Prinsip dan Penerapannya

(1)

ISOLASI MIKROBA

Hotlina Nainggolan

(2)

Outline

• Media tumbuh mikroba/bakteri

• Tehnik isolasi bakteri

(3)

Media???

substansi yang memiliki komposisi berisi nutrisi

tertentu yang berguna untuk pertumbuhan

bakteri.

(4)

Media/Medium Pertumbuhan

• Formulasi media  sifat dan karakteristik mikroorganisme

• Fungsi media :

– Sarana pertumbuhan mikroorganisme (memperbanyak m.o)

– Mengetahui sifat fisiologis mikroorganisme

– Menghitung jumlah sel mikroorganisme

(5)

Fungsi Media

• Untuk pembiakan bakteri

• Mengirim dan menyimpan bakteri

• Untuk isolasi

• Mempelajari sifat koloni

• Pertumbuhan mikrobiologi

• Mempelajari sifat biokimia

• Mempelajari sifat fisiologis

• Perhitungan jumlah mikroba

(6)

Persyaratan Media

Tekanan Osmosis pH

Temperatur

Sterilitas

Komposisi

(7)

Komposisi

• Komposisi media secara umum  karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, vitamin dan bahan penunjang lain seperti ekstrak daging atau ragi.

• Vitamin yang digunakan adalah vitamin B, B6, C, dan B komplek.

Vitamin digunakan untuk mengaktifkan enzim.

• NaCl digunakan untuk menaikkan tekanan osmosis dan keseimbangan fisikokimia sel bakteri disamping digunakan sebagai elemen mikro.

(8)

Komposisi (lanjutan)

1. Bahan Pemadat:

a. Agar  sulit didegradasi oleh mikroba pada umumnya dan mencair pada suhu 45

^o

C

b. Gelatin



polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen



banyak mikroba yang dapat mendegradasi atau menguraikan gelatin dibanding agar.

c. Silica gel 

natrium silikat



sebagai pemadat media bagi mikroba autotrof obligat

2. Air (akuades) sebagai pelarut bahan pembuatan media

3. Komposisi sebagai penyubur



darah, serum, dan logam dari

garam anorganik sebagai trace elemen atau elemen mikro

seperti Ca, Mn, Na, Mg, Zn, Co, Fe, dan Cu.

(9)

(10)

Komposisi (lanjutan)

• Bahan tambahan lain  antimikrobia (antibakteri dan antifungi)  untuk menghambat bakteri atau jamur yang tidak diinginkan

(nontarget) serta kontaminan

• Bahan penghambat lain  bile salt dan natrium selenit.

• Senyawa indikator  untuk mendeteksi adanya perubahan warna seperti media pada uji fermentasi karbohidrat  phenol red, neutral red, dan bromthymol blue.

(11)

• Tekenan osmosis berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri

• Hipertonis  plasmolisis - mengkerut

• Hipotonis  lisis akibat pembengkakan sel

• Isotonis  tekanan osmosis yang tepat untuk pertumbuhan bakteri adalah

Tekanan Osmosis

(12)

(13)

• pH sekitar netral dan pH 4,6 – 7,0 merupakan kondisi optimum untuk pertumbuhan bakteri

• Mempengaruhi aktivitas enzim

• pH rendah  membran sel jenuh ion hidrogen  transport membran terbatasi

• Keracunan yang terjadi pada pH rendah  karena substansi asam yang tidak terurai meresap ke dalam sel  terjadi ionisasi dan pH sel

berubah.

• Perubahan menyebabkan proses pengiriman asam-asam amino dari RNA terhambat sehingga menghambat pertumbuhan dan bahkan dapat membunuh mikroba.

• bakteri tidak tumbuh dalam kondisi terlalu basa, kecuali  Vibrio cholerae

pH

(14)

• Media dengan pH 5 maka pertumbuhan didominasi oleh jamur, tetapi apabila pH media 8 maka pertumbuhan didominasi oleh bakteri

• DNA is acid labile, and RNA is Alkaline labile

• Kelompok bakteri berdasarkan pH

1.asidofil  kelompok mikroba yang dapat hidup tumbuh baik pada pH 2,0-5,0

2.mesofil (neutrofil)  kelompok mikroba yang dapat hidup pada pH 5,5-8,0

3.alkalifil  kelompok mikroba yang dapat hidup pada pH 8,4-9,5

pH (lanjutan...)

(15)

(16)

Temperature

(17)

(18)

Sterilitas

(19)

Anaerobic chamber

Anaerobic jar

(20)

Jenis Media Kultur yang umum dipakai untuk isolasi bakteri

• Eosin Methylene Blue (EMB)

– Secara umum , media isolasi untuk

membedakan bakteri Enterobacteriaceae

– Indicators: aniline dyes (eosin and methylene blue)

– Inhibitors: Eosin, methylene blue (inhibit gm (+) bacteria) – Media Eosin Methylene Blue Agar, mempunyai keistimewaan

mengandung laktosa dan berfungsi untuk membedakan mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella.

– Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna

(21)

– Mac Conkey Agar (MCA) adalah suatu jenis media yang digunakan untuk identifikasi mikroorganisme

– Merupakan medium kultur yang dirancang untuk tumbuhnya bakteri gram negative

– Indicator: phenol red

– Inhibitors: bile salts, crystal violet Carbohydrate source: lactose – Carbohydrate source: lactose LF= pink-red NLF= clear/colorless – MacConkey Agar is recommended for selective isolation of

Escherichia coli from pharmaceutical products

MacConkey agar

(22)

Lactose broth

• Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu

– Sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada

umumnya.

• Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri.

• Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform.

(23)

Nutrient Agar

• Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy.

• NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif dalam artian mikroorganisme heterotrof.

• Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton dan agar.

• Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan untuk

membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni.

• It is solid at 37°C. 2.5% agar is added in nutrient broth. It is heated at 100°C to melt the agar and then cooled.

(24)

Nutrient Broth

• Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair.

• Media sama dengan nutrient agar.

(25)

MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar)

• MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann Rogosa dan Shape (1960)

• Untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus

• mengandung polysorbat, asetat, magnesium dan mangan yang diketahui untuk bertindak sebagai faktor pertumbuhan bagi Lactobacillus.

(26)

Trypticase Soy Broth (TSB)

• TSB adalah media broth untuk isolasi bakteri dan penumbuhan bermacam mikroorganisme.

• Media ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri dari specimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas bakteri pathogen.

• Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang mengandung asam amino dan substansi nitrogen lainnya sehingga membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme

(27)

Plate Count Agar (PCA)

• PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan.

• Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang memiliki asam amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks.

(28)

Potato Dextrose Agar (PDA)

• PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang.

• Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau produk makanan.

• PDA cocok untuk pertumbuhan Jamur

• PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk

pertumbuhan kapangdan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri.

(29)

Penggolongan Media

Konsistensi

Susunan/ Komponen yang digunakan

Fungsinya

(30)

Cair

Semi Solid / Semi Padat Solid / Padat

Konsistensi

(31)

1. MEDIUM CAIR

• Media tanpa tambahan zat pemadat

• Media dibuat dengan bahan alami yang sebelumnya harus diekstrak dari beberapa tempat/bahan

• Media alami lebih sukar dilakukan maka sekarang terdapat dalam bentuk serbuk siap pakai,

• Contoh : NB (nutrient broth), PGY (pepton glucose

yeast extract), MEB (malt extract broth), dan TSB

(trypticase soy broth).

(32)

2. MEDIUM PADAT

• Dari medium cair bisa dibuat menjadi medium padat yaitu dengan menambahkan agar dalam jumlah

tertentu yaitu sekitar 15 gram

• Penambahan zat padat 50%, dipergunakan untuk

pertumbuhan mikroba yang banyak memerlukan air, anaerobik atau fakultatif

• Contoh : Nutrient Agar, Plate Count Agar (Potato

Dextrose Agar)

(33)

3. MEDIUM SEMI PADAT

• Mirip dengan medium padat yang dalam penyiapannya harus dilakukan pemanasan,

• Menggunakan agar namun jumlah agar yang digunakan hanya setengah dari medium padat

• Media dengan penambahan zat pemadat  media umum pertumbuhan bakteri heterotrof

• misalnya bila pada medium padat ditambahkan agar

sebanyak 15 gram maka dalam medium semi padat

ditambahkan agar hanya sebanyak 7 gram

(34)

Mac Conkey BAP Simmons Citrat TSIA

SIM

(35)

Susunan/ Komponen yang digunakan

Komposisi utama dari bahan alami, komposisinya

tidak diketahui secara pasti dan biasanya mengandung ekstrak tanaman atau hewan

Contoh: Kentang, Tauge, Susu, Kaldu Daging

Komponen penyusun dari bahan alami dan bahan sintetis (buatan)

Contoh : Kaldu Nutrient

Komponen penyusun dari bahan sintetik (senyawa kimia), dan komposisinya diketahui secara pasti

Contoh: MC BAP, TSIA, SIM

ALAMI

SEMI SINTETIS

SINTETIS

(36)

Ekstrak Tauge Nutrient Agar KIT

(37)

Komponen Penyusun Media

• Bahan dasar (air, bahan pemadat)

• Nutrien

– Makronutrien (C, H, O, N) – Mesonutrien (Mg, P, S)

– Mikronutrien/Trace elemen (Fe, Cu, Zn, Mo) – Vitamin

• Bahan Tambahan

– Indikator pH (asam basa)

– Antibiotik  menghambat m.o lain

(38)

AIR

• Fungsi :

– Sebagai pelarut media

– Sebagai alat transportasi nutrisi bagi sel m.o

• Air yang digunakan sebaiknya air suling

• AIR SADAH  kurang baik

– Mengandung ion Ca dan Mg terlalu tinggi – Dapat membentuk endapan fosfat dan

Magnesium fosfat

(39)

BAHAN PEMADAT MEDIA

• Agar

– Berasal dari rumput laut – Sulit didegradasi oleh m.o – Mencair pada suhu 45

⁰

C

• Gelatin

– Polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen – Banyak m.o yang dapat menguraikannya

• Silika Gel

– Mengandung natrium silikat

– Digunakan untuk m.o autotrof obligat

(40)

Penyusun Sel Mikroorganisme

Unsur Fungsi Fisiologi Berat Kering

(%)

Hidrogen Penyusun senyawa organik 8

Oksigen Penyusun senyawa organik 20

Karbon Penyusun senyawa organik 50

Nitrogen Penyusun protein, asam nukleat, dan koenzim 14

Sulfur Penyusun protein dan beberapa koenzim 1

Fosfor Penyusun asam nukleat, fosfolipida, dan koenzim 3 Magnesium Kofaktor pada sejumlah reaksi enzim (ATP) 0.5

Mangan Kofaktor beberapa enzim 0.1

Kalsium Kofaktor beberapa enzim (protease) 0.5

Besi Penyusun sitokrom, kofaktor enzim 0.2

Kobalt Penyusun vitamin B12 0.03

Tembaga, Seng, Mo Penyusun beberapa enzim 0.03

(41)

Sumber Karbon (C)

• Fungsi :

– Sumber energi (M.O Aerob)

– Pertumbuhan, pembentukan produk (M.O anaerob)

• Sumber Karbon:

– Molase

– Whey Susu

– Sulphite Waste Liquor – Pati

– Hidrokarbon

(42)

Molase

• Limbah industri gula

• Kandungan molase

– 32% sukrosa, 14% glukosa, 16% fruktosa (Gula) – Biotin, Thiamin, Asam pantotenat (Vitamin) – Fosfor, Sulfur

• Kandungan gula bisa langsung digunakan tanpa harus dihidrolisis

(43)

Whey Susu

Komponen Jumlah (g/L)

Laktosa 45 – 50

Protein 7 – 9

Senyawa Nitrogen terlarut 1,5

Lipid 1 – 2

Garam-garam mineral 6 – 8

Berat kering 63 – 70

Diperoleh dari Limbah pembuatan keju

Komposisi whey susu (g/L)

(44)

Sulphite Waste Liquor

• Berasal dari limbah industri kertas  hemiselulosa dari kayu

• Komposisi SWL tergantung dari JENIS KAYU

• Selulosa kayu  mengandung 65 – 85 % gula

• Selulosa harus DIHIDROLISIS terlebih dahulu

• SWL sering digunakan sebagai media bagi Tricoderma viride dan Cellulomonas sp.

(45)

PATI

• Berasal dari umbi-umbian (kentang)

• Merupakan sumber karbon murah

• Memerlukan proses hidrolisis oleh enzim amilase

(46)

Hidrokarbon

• Sukar didegradasi oleh mikroorganisme

• Sebagai sumber karbon dan energi

• Bakteri dan Kapang yang mampu tumbuh pada media ini

• Memerlukan oksigen yang lebih banyak

(47)

Sumber Nitrogen

• Sumber energi :

– Nitrogen anorganik – Ammonia

– Garam-garam ammonium

• Khamir  tidak dapat mereduksi nitrat menjadi ammonium

• Industri antibiotik  corn steep liquor (limbah pati jagung)

• CSL  7 – 8 % nitrogen, nukleotida dan

vitamin

(48)

Sumber Nitrogen Murah

• Tepung kacang kedelai

• Tepung ikan

• Tepung kacang tanah

• Malt barley

• Whey Susu

(49)

Dasar Kriteria Penggunaan Nitrogen sebagai Faktor Pembatas

• Yang dibutuhkan hanya satu jenis asam amino saja

• Sebagian besar kapang dapat menggunakan ammonium sebagai satu-satunya sumber nitrogen

• Beberapa mikroorganisme mampu menggunakan nitrat

sebagai nitrogen dengan cara mengubahnya menjadi

ammonium

(50)

SUMBER MINERAL

Kobalt

– Konsentrasi optimum 10^-12 g/ml

– Biasanya terdapat pada garam-garam besi

– Fungsinya : memenuhi kebutuhan mineral di dalam media

Fosfor dan Sulfur

– Dibutuhkan dalam bentuk Fosfat dan Sulfur – Konsentrasi yang dibutuhkan 0,5 g/L

– Fungsi : membentuk gula fosfat, fosfolipida dan ATP Besi

• Konsentrasi yang dibutuhkan 0,03 – 0,3 g/L

• Dibutuhkan dalam fermentasi AEROB

• Fungsi : sebagai dasar transport molekul

(51)

Bahan kompleks pembuatan media

• Ekstrak daging sapi  mengandung substansi jaringan hewan yang dapat larut dalam air; meliputi karbohidrat, senyawa nitrogen organik, vitamin yang dapat larut dalam air, dan garam.

• Pepton  sumber utama nitrogen organik; mengandung vitamin dan kadang karbohidrat

• Agar  sebagai bahan pemadat media

• Ekstrak khamir  sumber yang amat kaya vitamin B; mengandung nitrogen organik dan senyawa karbon (Pelczar & Chan, 1986).

(52)

Media Basal/ Umum (Universal) Media Pengaya (Enrichment)

Media Selektif

Media Differensial

Media Penguji (Elektif) Media Perhitungan

Jenis Media

1

2

3

4

5

6

(53)

Media Basal/ Umum (Universal)

digunakan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan satu atau lebih kelompok mikroba secara umum

Contoh: Nutrien Agar, Blood Agar Plate

Media Pengaya (Enrichment)

Dipergunakan dengan maksud memberikan

kesempatan terhadap suatu jenis atau kelompok

mikroba untuk tumbuh dan berkembang lebih cepat dari jenis/kelompok lainnya yang sama-sama berada di dalam satu bahan.

Contoh : KPD untuk bakteri Gram (+) Coccus

(54)

Nutrient Agar

Nutrient Broth, Nutrient Agar Slant, Nutrient Semi Solid

(55)

Media Selektif

Media yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau

lebih jenis mikroba tertentu tetapi akan menghambat atau mematikan untuk jenis-jenis lainnya

Contoh : media SS (Salmonella-Shigella), MacConkey Agar

Media Differensial

Media yang digunakan untuk membedakan bentuk dan karakter koloni bakteri yang tumbuh. Beberapa

bakteri dapat tumbuh di dalam media ini, tetapi hanya beberapa jenis saja yang mempunyai penampilan

pertumbuhan yang khas. Media ini berguna untuk

isolasi dan identifikasi bakteri. Contoh: EMB untuk

Escherichia coli

(56)

Salmonella Shigella Agar

Mac Conkey

(57)

Media Penguji (Elektif)

media yang dipergunakan untuk pengujian senyawa atau benda tertentu dengan bantuan mikroba. Media ini mengandung senyawa dasar untuk pertumbuhan dan perkembang biakan mikroba juga ditambahkan sejumlah senyawa tertentu yang akan diuji

Contoh: media penguji vitamin, asam amino, antibiotika, residu pestisida.

Media Perhitungan

Dipergunakan untuk menghitung jumlah mikroba pada

suatu bahan. Media ini dapat berbetuk media umum,

media selektif, media differensial atau media penguji

Contoh: PCA

(58)

Media untuk Bakteri Anaerob

• Beberapa bahan kimia dapat di

tambahkan kedalam media, tujuannya agar mengurangi kandungan oksigen

• Bahan tersebut meliputi : – Na thioglikolat

– Cystcine

– Asam askobat

(59)

Mueller Hinton Agar

Plate Count Agar

Types of culture media used in microbiology

Agar

(60)

Pembuatan Media

KIT

Meramu

(61)

Pembuatan Media

Media Plate Media Tabung

(62)

Pembuatan Media Plate

1 • Penimbangan 2 • Pelarutan

3 • Penyeterilan 4 • Penuangan

5 • Pewadahan/Pembungkusan

(63)

Pembuatan Media Tabung

1 • Penimbangan 2 • Pelarutan

3 • Penuangan 4 • Penyeterilan

5 • Pewadahan/Pembungkusan

(64)

Persiapan / Pembuatan media

(65)

(66)

(67)

(68)

Tehnik Pembuatan Media

(69)

TEHNIK ISOLASI

MIKROBA/BAKTERIA

(70)

Sumber alami : – tanah, – air,

– produk pangan, – limbah,

– darah,

– cairan biologis dll)

Lembaga koleksi kultur  jumlah dan jenis mikroba sangat beragam Mikroba yang telah diperoleh harus disimpan dengan teknik

penyimpanan waktu yang panjang.

SUMBER MIKROBA

(71)

• Isolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari campuran biakan mikroba di alam

• Sebelum mengisolasi, harus diketahui : – mikroba apa yang akan diisolasi

– Habitat

– menentukan sampel apa yang akan diambil sumber, lokasi dan media apa yang akan digunakan

ISOLASI

(72)

 Sampel berupa padatan (tanah, feses, produk2 pangan, dll) : – Diambil dengan menggunakan spatula atau pinset steril – Penyimpanan menggunakan kantong plastik steril

 Sampel berupa cairan atau semi cair : – Diambil menggunakan pipet steril

– Penyimpanan contoh menggunakan botol atau tabung polipropilen steril

 Sampel dibawa ke laboratorium (bila jarak jauh, gunakan es batu pada wadah penyimpanan)

 Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu dingin (kulkas)

Metode Pengambilan Sampel

(73)

Tahapan:

1. Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate) 2. Penuangan (Pour-plate)

3. Kultur Yang Diperkaya (Enrichment Culture) 4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution)

5. Isolasi Sel Tunggal

TEHNIK ISOLASI

(74)

Umumnya digunakan untuk memperoleh kultur murni mikroba yang tidak berhasil ditumbuhkan pada media padat dan hanya dapat tumbuh pada media cair

Pengenceran berseri dg larutan garam fisiologis (0,85 %)

Penggoresan (jarum Ose) atau penyebaran (batang gelas) pada media agar  koloni tumbuh menyebar

Penggoresan dilakukan berulang, sehingga Diperoleh kultur murni

1 sel1 koloni

Sampel

1. Teknik Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate)

(75)

Metode Penggoresan

Goresan langsung Goresan radian

Goresan Kuadran

Dengan penggoresan terjadi pengenceran sel secara gradien Cara Penggoresan Kultur pada Agar Cawan ;

1. Goresan Langsung 2. Goresan Kuadran 3. Goresan Radian

(76)

Teknik Penyebaran (Spread-plate)

Batang gelas

• Teknik ini merupakan prosedur rutin untuk isolasi bakteri & menggunakan peralatan yang sederhana

• Kelemahan : hanya sejumlah kecil contoh yang dapat digunakan/disebarkan pada media

• Dua sel dapat bergabung menjadi membentuk satu koloni

Contoh : bakteri yang menghasilkan lendir  pencegahan dengan menambahkan deterjen

(77)

2. Teknik Penuangan (Pour-plate)

• Prinsip : pengenceran sampel dengan media agar cair (+/- 45⁰C) tabung reaksi, supaya distribusi sampel merata 

dituang ke petri dish & dibiarkan mengeras pada suhu ruang, lalu diinokulasi

• Tidak cocok untuk isolasi mikroba psikrofilik

(78)

Sampel +/- 1 g)

A

B

C Suspensi Bakteri

1 ml

Agar cair

Pengenceran

Penuangan Dibiarkan mengeras

. . . . . . ...

…..

. . . . . . . . . . . .

..

. .

Diperiksa

Koloni terisolasi

Media agar miring

Tahap I Tahap II Tahap III

Teknik Penuangan (Pour-plate)

A

B

C Inkubasi

(79)

• Metode Penuangan  Pengamatan dapat dilakukan secara kualitatif (morfologi) & kuantitatif (jumlah sel mikroba)

• Teknik penggoresan/penyebaran dan penuangan ini lebih efektif dengan menggunakan media selektif/ diferensial atau dengan perlakuan khusus sebelum penanaman pada agar cawan Contoh : Isolasi bakteri pembentuk spora  terlebih dulu diberi perlakuan pemanasan s.d 85⁰C selama 5 menit

• Media Selektif :

- Media dg NaCl 7,5 % unt mengisolasi Staphylococcus dari faeces - Media BGLBB (brilliant green lactose bile broth) : Salmonellae

• Media Diferensial :

- Media agar EMB (eosin-methylene blue agar)  terbentuk koloni berbeda & mudah dikenali

E. coli : hijau kehitaman/hijau metalik

Aerobacter aerogenes : tengah ungu tua/coklat, tepi ungu muda

(80)

3. Kultur Yang Diperkaya

• Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat fisiologis yang khusus (jumlah kecil

& tumbuh lambat)

• Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi inkubasi tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri tertentu

1 2 3 4

(+) (-)

Verifikasi

(81)

4. Teknik Pengenceran Berseri (Serial-dilution)

• Digunakan jika mikroba dlm kultur campuran terdapat dalam jumlah lebih besar dari pada mikroba lain.

Contoh : S. lactis dalam susu asam

• Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya mengandung 1 galur mikroba

• Perlu dicek kemurnian kultur

(82)

Serial-dilution Method

(83)

5. Teknik Isolasi Sel Tunggal

a. Metode Mikromanipulator

• Menggunakan alat Mikromanipulator yang digabung dengan mikroskop untuk mengambil suatu sel mikroba tunggal dari sampel

• Dengan Mikromanipulator, operator dapat mengontrol gerakan mikropipet (tabung kapiler) di bawah lensa obyek, sehingga dapat diambil sel tunggal

& dipindahkan ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke media yang sesuai

• Lebih cepat, namun kelemahannya : - alat mahal

- operator harus trampil

(84)

Micromanipulator

http://eatingforaquadrillion.blogspot.com/2011/07/how-to-get-single-cell.html

(85)

Micromanipulator

(86)

b. Metode Kapiler untuk mendapatkan sel tunggal mikroba

 Beberapa tetes media yang mengandung mikroba, ditempatkan pada penutup gelas obyek steril menggunakan pipet kapiler steril.

 Dengan menggunakan mikroskop, cari tetesan yang mengandung hanya 1 mikroba. Tetesan tsb dipindahkan dengan pipet kapiler steril ke media

segar  mikroba tunggal yang berada pada tetesan mulai berbiak untuk menghasilkan kultur murni.

(87)

 Setelah diasumsikan berhasil mengisolasi kultur murni  perlu dilakukan pengujian dengan kriteria sbb. :

(Kultur murni : sel-sel mikroba yang ada  sejenis)

– Mikroba tampak mirip secara mikroskopis dan menunjukkan hasil pewarnaan yang sama

– Pada saat ditanam pada agar cawan, semua koloni menunjukkan kesamaan.

– Hasil penggoresan seragam

– Beberapa koloni isolat mempunyai penampakan / karakteristik identik, contoh memfermentasi gula yang sama

Pembuktian Kemurnian Kultur

(88)

Tehnik Aseptik Isolasi Kultur

(89)

Tehnik Penggoresan Kultur Bakteri

(90)

TERIMA KASIH