LAPORAN PRAKTIKUM DASAR KULTUR JARINGAN INOKULASI DAN SUB KULTUR TANAMAN PANILI
Disusun Oleh Ahmad Dhani NIM A43222023
Golongan C Dosen Mata Kuliah Rahmawati, S.P., M.P Sepdian Luri Asmono, S.ST., M.P.
Dyah Nuning Erawati, S.P., M.P.
Teknisi
Eko Hadi Cahyono, S.P ., M.P.
PROGRAM STUDI BUDIDAYA TANAMAN PERKEBUNAN JURUSAN PRODUKSI PERTANIAN
POLITEKNIK NEGERI JEMBER
2024
BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Stevia (Stevia rebaudiana) merupakan tanaman yang dikenal sebagai sumber pemanis alami dengan kandungan glikosida steviol, seperti stevioid yang memiliki potensi sebagai pengganti gula dengan kalori rendah. Tanaman ini telah digunakan dalam pengobatan tradisional dan industri pangan, kosmetik, serta obat- obatan. Stevia memiliki daya tarik yang besar di pasar global karena sifat pemanisnya yang aman dan lebih sehat dibandingkan dengan pemanis sintetis.
Namun, untuk memanfaatkan potensi stevia secara maksimal, tantangan utama yang dihadapi adalah produksi tanaman yang berkualitas, dalam jumlah yang banyak dan konsisten.
ultur jaringan adalah salah satu teknologi yang dapat membantu mengatasi masalah tersebut. Teknik ini memungkinkan perbanyakan tanaman secara vegetatif tanpa memerlukan biji dan menghasilkan tanaman klonal dalam jumlah besar dengan kualitas yang seragam. Inokulasi dan subkultur merupakan dua tahapan yang sangat penting dalam kultur jaringan stevia, yang berfungsi untuk mengisolasi dan mengembangbiakkan tanaman yang sehat dan produktif. Inokulasi adalah tahap pertama di mana eksplan atau bagian tanaman yang akan digunakan ditempatkan pada media kultur. Sedangkan subkultur adalah proses pemindahan eksplan yang sudah berkembang menjadi medium yang baru untuk mendorong pertumbuhan lebih lanjut. Keduanya merupakan bagian integral dari keberhasilan dalam perbanyakan stevia dengan kultur jaringan.
1.2 Tujuan
Mahasiswa mampu;
1. Mengidentifikasi kondisi inokulasi yang optimal untuk pertumbuhan dan regenerasi Stevia rebaudiana.
2. Memahami tahapan kultur jaringan, mulai dari inokulasi hingga perbanyakan tanaman.
3. Menghasilkan bibit stevia berkualitas tinggi dengan teknik kultur jaringan yang efisien.
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
Kultur jaringan merupakan suatu teknik perbanyakan tanaman yang dilakukan dengan cara menumbuhkan sel atau jaringan tanaman dalam kondisi yang terkendali. Proses ini dimulai dengan pengambilan eksplan, yang bisa berupa bagian tanaman seperti daun, batang, atau akar, kemudian ditempatkan dalam media kultur yang mengandung nutrisi yang diperlukan. Teknik ini pertama kali diperkenalkan oleh Gottlieb Haberlandt pada tahun 1902. Kultur jaringan sangat berguna dalam penelitian bioteknologi tanaman, konservasi spesies langka, perbaikan tanaman, dan produksi massal tanaman hias atau tanaman obat.
Subkultur adalah proses pemindahan eksplan yang telah berkembang pada media kultur ke dalam media baru untuk mempercepat pertumbuhan dan perbanyakan. Pada stevia, subkultur bertujuan untuk menghasilkan tunas yang lebih banyak dan sehat. Pada tahap ini, eksplan yang sudah berkembang menjadi tunas hijau atau jaringan meristematik dipindahkan ke media yang lebih kaya nutrisi untuk mendukung proliferasi lebih lanjut.
Faktor yang mempengaruhi keberhasilan subkultur meliputi konsentrasi hormon pertumbuhan, komposisi media, serta frekuensi pemindahan ke media baru.
Jika subkultur dilakukan dengan benar, tanaman stevia yang dihasilkan akan memiliki karakteristik yang seragam dan kualitas yang tinggi. Subkultur yang tepat akan mempercepat waktu perbanyakan tanaman, meningkatkan kualitas dan kuantitas tanaman yang dihasilkan, serta membantu memperoleh tanaman stevia yang bebas dari penyakit.
Manfaat utama dari kultur jaringan stevia adalah perbanyakan tanaman secara cepat dan efisien. Teknik ini memungkinkan penghasil stevia untuk memperoleh tanaman dalam jumlah besar dalam waktu yang relatif singkat. Kultur jaringan juga dapat menghasilkan tanaman yang bebas dari penyakit, lebih seragam, dan memiliki kualitas tinggi. Selain itu, teknologi ini juga memungkinkan perbanyakan stevia dengan sifat unggul seperti ketahanan terhadap hama dan penyakit, serta adaptasi yang lebih baik terhadap lingkungan.
BAB 3. METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilakukan pada hari Kamis tanggal 7 November, 14 November dan 21 November 2024 pukul 09.00-11.00 WIB di Laboratorium Kultur Jaringan Politeknik Negeri Jember.
3.2 Alat dan bahan
Alat yang digunakan untuk praktikum inokulasi eksplan stevia ini meliputi:
laminar air flow, disetting set, bunsen, beaker glass, petridish, gunting, shaker, autoklaf, sealer, pensil, kain lap. Alat yang digunakan untuk membuat media sub kultur MS+3ppm BAP Tebu meliputi: Botol kultur dan tutupnya, erlenmeyer, gelas ukur, pompa pipet, mikro pipet, pengaduk kayu, magnetic stirer, panci, timbangan analitik, kompor, pH meter, autoklaf pensil. Alat yang digunakan untuk sub kultur tebu meliputi: laminar air flow, disetting set, lampu bunsen, petridish, autoklaf, oven besar, sealer, bulpoin, kain lap.
Bahan yang digunakan untuk praktikum inokulasi eksplan tebu ini meliputi pucuk batang tebu, air, aquades steril, alkohol 70%, larutan bayclin 10% dan 5%, HgCl₂ 0,1%, media MS-0, tissue. Bahan yang digunakan untuk membuat media sub kultur MS+3ppm BAP meliputi: larutan stok (A, B, C, D, E, F, G, H), BAP, agar- agar bubuk, gula, NaOH, HCl, kertas label dan tissue. Bahan yang digunakan untuk sub kultur tebu meliputi: Stevia yang siap disub kulturkan, media MS+3ppm BAP, tissue.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Prosedur Kerja Inokulasi Eksplan Stevia
3.3.1.1 Menyiapkan bahan tanam di ruangan persiapan
Menyiapkan eksplan stevia selanjutnya memotong ruasnya menggunakan gunting. Meletakkan potongan ruas eksplan stevia pada saringan kemudian mencuci pada air yang mengalir. Merendam eksplan stevia ke dalam larutan tween 20 yang telah dibuat selama 10 menit. Setelah 10 menit memindahkan dan
merendam eksplan stevia ke dalam larutan fungisida 1,5% dan larutan bakterisida 1,5% dan meletakkan pada shaker selama 10 menit.
3.3.1.2 Menyiapkan alat dan bahan di ruangan inokulasi
Menghidupkan laminar air flow kemudian sterilkan laminar dengan menyemprotkan alkohol dan meratakan alkohol dengan tissue. Meletakkan bunsen yang telah disemprot alkohol di bagian tengah laminar, meletakkan disseting set yang direndam alkohol pada sebelah kanan dan di depannya diletakkan alkohol 70%, HgCl₂ 0,1%, Bayclin 10%, Bayclin 5%, 3 aquades steril dan 2 petridish. Pada sebelah kiri terdapat media MS-0. Setelah eksplan stevia direndam fungisida dan bakterisida selama 10 menit, kemudian meletakkan larutan fungisida dan bakterisida yang berisi potongan eksplan stevia ke dalam laminar air flow dengan menyemprotkan alkohol terlebih dahulu.
3.3.1.3 Inokulasi eksplan stevia
Menyemprotkan alkohol pada keduan tangan terlebih dahulu kemudian memasukkan tangan ke dalam laminar. Mengambil pinset besar, lalu membakar pinset pada bunsen 3x dan mendinginkan pinset. Mengambil eksplan stevia menggunakan pinset dan memindahkan dan merendam eksplan ke larutan alkohol 70% selama 1 menit. Setiap memindahkan eksplan stevia harus membakar pinset pada bunsen agar pinset tetap steril. Memindahkan dan merendam eksplan stevia ke larutan HgCl₂ 0,1% selama 3 menit. Kemudian memindahkan dan merendam eksplan stevia pada larutan bayclin 10% selama 5 menit, memindahkan dan merendam lagi eksplan stevia pada larutan bayclin 5% selama 5 menit. Setelah itu memindahkan eksplan stevia ke larutan aquades steril 3 kali masing masing direndam selama 3 menit.
Membuka petridish, lalu mensterilkan pinset kemudian memindahkan eksplan stevia pada petridish. Memotong ujung eksplan stevia dengan menggunakan scalpel steril. Kemudian membuka tutup media di depan bunsen dan memindahkan potongan eksplan stevia ke dalam media MS-0 dengan pinset steril, lalu menancapkan ujung eksplan yang pada bagian tengah media.
Menutup dan melilitkan plastik wrap pada bagian tutup botol kultur dan menempelkan label yang berisi nama, komoditas, prodi dan golongan, serta tanggal
inokulasi. Kemudian meletakkan hasil inokulasi ekspalan stevia pada rak kultur di ruangan inkubasi.
3.3.1.4 Membersihkan dan mensterilkan alat yang telah digunakan
Memindahkan semua alat yang ada pada laminar kemudian mensterilkan laminar menggunakan alkohol lalu menonaktifkan laminar. Meletakan bunsen pada lemari, mencuci botol kultur dan tutupnya serta petridish dan disetting set.
Mengeringkan alat alat tersebut menggunakan kain lap. Meletakkan botol kultur ke dalam oven besar untuk disterilkan terpisah dengan tutupnya. Memasukkan petridish, tutup botol dan disetting set ke dalam plastik yang berbeda kemudian merekatkan plastik menggunakan sealer.
Meletakkan tutup botol, disetting set dan petridish ke dalam keranjang autoklaf. Memasukkan keranjang ke dalam autoklaf dan mensterilkan alat alat tersebut kemudian mensetting autoklaf dengan suhu 121°C tekanan 1,1kg F/cm³.
3.3.1.5 Melakukan pengamatan
Mengamati dan memotret pertumbuhan eksplan stevia setiap minggu dan jika ada yang terkontaminasi bakteri atau jamur segera dipindahkan atau dicuci botol kulturnya.
3.3.2 Prosedur Kerja Membuat Media Sub Kultur MS+3ppm BAP Stevia
Menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan untuk paraktikum. Mengambil larutan stok MS A, B, C, D, E, F, G, H menggunakan pompa pipet sesuai dengan kepekatan masing-masing, kemudian masukkan satu persatu larutan stok ke dalam erlenmeyer. Setelah itu mengambil 3ppm BAP menggunakan mikro pipet berwarna biru kemudian masukkan dalam erlenmeyer, pengulangan pengambilan sebanyak 3x karena setiap pengambilan 1ml.
Menimbang gula sebanyak 30gr pada timbangan analitik lalu masukkan gula pada beaker glass dan larutkan dengan 200ml aquades. Menuangkan larutan gula ke dalam erlenmeyer dan tambahkan aquades hingga volumenya menjadi 900ml. Meletakkan erlenmeyer pada magnetic stirer untuk diaduk tanpa dipanaskan menggunakan skala 1,5 kemudian memasukkan magnetnya. Setelah beberapa menit cek pH dengan mencelupkan ujung elektroda pH dan mengecek pH nya. Jika
pH kurang dari 5,80 tambahkan NaOH, jika pH lebih dari 5,80 tambahkan HCl menggunakan pipet. Setelah pH sesuai, kemudian mengeluarkan magnet dari erlenmeyer. Menambahkan aquades kembali ke dalam erlenmeyer hingga volume larutan menjadi 1000ml.
Meletakkan panci di atas kompor lalu menuangkan larutan dalam erlenmeyer dan menambahkan bubuk agar agar sebanyak 8gr kemudian menyalakan kompor. Mengaduk larutan hingga mendidih dan berbuih. Jika buih sudah rata, matikan dan angkat panci. Memindahkan media agar agar ke dalam gelas ukur. Menuangkan media ke dalam botol kultur sesuai dengan keperluan.
Setelah media agak dingin, kemudian menutup botol kultur dan memberi label yang bertuliskan MS+3ppm BAP Stevia yang ditulis menggunakan pensil. Memasukkan semua botol kultur yang telah diisi media ke dalam keranjang autoklaf dan sterilkan media dengan suhu 121°C selama 3 jam dengan tekanan 1,1kg F/cm². Setelah disterilkan kemudian meletakkan media MS+3ppm BAP pada rak kultur di ruangan inkubasi.
3.3.3 Prosedur Kerja Sub kultur Stevia
3.3.3.1 Menyiapkan alat dan bahan di ruangan inokulasi
Menghidupkan laminar air flow kemudian sterilkan laminar dengan menyemprotkan alkohol dan meratakan alkohol dengan tissue. Meletakkan bunsen yang telah disemprot alkohol di bagian tengah laminar, meletakkan disseting set yang direndam alkohol pada sebelah kanan. Meletakkan petridish steril di depan bunsen, botol kultur berisi stevia yang siap disub kulturkan di sebelah kanan dan media MS+3ppm BAP pada sebelah kiri. Alat dan bahan yang masuk pada laminar sebelumnya telah disemprot alkohol.
3.3.3.2 Sub Kultur Kalus Stevia
Menyemprotkan alkohol pada keduan tangan terlebih dahulu kemudian memasukkan tangan ke dalam laminar. Mengambil pinset, membakar pinset pada bunsen 3x lalu mendinginkan pinset. Mengambil stevia yang akan disub kultur secara perlahan menggunakan pinset dan meletakkannya pada petridish.
Mengambil gunting kemudian dibakar pada bunsen dan dinginkan. Mengapit stevia
menggunakan pinset lalu memotong ruasnya mengunakan gunting. Kemudian membuka tutup media di depan bunsen, memindahkan potongan ruas stevia ke dalam media MS+3ppm BAP dengan pinset steril dan menancapkannya di bagian tengah media. Menutup dan melilitkan plastik wrap pada bagian tutup botol kultur dan menempelkan label yang berisi nama, sub kultur komoditas, prodi dan golongan serta tanggal sub kultur. Kemudian meletakkan hasil inokulasi sub kultur stevia pada rak kultur di ruangan inkubasi.
3.3.3.3 Membersihkan dan mensterilkan alat yang telah digunakan
Memindahkan semua alat yang ada pada laminar kemudian mensterilkan laminar menggunakan alkohol lalu menonaktifkan lamainar. Meletakan bunsen pada lemari, mencuci botol kultur dan tutupnya serta petridish dan disetting set.
Mengeringkan alat alat tersebut menggunakan kain lap. Meletakkan botol kultur ke dalam oven besar untuk disterilkan terpisah dengan tutupnya. Memasukkan petridish, tutup botol dan disetting set ke dalam plastik yang berbeda kemudian merekatkan plastik menggunakan sealer.
Meletakkan tutup botol, disetting set dan petridish ke dalam keranjang autoklaf. Memasukkan keranjang ke dalam autoklaf dan mensterilkan alat alat tersebut kemudian mensetting autoklaf dengan suhu 121°C tekanan 1,1kg F/cm³.
3.3.3.4 Melakukan pengamatan
Mengamati dan memotret pertumbuhan sub kultur stevia setiap minggu dan jika ada yang terkontaminasi bakteri atau jamur segera dipindahkan atau dicuci botol kulturnya.
BAB 4. HASIL PEMBAHASAN 4.1 Hasil
Inokulasi Stevia
Tanggal Pengembangan Eksplan Pengamatan
07/11/2024 Eksplan masih segar dan belum ada pertumbuhan
H-1 tanam 14/11/2024 Tunas semakin panjang dan berwarna
hijau cerah
Pertumbuhan akar semakin kuat 20/11/2024 Warna semakin hijau tua dan segar
dan tunas tambah Panjang
Tidak terkontaminasi Sub kultur Stevia
Tanggal Pengembangan Eksplan Pengamatan
20/11/2024 Eksplan masih segar dan belum ada pertumbuhan
H-1 tanam 03/11/2024 Segar, berwarna hijau dan mulai
bercabang
Tidak terkontaminasi 4.2 Pembahasan
Inokulasi Stevia
Pada hasil pengamatan diatas, hari ke-1 (7/11/2024): Eksplan masih segar dan belum menunjukkan tanda-tanda pertumbuhan. Ini adalah kondisi normal pada awal proses kultur jaringan. Hari ke-7 (14/11/2024): Terjadi peningkatan pertumbuhan tunas, ditandai dengan memanjangnya tunas dan warna hijau yang semakin cerah. Ini mengindikasikan bahwa eksplan telah beradaptasi dengan baik pada media kultur dan mulai aktif melakukan pertumbuhan. Hari ke-14 (20/11/2024): Pertumbuhan terus berlanjut dengan warna eksplan yang semakin hijau tua dan segar. Selain itu, panjang tunas juga bertambah. Kondisi ini menunjukkan bahwa eksplan tumbuh dengan baik dan tidak terkontaminasi oleh mikroorganisme lain.
Proses inokulasi stevia berjalan dengan baik, eksplan menunjukkan pertumbuhan yang sehat dan tidak terkontaminasi. Kondisi ini mengindikasikan bahwa media kultur yang digunakan dan teknik aseptik yang diterapkan sudah cukup baik.
Sub kultur Stevia
Pada hasil pengamatan diatas Subkultur Stevia di atas, hari ke-0 (20/11/2024):
Eksplan masih segar dan belum menunjukkan tanda-tanda pertumbuhan. Ini adalah kondisi normal pada awal proses subkultur dan hari ke-7 (03/12/2024):
Eksplan tetap segar dan mulai menunjukkan percabangan. Ini menunjukkan bahwa eksplan mampu beradaptasi dengan media kultur baru dan melanjutkan pertumbuhannya.
BAB 5. PENUTUP
Keberhasilan Inokulasi merupakan tahap awal yang sangat penting dalam kultur jaringan. Hasil menunjukkan bahwa sterilisasi bahan tanam (eksplan) dan lingkungan kerja steril memainkan peran krusial dalam mencegah kontaminasi.
Kondisi Optimal: Media kultur yang digunakan, seperti Murashige and Skoog (MS) dengan penambahan zat pengatur tumbuh, mendukung inisiasi dan pertumbuhan eksplan Stevia secara optimal. Regenerasi Eksplan: Eksplan stevia mampu menunjukkan respons regenerasi, seperti pembentukan tunas atau kalus, dalam waktu tertentu setelah inokulasi, tergantung pada media dan perlakuan yang diberikan. Efisiensi Perbanyakan: Teknik inokulasi yang dilakukan dengan benar dapat meningkatkan efisiensi perbanyakan stevia melalui kultur jaringan, menghasilkan bibit tanaman yang seragam dan berkualitas tinggi.
DAFTAR PUSTAKA
Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15(3), 473-497.
Guleria, S., & Kaur, S. (2014). Stevia: The herbal sugar substitute. Biotechnology Advances, 32(1), 71-81.
Zeng, X., Zhang, L., & Li, Y. (2017). Advances in stevia research: Botany, chemical composition, and medicinal properties. Journal of Medicinal Plants Research, 11(29), 476-485.
Sharma, M., & Singh, N. (2018). Stevia rebaudiana: A review on its cultivation and uses. Agricultural Sciences, 9(2), 131-138.
Pati, P. K., & Bhatia, S. (2007). Micropropagation of Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 43(4), 412-416.
LAMPIRAN A).Inokulasi Stevia
B). Sub kultur Stevia
