IV. Metode
4.1 Lokasi dan Waktu Praktikum
Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Biokimi dan Molekuler, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta dengan jangka waktu praktikum pada 23 Oktober 2023, 28 Oktober dan 31 Oktober 2023.
4.2 Alat dan Bahan yang Digunakan 4.2.1. Alat yang Digunakan
Alat yang dibutuhkan dalam praktikum ini antara lain adalah mikropipet 1 µL -10 µL, 100 µL-1000 µL;
tip 10 µL, 1000 µL; kolom kromatografi; SDS PAGE set; elektorforesis set (Titan Gel Chamber;
microtube/eppenderof 1,5 mL; kotak microtip; rak tabung reaksi; sterofoam ice bath; pipet tetes;
kertas saring; gelas beeker 50 mL, 100 mL, 1000 mL; gelas ukur 100 mL; pipet ukur 10 mL; tabung collective; kuvet plastic; spektrofotometer; vortex; corong kaca; pengaduk kaca; disposable wick;
aplikator; sisir well; marker protein; penggaris; .
4.2.2. Bahan yang Digunakan
Bahan yang dibutuhkan dalam praktikum ini antara lain adalah Protein albumin; darah + vitamin C;
NH2SO4 (ammoniam sulfat); BaCl2; matriks beads sephadex G100; es batu; larutan NaCl 0,1 N; NaOH;
CuSO4 5%; Tris-barbital-Sodium barbital; kertas saring; membran selulosa asetat; Ponceau S; Asam asetat 5%; SDS 10%; aklrilamid; aquades; asam asetat galsial; asam asetat 5%; larutan dapar; Tris pH 8,8 1M; Tris pH 6,8 1M; aquabidest; TEMED; APS 10%; commasie blue R-250; methanol; .
4.3 Prosedur Kerja
4.3.1. Presipitasi Ammonium Sulfat
Sebanyak 25 mL serum albumin ditambahkan 7,28 gr ammonium sulfat secara bertahap dan diaduk untuk didapatkan presipitasi 50% dari 0%. Setelah larut dilakukan penyaringan dengan memberi kertas saring dicorong dan didapatkan presipitat 50% dan filtrat 50%, kemudian filtrat hasil penyaringan dilakukan presipitasi ulang.
Sebanyak 10 mL fitlrat 50% ditambahkan 3,48 gr ammonium sulfat secara bertahap dan diaduk untuk didapatkan presipitasi 100% dari 50%. Setelah larut dilakukan penyaringan dengan memberi kertas saring dicorong dan didapatkan presipitat 100% dan filtrat 100%.
4.3.2. Pengujian biuret
Sebanyak 1 mL filtrat 50% dan 100% ditambahkan ke masing-masing tabung reaksi, kemudian pada tiap tabung ditambahkan 1 mL NaOH 0,1 M, 2 mL NaCl 0,dan 5 tetes CuSO4 dan dihomogenkan.
Larutan yang sudah homogen kemudian diamati.
Diambil sedikit presipitat 50% dan 100%, kemudian dimasukkan kedalam masing-masing tabung reaksi. Pada tiap tabung kemudian ditambahkan 1 mL NaOH 0,1 M, 2 mL NaCl 0,dan 5 tetes CuSO4 dan dihomogenkan. Larutan yang sudah homogen kemudian diamati.
4.3.3. Preparasi Sampel Dialysis
Presipitat dari presipitasi 50% dilarutkan dengan aquades sebanyak 10 mL, kemudian dihomogenkan.
Dilakukan juga pelarutan presipitat 100% dengan aquades sebanyak 5 mL kemudian dihomogenkan.
4.3.4. Dialysis
Selulosa membrane (tabung selofan) disiapkan dan dipotong ±10 cm dan 7 cm, kemudian direndam dalam buffer penyimpanan. Tabung selofan 10 cm dikunci dengan penjepit pada salah satu sisinya, kemudian dimasukkan larutan presipitat 50% pada sisi yang lain dan kunci dengan penjepit sisi yang belum terkunci. Tabung selofan 7 cm kemudian dikunci dengan penjepit pada satu sisinya, kemudian pada sisi lainnya dimasukkan larutan presipitat 100% dan dikunci dengan penjepit pada sisi yang belum terkunci.
4.3.5. Kromatografi Kolom Size Exclusion
Disiapkan bolom kromatografi yang sudah berisi matriks beads sepadex G100, kemudian diisi dengan eluen buffer NaCl dan tampung fraksi yang keluar pada tabung penampungan 1. Ketika eluen sudah sejajar dengan permukaan matriks, diberikan 3 tetes sampel darah-vit C, dan diberikan tambahan eluen hingga tingginya 1 cm diatas matriks. Setiap 3 tetes fraksi yang keluar ditampung pada tabung penampungan 2, dan dilanjutkan untuk 3 tetes setelahnya ditampung pada tabung penampungan 3 dan begitu seterusnya hingga warna pada kolom kembali menjadi bening/tidak berwarna. Selama proses fraksinasi eluen harus dijaga setinggi 1 cm diatas matriks agar proses pemisahan menjadi lebih bagus.
Hasil tiap fraksi kemudian ditambahkan 1 mL aquades dan dihomogenkan. Pada tiap fraksi diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan kedalam kuvet, kemudian dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada ʎ540 nm. Cata setiap hasil absorbansi dari tiap fraksinya dan kemudian dibuat kurva kromatogram.
4.3.6. Elektroforesis Selulosa Asetat Persiapan Sampel
Sebanyak 3 µL sampel dimasukkan ke dalam well, aplikator kemudian dimasukkan kemadalam well dan dilakukan resuspensi 4-5 kali. Sampel siap digunakan.
Preparasi Larutan Dapar Dalam Bak Elektroforesis
Sebanyak 100 mL larutan dapar dituangkan ke dalam bak elektroforesis bagian luar, kemudian bak larutan elektroforesis ditutup untuk penjenuhan larutan dapar.
Preparasi Disposable Wick
Disposable wick dibasahi dengan aquades dan siap digunakan.
Preparasi Membran Selulosa
Membran selulosa asetat direndam dalam larutan dapar selama 20 menit, kemudain diangkat serta dikeringkan dengan posisi selulosa pada bagian atas. Sampel yang berada pada aplikator kemudian diaplikasikan pada membrane asetat dengan menaik turunkan tip sebanyak 3-4 x.
Elektroforesis Selulosa Asetat
Bak elektroforesis kemudian dibuka dan dimasukkan wick pada dasar bak, kemudian dimasukkan membrane selulosa asetat yang sudah dipreparasi dengan selulosa menghadap bawah. Diberikan pemberat agar selulosa dapat berinteraksi lansung dengan wick. Bak elektroforesis ditutup 30 detik untuk melakukan ekilibrasi membrane selulosa asetat. Proses ini harus dilakukan tidak boleh lebih dari 5 menit sejak membrane selulosa dimasukkan ke dalam bak elektroforesis dan dirunning dengan power dengan daya 180 Volt selama 25 menit.
Staining Selulosa asetat
Membran selulosa yang sudah dielektroforesis kemudian dikeluarkan dan dilakukan staining dengan cara direndam pada 40-50 mL pewarna ponceau selama 6 menit. Setelah itu dilakukan destaining menggunakan asam asetat 5% sebanyak 3 kali masing-masing selama 2 menit sampai membrane selulosa asetat menjadi putih. Membran selulosa asetat kemudian dikeringkan dan dilakukan pengamatan.
Pembacaan Elektroforesis Selulosa Asetat Dibuat
4.3.7. SDS PAGE
Pembuatan Separating gel
Stok akrilamid sebanyak 3,125 ml dimasukan ke dalam gelas beeker, kemudian ditambahkan Tris pH 8,8 1M sebanyak 2,75 ml lalu ditutup dan digoyang perlahan. Ditambahkan aquabidest sebanyak 1,505 ml lalu ditutup dan digoyang perlahan. Ditambahkan SDS 10% sebanyak 75 μl, kemudian ditutup dan digoyang perlahan. Ditambahkan TEMED sebanyak 6,25 μl kemudian ditutup dan digoyang perlahan.
Ditambahkan APS 10% sebanyak 75 μl kemudian ditutup dan digoyang perlahan. Campuran segera dipindahkan kedalam plate pembentuk gel dengan mikropipet 1 ml sampai batas yang ada (dijaga supaya tidak terbentuk gelembung udara). Secara perlahan, akuades ditambahkan keatas larutan gel agar permukaan gel menjadi rata. Gel kemudian dibiarkan sampai memadat dan siap ditambahkan separating stacking gel.
Pembuatan Stacking Gel
akrilamid 30% sebanyak 0,45 ml dimasukan ke dalam gelas beeker, kemudian ditambahkan Tris pH 6,8 1M sebanyak 0,38 ml kemudian ditutup dan digoyang perlahan. Dimasukkan aquabidest sebanyak 2,11 ml kemudian ditutup dan digoyang perlahan. Dimasukkan SDS 10% sebanyak 30 μl kemudian ditutup, dan digoyang perlahan. Dimasukkan TEMED sebanyak 5 μl kemudian ditutup dan digoyang perlahan.
Dimasukkan APS 10% sebanyak 30 μl kemudian ditutup, dan digoyang perlahan. Campuran gel kemudian segera dipindahkan kedalam plate pembentuk gel yang sudah berisi separaing gel padat dengan mikropipet 1 ml sampai batas yang ada (dijaga supaya tidak terbentuk gelembung udara).
Ditambahan sisir pembentuk well dibagian atas gel dan gel dibiarkan memadat. Ketika sudah memadat sisir diambil dan gel siap digunakan.
Memasukan sampel dan marker pada well gel dan running sampel
Plate yang sudah berisi gel dimasukan dalam chamber elektroforesis, kemudian dituangkan running buffer sampai bagian atas dan bawah gel terendam. Bila terbentuk gelembung udara pada dasar gel atau diantara well sampel, perlu dihilangkan. Protein sampel (hasil dialysis) dimasukkan ke well gel sebanyak xx μl. Dimasukkan Marker ke well sebanyak 5 μl (digunakan marker xxx). Setelah semua sudah siap, perangkat elektroforesis dihubungkan dengan power supply dan diatur sesuai kebutuhan.
Setelah selesai, gel diambil dari plate dan dilakukan staining-destaining.
Staining dan Destaining
Dibuat larutan Staining 1 L yang terdiri dari Commassie Blue R-250 1 gram. Methanol 450 ml, Aquades 450 ml, dan Asam Asetat Glasial 100 ml, kemudian dihomogenkan dan disimpan. Dibuat larutan destaining 1 L yang terdiri dari Methanol 100 ml, Asam asetat glasial 100 ml, dan Aquades 800 ml, kemudian dihomogenkan dan disimpan. Gel hasil elektroforesis SDS-PAGE kemudian direndam dalam larutan staining secukupnya sambil digoyang ±15 menit, Setelah itu larutan staining dikembalikan pada wadahnya. Gel kemudian dicuci beberapa kali lalu direndam dalam larutan destaining secukupnya sambil digoyang hingga band protein terlihat jelas. Jika diperlukan dapat dilakukan penggantian larutan destaining.
Pembacaan Hasil SDS Dibuat
