan dengan reagen Dragendorff menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid ( Ayoola, G.A.
2008)
2. Uji Flavonoid
Sebanyak 0,5 gram ekstrak dilarutkan dengan 2 mL etanol 70% dan ditambahkan 3 tetes larutan NaOH. Terjadinya perubahan intensitas warna kuning menjadi tidak berwarna pada penambahan
asam sulfat mengindikasikan adanya senyawa flavonoid (Tiwari.
et al., 2011).
3. Uji Saponin
Sebanyak 0,5 gram ekstrak dilarutkan dalam 20mL aquades, kemudian larutan dikocok dalam labu ukur selama 15 menit.
Terbentuknya busa setinggi 1 cm mengindikasikan adanya senyawa saponin (Farnsworth, 1969).
4. Uji Glikosida
Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 1 mL aquades dan ditambahkan larutan NaOH. Terbentuknya warna kuning mengindikasikan adanya senyawa glikosida (Tiwari. et al., 2011).
5. Uji Triterpenoid dan steroid
Dilakukan dengan reaksi Lieberman-Burchard. Larutan uji sebanyak 2 mL diuapkan dalam cawan porselen dilarutkan dalam 0,5 mL kloroform kemudian ditambahkan 0,5 mL asam asetat anhidrat, selanjutnya melalui dinding tabung ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat. Terbentuk cicin kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan menandakan positif triterpenoid, jika cincin biru kehijauan menandakan positif steroid. (Ayoola, G.A. 2008) 6. Uji Fenol
Sebanyak 0,5 gram ekstrak dilarutkan dengan 2 mL etanol 70% dan ditambahkan 3 tetes larutan FeCl3. Terbentuknya warna hitam kebiruan mengindikasikan adanya senyawa fenol (Tiwari. et al., 2011).
7. Uji Tanin
Sebanyak 0,5 gram ekstrak dididihkan dalam 10 ml aquadest dalam tabung reaksi, lalu disaring. Kemudian kedalam filtrat ditambahkan 3 tetes larutan FeCl3. Terbentuk warna hijau kecoklatan atau biru kehitaman menunjukkan adanya tannin (Ayoola, G.A. 2008).
3.7 Prosedur Penelitian
3.7.1 Pembuatan Serbuk Simplisia
Serbuk simplisia dibuat dari potongan halus simplisia yang sudah dikeringkan. Pertama-tama diambil daun jambu mete yang berwarna hijau tua atau daun muda. Lalu disortasi basah untuk memisahkan kotoran yang ada didaun. Kemudian ditiriskan dan dipotong kecil-kecil untuk mempercepat pengeringan. Diangin-anginkan daun yang sudah dipotong kecil-kecil dalam wadah lebar dan ditutupi oleh kain hitam. Proses pengeringan tidak boleh langsung mengenai cahaya matahari agar senyawa yang mudah menguap tidak hilang. Setelah kering, daun disortasi kering untuk menghilangkan bagian-bagian yang tidak diinginkan. Tahap terakhir yaitu dihaluskan menggunakan blender atau menggunakan mesin penghalus dan diayak untuk mendapatkan serbuk halus. Derajat kehalusan simplisia yang digunakan untuk ekstrak merupakan simplisia dengan nomor pengayak 60 dengan lebar nominal lubang 0,105 mm, garis tengahnya 0,064 mm dan ukurannya yaitu 250 µm (Departemen Kesehatan RI,2008).
3.7.2 Pembuatan Ekstrak
Ektrak daun jambu mete diperoleh dengan cara maserasi.
Maserasi merupakan proses pengekstrakan simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa pengadukan dan pengocokan pada suhu ruangan. Ditimbang serbuk simplisia sebanyak 100gram kemudian direndam dierlenmeyer tertutup yang telah berisi etanol 95% sebanyak 500ml selama 5 hari sambil diaduk. Sampel yang direndam tersebut lalu disaring dengan kertas saring menghasilkan filtrat 1 dan residu 1.
Residu 1 ditambahkan etanol 95% p.a sebanyak 250ml, kemudian ditutup dengan alumuniumfoil biarkan selama 2 hari sembari diaduk.
Setelah penyimpanan selama 2 hari, sampel disaring menggunakan kertas saring hingga menghasilkan filtrat 2 dan residu 2. Filtrat 1 dan filtrat 2 dicampur lalu dievaporasi menggunakan rotary evaporator dan
diperoleh ekstrak kulit bawang merah. Ekstrak kental yang didapatkan lalu dihairdryer dan uapkan hingga seluruh pelarut etanol menguap.
Ekstrak ditimbang dan disimpan ke wadah gelas tertutup sebelum digunakan untuk pengujian (Dima et al., 2016).
3.7.3 Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Daun Jambu Mete
Ekstrak daun jambu mete yang diuji untuk menghambat atau membunuh pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dibuat dalam beberapa konsentrasi yaitu konsentrasi 1,5%, 2%, dan 2,5% (b/v). Dengan cara ditimbang ekstrak kental daun jambu mete kemudian masing – masing dilarutkan dalam 100 ml aquadest.
3.7.4 Sterilisasi Alat
Seluruh alat yang akan digunakan dicuci bersih,dikeringkan dan disterilkan terlebih dahulu. Alat alat gelas seperti gelas ukur, labu ukur, dan tip mikropipet dimasukan kedalam plastik tahan panas disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121℃ selama 15 menit.
Bahan-bahan yang terbuat dari karet disterilkan dengan direndam dengan alkohol 70% dan jarum ose disterilkan dengan dipijarkan menggunakan nyala bunsen. Alat-alat kaca non presisi seperti tabung reaksi, beaker glass dan erlenmeyer ditutup mulutnya dengan kapas.
Cawan petri dibungkus dengan kertas, kemudian semuanya dimasukkan dalam plastik tahan panas dan disterilkan dengan oven pada suhu 1800C selama 2 jam. Laminar Air Flow disterilkan dengan lampu UV selama 15 menit dan disemprotkan dengan alkohol 70%.
Sterilisasi laminar ini dilakukan sebelum dan sesudah bekerja didalamnya (Pertiwi, 2010)
Media (NA) disterilkan dengan autoklaf pada temperatur 121C selama 15 menit. Pengerjaan aseptis dilakukan didalam lemari aseptis yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70%, lalu disterilkan dengan UV.
3.7.5 Pembuatan Medium Nutrient Agar
Sebanyak 20 gram NA dilarutkan dengan pemanasan dalam 1 liter aquadest diatas hot plate dan menggunakan magnetik stirer sampai bening, kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. pembuatan agar miring NA dilakukan dengan memasukan media yang telah disterilkan kedalam tabung reaksi sebanyak ±5 ml, tabung disumbat dengan kapas steril dan diletakan miring ± 450 ditunggu hingga memadat. (Alexander
2007)
3.7.6 Peremajaan Bakteri
Peremajaan bakteri menggunakan agar miring NA, peremajaan bakteri yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
Bakteri diambil satu ose menggunakan ose steril selanjutnya digoreskan pada permukaan agar miring dengan cara silang (zig-zag) dan di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C (Nurcahyani dan Timous, 2011).
3.7.7 Pembuatan Suspensi Bakteri
Bakteri dibiakan dengan cara di inkubasi dengan nutrien agar miring selama 24 jam pada suhu 370C, kemudian diambil dengan ose dan disuspensikan dengan cara dimasukan kedalam tabung berisi 10 mL NaCl fisiologis 0,9% lalu divortex sampai homogen dan dilihat kekeruhannya yang menandai bahwa ada pertumbuhan bakteri, kekeruhan disetarakan dengan Mc. Farland no. 3 yaitu setara dengan sel bakteri/mL. Kemudian diencerkan dengan NaCl fisiologis 0,9% steril sampai diperoleh konsentrasi 106 sel bakteri/mL (Kuete, 2011).
Penggunaan konsentrasi sel bakteri/mL pada suspensi bakteri berdasarkan kerentanan anaerobik yaitu 106-104 (pokyni,2010).
3.7.8 Pembuatan Larutan Uji
Larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak menggunakan DMSO 5% (dimetil sulfoxide). Larutan uji dibuat dengan membuat larutan induk 5000 ppm yaitu sebanyak 0,25 gram ekstrak etanol 95%
kulit daun jambu mete (Annacardium occidentale L.) dilarutkan dalam 50 ml DMSO 5%, kemudian larutan induk tersebut diencerkan menjadi konsentrasi 1,5%, 2%, dan 2,5% untuk melakukan uji aktivitas antibakteri.
3.7.9 Penentuan Diameter Zona Hambat
Penentuan Diameter Zona Hambat Media agar NA yang telah disterilkan dimasukan kedalam cawan petri steril masing-masing sebanyak 20 mL dan dibiarkan memadat pada suhu kamar. Media tersebut ditetesi dengan 100 μL suspensi bakteri uji dan diratakan dengan menggunakan batang L sampai rata dan kering. Kertas cakram steril dengan diameter 6 mm diteteskan ekstrak etanol 95% daun jambu mete (Anacardium occidentale L.) sebanyak 10 μl masing-masing konsentrasi yaitu 1,5%, 2%, dan 2,5%, kemudian diletakan pada media agar padat yang telah ditetesi suspensi bakteri uji, DMSO 5% sebagai kontrol negatif, dan cakram 30 μg kloramfenikol sebagai kontrol positif. Kemudian di inkubasi pada suhu 37℃ selama 24 jam dan setelah di inkubasi diukur zona hambat yang terbentuk yang ditandai dengan adanya zona bening menggunakan jangka sorong (Atikah, 2013).
3.7.10 Pengamatan dan Pengukuran
Pengamatan dilakukan setelah 1x24 jam masa inkubasi. Daerah bening yang terdapat pada media pengujian menunjukkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik atau bahan antibakteri yang digunakan sebagai bahan uji yang dinyatakan dengan diameter zona hambat (Vandepitte et al, 2005). Pertumbuhan mikroba diamati dan zona bening yang terbentuk di
sekeliling cakram diukur menggunakan jangka sorong dalam satuan milimeter (mm) (Dima et al., 2016).
Kemudian diameter zona hambat antibiotik Chloramphenicol berdasarkan pedoman Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI) tahun 2018.
Tabel 3.1 Standar Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI), 2018.
3.8 Jenis dan Pengumpulan Data 1. Jenis data
Jenis data yang diperoleh adalah data primer. Data primer dari penelitian ini adalah zona hambat yang terbentuk pada pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dengan sampel ekstrak etanol daun jambu mete berbagai konsentrasi 1,5%, 2%, dan 2,5%.
2. Teknik pengumpulan data
Data dikumpulkan melalui eksperimen laboratorium dengan mengukur diameter zona hambat menggunakan jangka sorong. Pengukuran dilakukan pada zona hambat bakteri E.coli dan S.aureus yang terbentuk dari konsentrasi 1,5%, 2%, dan 2,5%.
3. Instrumen pengumpulan data
Dalam penelitian ini, alat yang digunakan untuk pengumpul data adalah jangka sorong, alat tulis, kamera, dan instrumen laboratorium.
3.9 Pengelolaan dan Analis Data
Data hasil pengujian aktivitas ekstrak etanol daun jambu mete (Anacardium occidentale L.) terhadap diameter zona hambat pertumbuhan
bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dianalisa secara statistik menggunakan metode One Way anova (analisa varians satu arah) dengan program Statistical Product Services Solution (SPSS) dengan taraf kepercayaan 95% atau α = 0,05.
3.9 Etika Penelitian
Pada penelitian ini prinsip etika yang diterapkan adalah beneficence yang artinya prinsip kebaikan dan memberikan manfaat dan meminimalkan kerugian kepada orang lain. Serta prinsip Non-Maleficence yang artinya prinsip tidak merugikan yang bertujuan agar subjek penelitian tidak diperlakukan sebagai sarana dan memberikan perlindungan terhadap tindakan penyalahgunaan.
3.10 Kerangka Konsep
3.11 Hipotesis
Ekstrak daun jambu mete (Annacardium occidentale L.) memiliki aktivitas antibakteri dan mampu menghambat terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan Staphyloccus aureus.
Ekstrak daun jambu mete (Annacardium occidentale L.)
Biakan bakteri E.coli dan
S.aureus
Metode difusi agar (disc diffusion)
Clear zona
