12
Cloning and Recombinant Expression of EspA as a Virulence Factor of E. coli O157:H7
Mostafa Bakhshi1, Firouz Ebrahimi2, Jamil Zargan2, Shahram Nazarian2, Vahideh Sheikhzade3
1 PhD Student in Nanobiotechnoligy, Biology Research Center, Faculty of Basic Science, Imam Hossein University, Tehran, Iran 2 Assistant Professor, Department of Biology, Faculty of Basic Science, Imam Hossein University, Tehran, Iran
3 MSc in Food Science and Technology, Islamic Azad University, Quchan Branch, Quchan, Iran
(Received June 18, 2014 ; Accepted September 21, 2014)
Abstract
Background and purpose: E. coli O157:H7 is one of the intestinal pathogens that mediate
serious damages in gastrointestinal track. The bacterium attachment in large intestine is mediated via some colonization factors mainly Type III secretion proteins that are involved in this process. Among these factors, EspA protein plays an important role in system foundation. The aim of this study was cloning and recombinant expression of EspA in order to achieve a stable construct for the protein production and using it as a vaccine candidate in future investigations.
Materials and methods: Specific primers were designed by Oligo 7 software and gene amplification was performed by PCR technique on template DNA. Enzymatic digestion and ligation were done by restriction enzymes and T4 ligase enzyme, respectively. Recombinant expression of EspA was induced by IPTG following cloning confirmation. Protein confirmation was done by Western blotting analyze.
Results: Results showed that cloning of espA in pET28a (+) vector was performed in an
appropriate mode between expected sites. Also, EspA had good and remarkable recombinant expression after induction and the antibody used in western blotting could recognize EspA on nitrocellulose membrane.
Conclusion: Stable recombinant construct containing espA gene was fabricated that showed appropriate recombinant expression of protein. So, this protein could be used in future studies as a vaccine candidate against E. coli O157:H7.
Keywords: Intestinal pathogen, espA gene cloning, Recombinant expression, Western blotting
J Mazandaran Univ Med Sci 2014; 24(117): 12-20 (Persian).
هرود مرﺎﻬﭼ و ﺖﺴﻴﺑ هرﺎﻤﺷ
117 ﺮﻬﻣ لﺎﺳ 1393 ) 20 - 12 (
زﺎﺳ نﺎﺴﻤﻫ ي
ﺑ و ﻴ نﺎ ﻛﺮﺗﻮﻧ ﻴ
ﺐ ﺑ رﻮﺘﻛﺎﻓ ﻴ
رﺎﻤ ﻳ اﺰ ي
EspA
ﺮﺘﻛﺎﺑ ﻪﺑ طﻮﺑﺮﻣ ي
E. coliO157:H7
ﻔﻄﺼﻣ ﻲ ﺸﺨﺑ
1ﻲ
ﻓ ﻴ زوﺮ ﻫاﺮﺑا ﻴ ﻤ
2ﻲ
ﻤﺟ ﻴ ﻞ نﺎﮔرز 2
ﺮﻈﻧ ماﺮﻬﺷ ﻳ
2نﺎ
ﺣو ﻴ هﺪ ﺷ ﻴ ﺦ
3هداز
هﺪﻴﻜﭼ
ﻪﻘﺑﺎﺳ فﺪﻫ و : يﺮﺘﻛﺎﺑ
E. coliO157:H7
نژﻮﺗﺎﭘ ءﺰﺟ هدور يﺎﻫ
ﻲﻣ يا ﺐﻴﺳآ ﻪﻛ ﺪﺷﺎﺑ شراﻮـﮔ هﺎﮕﺘـﺳد رد يﺪـﺟ يﺎـﻫ
ﻲﻣ ﺪﻳﺪﭘ دروآ . گرﺰﺑ هدور رد يﺮﺘﻛﺎﺑ لﺎﺼﺗا ﻪﻄﺳاو ﻪﺑ
ﻚﻳ يرﺎﻤﻴﺑ يﺎﻫرﻮﺘﻛﺎﻓ زا يﺮﺳ از
ﻲﻣ ترﻮﺻ
ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ ﻪـﻛ دﺮﻳﺬﭘ يﺎـﻫ
عﻮﻧ ﻲﺤﺷﺮﺗ 3
ﻪﺘﺳد ﺎﻫرﻮﺘﻛﺎﻓ ﻦﻳا ءﺰﺟ ﺰﻴﻧ ﻲﻣ يﺪﻨﺑ
ﺪﻧﻮﺷ . ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﻦﻴﺑ رد ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ ،رﻮﻛﺬـﻣ ﻢﺘﺴﻴﺳ رد دﻮﺟﻮﻣ يﺎﻫ
ﺶـﻘﻧEspA
هﺮﻜﻴﭘ رد ار ﻢﻬﻣ و ﻲﻠﺻا ﻞﻜﺷ
ﮔ ﻲﻣ ﺎﻔﻳا ﻢﺘﺴﻴﺳ ﻦﻳا يﺮﻴ ﺪﻨﻛ
. نﺎﺴﻤﻫ ﻖﻴﻘﺤﺗ ﻦﻳا مﺎﺠﻧا زا فﺪﻫ
ﻞﻜـﺷ ﻪـﺑ ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﻦﻳا نﺎﻴﺑ و يزﺎﺳ
ﻧ ﻲﺳرﺮﺑ رﻮﻈﻨﻣ ﻪﺑ نآ ﺪﻴﻟﻮﺗ ياﺮﺑ راﺪﻳﺎﭘ ﻊﺒﻨﻣ و رﺎﺘﺧﺎﺳ ﻚﻳ ﻪﺑ ﻲﺑﺎﻴﺘﺳد ﺖﻬﺟ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮ ﻲﻣ ﻦﺴﻛاو ﺪﻳﺪﻧﺎﻛ ناﻮﻨﻋ ﻪﺑ هﺪﻨﻳآ يﺎﻫ
ﺪﺷﺎﺑ .
شور و داﻮﻣ ﺎﻫ
: نژ ياﺮـﺑ ﻲﺻﺎﺼﺘﺧا ﺮﻤﻳاﺮﭘ ﻲﺣاﺮﻃ espA
مﺮـﻧ ﻂـﺳﻮﺗ راﺰـﻓا
Oligo 7
ﻂـﺳﻮﺗ نژ ﺮـﻴﺜﻜﺗ و ﺪـﺷ مﺎـﺠﻧا
ﺶﻨﻛاو يور زاPCR
ﺖﻓﺮﻳﺬﭘ ترﻮﺻ ﻮﮕﻟاDNA
. ﻨﻛاو ﺶ ﻲﻧﺎﻴﺑ رﻮﺘﻛو نورد نژ قﺎﺤﻟا و ﻲﻤﻳﺰﻧآ ﻢﻀﻫ يﺎﻫ
pET28a(+)
ﺪﺷ مﺎﺠﻧا . ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ ﺐـﻴﻛﺮﺗﻮﻧ نﺎﻴﺑ ،ﺮﻈﻧ درﻮﻣ نژ يزﺎﺳ نﺎﺴﻤﻫ ﺪﻴﻳﺄﺗ زا ﺲﭘ ﻲﻋﻮﻨـﺼﻣ ﺮﮔءﺎـﻘﻟا زا هدﺎﻔﺘـﺳا ﺎـﺑEspA
IPTG
ﺖﻓﺮﻳﺬﭘ ترﻮﺻ .
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﺪﻴﻳﺄﺗ ياﺮﺑ ﺰﻴﻧ تﻼﺑ نﺮﺘﺳو ﺰﻴﻟﺎﻧآ ﺖﻓﺮﻳﺬﭘ ترﻮﺻEspA
.
ﻪﺘﻓﺎﻳ ﺎﻫ : نژ يزﺎﺳ نﺎﺴﻤﻫ رﻮﺘﻛو نوردespA
pET28a(+)
ﺖﻓﺮﻳﺬﭘ ترﻮﺻ ﻪﻃﻮﺑﺮﻣ يﺎﻫ هﺎﮕﻳﺎﺟ ﻦﻴﺑ ﺐﺳﺎﻨﻣ ﻞﻜﺷ ﻪﺑ
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ و داد نﺎﺸﻧ ار ﻲﻬﺟﻮﺗ ﻞﺑﺎﻗ و ﺐﺳﺎﻨﻣ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧ نﺎﻴﺑ ،ﺎﻘﻟا زا ﺲﭘEspA
. ﻲﺘﻧآ ﺰـﻴﻧ تﻼـﺑ نﺮﺘﺳو رد هدﺎﻔﺘﺳا درﻮﻣ يدﺎﺑ
ﻲﺒﺳﺎﻨﻣ ﻞﻜﺷ ﻪﺑ ﺖﺴﻧاﻮﺗ ﺪﻨﻛ ﻲﻳﺎﺳﺎﻨﺷ ارEspA
.
جﺎﺘﻨﺘﺳا : ﻳﺎﭘ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧ رﺎﺘﺧﺎﺳ نژ يﻮﺘﺤﻣ راﺪ
نﺎـﺸﻧ ار ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ زا ﻲﻬﺟﻮـﺗ ﻞـﺑﺎﻗ ﺐـﻴﻛﺮﺗﻮﻧ نﺎﻴﺑ ﻪﻛ ﺪﻳدﺮﮔ ﺪﻴﻟﻮﺗespA
داد . ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﻦﻳاﺮﺑﺎﻨﺑ ﻲﻣ ارEspA
ﻦـﻤﻳا ناﺰـﻴﻣ ﻲـﺳرﺮﺑ ياﺮـﺑ هﺪﻨﻳآ تﺎﻌﻟﺎﻄﻣ رد ناﻮﺗ ﻪـﻴﻠﻋ يزﺎـﺳ
E. coli O157:H7
درﻮـﻣ
داد راﺮﻗ ﻲﺳرﺮﺑ .
يﺪﻴﻠﻛ يﺎﻫ هژاو :
هدور نژﻮﺗﺎﭘ نژ يزﺎﺳ نﺎﺴﻤﻫ ،يا
ﺎﻴﺑ ،espA
تﻼﺑ نﺮﺘﺳو ،ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧ ن
ﻪﻣﺪﻘﻣ
ﻪﻳﻮﺳ يﺮﺘﻛﺎـﺑ ياز يرﺎﻤﻴﺑ يﺎﻫ
E.coli
نژﻮﺗﺎـﭘ يﺎـﻫ
نآ ﻪﺑ ﻼﺘﺑا ﻪﻛ ﺪﻨﺘﺴﻫ ﻲﻛﺎﻧﺮﻄﺧ ﺐﻴﺳآ ﺎﻫ
ار يدﺪﻌﺘﻣ يﺎﻫ
ﻲﻣ دﺎﺠﻳا رﺎﻤﻴﺑ ياﺮﺑ ﺪـﻨﻛ
) 1
، 2
.(
يﺮﺘﻛﺎـﺑ
E. coliO157:H7
ﺟ ـ ﺘﺳد ءﺰ ـ ﭘ ﻪ ـ ﺗﺎ ـ نژﻮ ﻫ ـ يﺎ ﺴﺤﻣEHEC
ــ ﻲﻣ بﻮ ﺷ ـ و دﻮ
ﻖﻳﺮﻃ زا ﻪﻛ ﺖﺳا ﻲﻤﺴﻴﻧﺎﮔراوﺮﻜﻴﻣ هدروآﺮﻓ
يﺎﻫ ﻲﻳاﺬـﻏ
هدﻮﻟآ ﺮﻴﻏ ﺮﻴﺷ و ﻲﻣ ﻞﻘﺘﻨﻣ نﺎﺴﻧا ﻪﺑ هﺰﻳرﻮﺘﺳﺎﭘ
دﻮﺷ
) 3
، 4
.(
لﻮﺌﺴﻣ ﻒﻟﻮﻣ :
ﻓ ﻴ زوﺮ ﻫاﺮﺑا ﻴ ﻤ ﻲ - ناﺮﻬﺗ : ﻬﺷ نﺎﺑﻮﺗا ﻴ ﺪ ﺎﺑﺎﺑ ﻲﻳ
، ﺴﺣ مﺎﻣا هﺎﮕﺸﻧاد ﻴ
ﻦ ) ع ( ﻘﺤﺗ ﺰﻛﺮﻣ و هوﺮﮔ ، ﻴ
تﺎﻘ ز ﻳ ﺖﺴ ﺳﺎﻨﺷ ﻲ
E-mail:[email protected]
1 . ﻮﺠﺸﻧاد ي ﺮﺘﻛد ي ﺑﻮﻧﺎﻧ ﻴ ژﻮﻟﻮﻨﻜﺗﻮ ي
، ﻛﺮﻣ ﻘﺤﺗ ﺰ ﻴ تﺎﻘ ز ﻳ ﺖﺴ ﺳﺎﻨﺷ ﻲ
، هﺪﻜﺸﻧاد ﺎﭘ مﻮﻠﻋ هﺪﻜﺸﻫوﮋﭘ و ﻳ
،ﻪ ﺴﺣ مﺎﻣا هﺎﮕﺸﻧاد ﻴ
ﻦ ) ع ( ا ،ناﺮﻬﺗ ، ﻳ ناﺮ
2 . دﺎﺘﺳا ﻳ
،رﺎ هوﺮﮔ ﻲﺳﺎﻨﺷ ﺖﺴﻳز
، ﺎﭘ مﻮﻠﻋ هﺪﻜﺸﻫوﮋﭘ و هﺪﻜﺸﻧاد ﻳ
،ﻪ ﺴﺣ مﺎﻣا هﺎﮕﺸﻧاد ﻴ
ﻦ ) ع ( ا ،ناﺮﻬﺗ ، ﻳ ناﺮ
3 . ﺳﺎﻨﺷرﺎﻛ ﻲ ژﻮﻟﻮﻨﻜﺗ ﺪﺷرا ي اﺬﻏ مﻮﻠﻋ و ﻲﻳ
، ﻣﻼﺳا دازآ هﺎﮕﺸﻧاد ﻲ
،
،نﺎﭼﻮﻗ ﺪﺣاو ﺎﻨﺻ و مﻮﻠﻋ هوﺮﮔ ﻳ
ﻊ اﺬﻏ ﻲﻳ
، ا ،نﺎﭼﻮﻗ ﻳ ناﺮ
ﺖﻓﺎﻳرد ﺦﻳرﺎﺗ :
28 / 3 / 1393 تﺎﺣﻼﺻا ﺖﻬﺟ عﺎﺟرا ﺦﻳرﺎﺗ :
17 / 4 / 1393 ﺐﻳﻮﺼﺗ ﺦﻳرﺎﺗ :
30 / 6 / 1393
وﺎﺣ رﻮﺘﻛو ﺖﺧﺎﺳ ي
نژ EspA
14 نارﺪﻧزﺎﻣ ﻲﻜﺷﺰﭘ مﻮﻠﻋ هﺎﮕﺸﻧاد ﻪﻠﺠﻣ
هرود
مرﺎﻬﭼ و ﺖﺴﻴﺑ هرﺎﻤﺷ ،
117 ، ﺮﻬﻣ 1393
زا ﺶﻴــﺑ ﻪﻧﻻﺎــﺳ 5
رد ًﺎــﺻﻮﺼﺧ ﺮــﻴﻣ و گﺮــﻣ نﻮــﻴﻠﻴﻣ
ﺮﻳز نﺎﻛدﻮﻛ 5
ﺳ ـ لﺎ ﺳاو ﻪﺑ ـ ﮔدﻮﻟآ ﻪﻄ ـ
ﻳا ﻪﺑ ﻲ ـ ﺗﺎﭘ ﻦ ـ نژﻮ
شراﺰﮔ ﻲﻣ دﻮﺷ
) 5
.(
ﻪـﻟﻮﻟ رد رﻮﻛﺬـﻣ يﺮﺘﻛﺎﺑ ﻲﻨﻳﺰﮔ ﻪﻧﻻ
ﺖـﺤﺗ ﺎﻫرﻮﺘﻛﺎﻓ و ﻞﻣاﻮﻋ زا يﺮﺳ ﻚﻳ ﻪﻄﺳاو ﻪﺑ شراﻮﮔ لﺮﺘﻨﻛ ﺮﻳاﺰﺟ ﻲﻣ مﺎﺠﻧا ﻪﺘﻴﺴﻴﻧژﻮﺗﺎﭘ دﻮﺷ
) 5
، 6
.(
ﺮـﻳاﺰﺟ ﻦـﻳا
ﻪﺘﺳد تﺎﺟ ﻲﻜﻴﺘﻧژ جرﺎﺧ ﻲﻣوزﻮﻣوﺮﻛ ﺪﻨﺘﺴﻫ
ﻪﻛ يوﺎﺣ
ﻞـﻣاﻮﻋ يرﺎـﻤﻴﺑ ياز ـﻔﻠﺘﺨﻣ ﻲ ﻞـﻴﺒﻗ زا يﺎـﻫ نژ ﻢﺟﺎـﻬﺗ /
لﺎﺼﺗا ﻢﺘﺴﻴﺳ و ﻲﺤﺷﺮﺗ عﻮﻧ وIII
ﻲﻣ IV
ﺪﻨـﺷﺎﺑ . نژﻮﺗﺎـﭘ
ﻢﺘﺴﻴﺳ ﻦﻳا زا
لﻮـﻜﻟﻮﻣ ﺢـﺷﺮﺗ ياﺮـﺑ ﺎـﻫ ﻪـﻛ يﺮـﺠﻣ يﺎـﻫ
ﻲﻣ ﺮﺛﺄﺘﻣ ار نﺎﺑﺰﻴﻣ لﻮﻠﺳ ﻲﻣ هدﺎﻔﺘﺳا ﺪﻧزﺎﺳ
ﺪﻨﻛ
) 7
. (
ﻢﺘﺴﻴﺳ
عﻮﻧ ﻲﺤﺷﺮﺗ ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﺢﺷﺮﺗ ردIII
ﻪـﻠﻤﺟ زا ﻒـﻠﺘﺨﻣ يﺎﻫ
،Tir
،EspA
وEspB
EspD
ﻲــﻣ ﺎــﻔﻳا ﺶــﻘﻧ ﺪــﻨﻛ
) 5
.(
يرﺎـﻤﻴﺑ يﺎـﻫرﻮﺘﻛﺎﻓ ﻦﻳا زا يرﺎﻴﺴﺑ
ـﺑ ًﺎﻤﻴﻘﺘـﺴﻣ از لﻮﻠـﺳ ﻪ
ﻲـﻣ هداد ﻞﻳﻮﺤﺗ نﺎﺑﺰﻴﻣ ﺪﻧﻮـﺷ
. لﺎـﺜﻣ ناﻮـﻨﻋ ﻪـﺑ ﺎـﺑEspA
ﻪﺘﺷر رﺎﺘﺧﺎﺳ دﺎﺠﻳا نﺎﺑﺰﻴﻣ لﻮﻠﺳ ﻪﺑ يﺮﺘﻛﺎﺑ ﺢﻄﺳ يور يا
ﻲـﻣ ﻞﭘ ﺪـﻧز
) 6
.(
نژ ﻂـﺳﻮﺗEspA
espA
ﻲـﻣ ﺪـﻛ دﻮـﺷ و
يور ﺢﻄـﺳ يﺮﺘﻛﺎـﺑ يرﺎﺘﺧﺎـﺳ ﻲـﺘﻨﻣﻼﻴﻓ
ياﺮـﺑ ﻖـﻳرﺰﺗ
،EspB
وEspD
ﻞﻴﻜـــﺸﺗTir
ﻲـــﻣ ﺪـــﻫد
) 3
. (
ﻖـــﺒﻃ ﺮـــﺑ
يرﺎــﻤﻴﺑ ،تﺎــﺷراﺰﮔ ﻲــﻳاز
يﺎــﻫ ﺖــﻧﺎﺗﻮﻣ وespA
espB
ﻲـﻣ ﺶﻫﺎـﻛ رﺎﻴﺴﺑ ﺪـﺑﺎﻳ
) 8
.(
ﻲﮔﺪﻨﺒـﺴﭼ ﻪـﻴﻟوا
ﻪـﺑ يﺮﺘﻛﺎـﺑ
لﻮﻠﺳ يﺎﻫ
لﺎـﻴﻠﺗ ﻲـﭘا ﻂـﺳﻮﺗ
ﻲـﻠﻴﭘ ﻞﻴﻜـﺸﺗ هﺪـﻨﻫد ﻪﺘـﺳد
)
Bundle forming pilus
( مﺎــﺠﻧا ﻲــﻣ ﻪــﻛ دﻮــﺷ ار نآ
ﺪﻴﻤﺳﻼﭘ ﺪﻛ ﻲﻣ ﺪﻨﻛ . ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﺲﭙﺳ نداد ﻞﻜﺷ ﺎﺑEspA
د يﺎﻫرﻮﺘﻛﺎﻓ ﺮﻳﺎﺳ لﺎﻘﺘﻧا ياﺮﺑ ار ﻂﻳاﺮﺷ لﺎﻧﺎﻛ ﻚﻳ ﻞـﻴﺧ
ﻪﻧﻻ رد ﻲﻣ ﻢﻫاﺮﻓ يﺮﺘﻛﺎﺑ ﻲﻨﻳﺰﮔ ﺪﻨﻛ
) 6
.(
ﻪﺑ ﻞـﻴﻟد ﺖـﻴﻤﻫا
ﻦﻴﻤﻴﺘﻨﻳا و ﺪﻧور ردEspA
يرﺎﻤﻴﺑ ﻦـﻳا ،ﻲﻳاز ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ ود
ﻪـﺑ ناﻮـﻨﻋ ﺺﺧﺎـﺷ يﺎـﻫ يرﺎـﻤﻴﺑ ﻲـﻳاز بﻮـﺴﺤﻣEHEC
ﻲﻣ ﺪﻧﻮﺷ
) 9
.(
ﻞﻜـﺷ ﻪـﺑ ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﻦﻳا ﺪﻴﻟﻮﺗ ياﺮﺑ يدﺪﻌﺘﻣ تﺎﻌﻟﺎﻄﻣ
ﻲﻳﺎﻬﻨﺗ ﻪﺑ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧ
) 10
ﺎـﺑ ﺮﻤﻳﺎـﻛ ترﻮـﺻ ﻪﺑ ﻦﻴﻨﭼ ﻢﻫ و(
ﺳ ﻲﻨﻳﺰﮔ ﻪﻧﻻ رد ﻞﻴﺧد ﻞﻣاﻮﻋ ﺮﻳﺎ
) 10
، 11
يرﺎـﻤﻴﺑ و(
ﻲـﻳاز
يﺮﺘﻛﺎﺑ
) 12 - 10
ﺖﺳا ﻪﺘﻓﺮﻳﺬﭘ ترﻮﺻ(
. ﺶـﻘﻧ ﻪـﺑ ﻪـﺟﻮﺗ ﺎﺑ
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ يرﺎﻤﻴﺑ ردEspA
يﺮﺘﻛﺎﺑ ﻲﻳاز
E. coli O157:H7
،
ﻲــﻣ ياﺮــﺑ ﺐــﺳﺎﻨﻣ يﺪــﻳﺪﻧﺎﻛ ناﻮــﻨﻋ ﻪــﺑ ار نآ ناﻮــﺗ
ﺖـﻓﺮﮔ ﺮـﻈﻧ رد رﻮﻛﺬﻣ ﻞﻣﺎﻋ ﻪﻴﻠﻋ نﻮﻴﺳﺎﻨﻴﺴﻛاو .
ﻦـﻳا رد هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ ﺶﻫوﮋﭘ
يژﻮﻟﻮﻨﻜﺗ زا ماﺪـﻗا ،ﺐـﻴﻛﺮﺗﻮﻧDNA
نﺎﺴﻤﻫ ﻪﺑ ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧ نﺎﻴﺑ و يزﺎﺳ ﺪﺷEspA
.
و داﻮﻣ شور
ﺎﻫ
نژ ياﺮــﺑ ﺮــﻤﻳاﺮﭘ ﻲــﺣاﺮﻃ يﺮﺘﻛﺎــﺑ ﻪــﺑ طﻮــﺑﺮﻣespA
E. coli o157:H7
:
ﻟاﻮــﺗ ﻲ ﻣآ ﻴ ــﺳاﻮﻨ ﻴ ﺪ ي ﺎﭘ زاEspA
ﻳ هﺎــﮕ دﺪــﻋ ﺎــﺑNCBI
ــﺳﺮﺘﺳد ﻲ )
ZP_02797355
( زا ﺲــﭘ و ﺪــﺷ جاﺮﺨﺘــﺳا
ﻟاﻮــﺗ نﺪــﻧادﺮﮔﺮﺑ ﻲ
ﻣآ ﻴﻨ ــﺳاﻮ ﻴ ﺪ ي ﻟاﻮــﺗ ﻪــﺑ ﻲ ﺗﻮﺌﻠﻛﻮﻧ ــﻴ ﺪ ي
مﺮﻧ ﻂﺳﻮﺗ سﻮﻜﻌﻣ ﻪﻤﺟﺮﺗ راﺰﻓا
) 13
ـﺳرﺮﺑ و(
ﻲ ﻟاﻮـﺗ ﻲ نژ
مﺮﻧ رد راﺰﻓا
NEBcutter )
14
ﺎﺟ ،(
ﻳ هﺎﮕ ﺎﻫ ي ﺷﺮﺑ ﻲ
BamHI
و
HindIII
ﺗﺮﺗ ﻪــﺑ ــﻴ ﺐ ــﻬﺘﻧا رد ﺎ
´ي 5 ﻳاﺮﭘ ﺎــﻫﺮﻤ ي ﭘﻴ وﺮــﺸ و
ﭘﻴ وﺮ ﺪﺷ ﻪﺘﻓﺮﮔ ﺮﻈﻧ رد .
نژ ﻦـﻳا ياﺮﺑ ﻲﺻﺎﺼﺘﺧا يﺎﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ
مﺮﻧ زا هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ راﺰﻓا
Oligo 7
ﺪﺷ ﻲﺣاﺮﻃ .
ﺎـﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ ﻲﻟاﻮـﺗ
زا ﺪﻧدﻮﺑ ترﺎﺒﻋ :
وﺮﺸﻴﭘ ﺮﻤﻳاﺮﭘ :
TAATGGATCCATGGCTGACATGAAC
وﺮﻴﭘ ﺮﻤﻳاﺮﭘ :
CTTCAAGCTTTTACTTACCCAGAGAGTAGC
بوذ يﺎــﻣد )
(Tm
ﻪــﺑ وﺮــﻴﭘ و وﺮــﺸﻴﭘ يﺎــﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ
ﺐﻴﺗﺮﺗ 5 / 68 و 9 / 68 ﻲﺘﻧﺎﺳ ﻪﺟرد دﻮـﺑ داﺮﮔ
. ﻦـﻳا ﻪـﺑ ﺮـﻈﻧ
لﻮــﺼﺤﻣ ﻢﻴﻘﺘــﺴﻣ شﺮــﺑ ﻪــﻛ ﻢﻳﺰــﻧآ ﻂــﺳﻮﺗPCR
يﺎــﻫ
داﺪـﻌﺗ اﺬـﻟ ،دﻮـﺑ ﺮﻈﻧ ﺪﻣ ﺮﺛﻷادوﺪﺤﻣ 4
رد ﺰـﻴﻧ ﺪـﻴﺗﻮﺌﻠﻛﻮﻧ
ﻪﻧﺎﻳﺎﭘ يﺎﻫ 5´
ﺮﻫ ﺖﻓﺮﮔ راﺮﻗ ﺮﻈﻧ ﺪﻣ ﺮﻤﻳاﺮﭘ ود .
ﻢـﻫ ﻦﻴـﻨﭼ
زا ﻪــﻤﺟﺮﺗ ﺪــﻨﻳآﺮﻓ نﺎــﻳﺎﭘ رﻮــﻈﻨﻣ ﻪــﺑ يور
نژmRNA
ﺮﻤﻳاﺮﭘ يور ﺮﺑ ﺰﻴﻧ ﻪﻤﺗﺎﺧ نوﺪﻛ ﻪﺑ طﻮﺑﺮﻣ ﻲﻟاﻮﺗ ،رﻮﻛﺬﻣ ﺖﻓﺮﮔ راﺮﻗ وﺮﻴﭘ .
نژ ﺮﻴﺜﻜﺗ ﻚﻴﻨﻜﺗ ﻂﺳﻮﺗespA
PCR
ــﺳﻼﭘ زا يﻮــﺘﺤﻣ ﺮﻤﻳﺎــﻛ نژ ﻚــﻳ ياراد ﻪــﻛ يﺪﻴﻤ
ﻲﻟاﻮﺗ ﺪﻳدﺮﮔ هدﺎﻔﺘﺳا ﻮﮕﻟا ناﻮﻨﻋ ﻪﺑ ،دﻮﺑespA
. ﺪﻴﻤـﺳﻼﭘ
ﻦﻴـﻴﻌﺗ زا ﺲـﭘ و ﺪﺷ جاﺮﺨﺘﺳا ﻲﻳﺎﻴﻠﻗ ﺰﻴﻟ شور ﻪﺑ رﻮﻛﺬﻣ ناﺰﻴﻣ ،پاردﻮﻜﻴﭘ هﺎﮕﺘﺳد ﻂﺳﻮﺗ نآ ﺖﻈﻠﻏ 5
/ 0 ﺮﺘﻴﻟوﺮﻜﻴﻣ
ﺶﻨـﻛاو رد ﻮـﮕﻟا ناﻮـﻨﻋ ﻪـﺑ ﺪﻴﻤـﺳﻼﭘ يﻮﺘﺤﻣ لﻮﻠﺤﻣ زا
هﺮﻴﺠﻧز ﺰﻧآ ﻂﺳﻮﺗ زاﺮﻤﻴﻠﭘ يا ﻢﻳ
Taq DNA
درﻮﻣ زاﺮﻤﻴﻠﭘ
ﺖﻓﺮﮔ راﺮﻗ هدﺎﻔﺘﺳا .
وﺮـﻴﭘ و وﺮـﺸﻴﭘ يﺎـﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ ﻦﻴﻨﭼ ﻢﻫ
ناﺰــﻴﻣ ﻪــﺑ ماﺪــﻛ ﺮــﻫ 4
/ 0 ﻚــﻤﻧ ،لﻮــﻣﻮﻜﻴﭘ
MgSO4
ﺎــﺑ
ﺖﻈﻠﻏ 2 ﻲﻠﻴﻣ ،رﻻﻮﻣ ﺖﻈﻠﻏ ﺎﺑdNTP
4 / 0 ﻲـﻠﻴﻣ و رﻻﻮـﻣ
5 / 2 ﺖـﻈﻠﻏ ﺎـﺑ زاﺮـﻤﻴﻠﭘ ﻢﻳﺰـﻧآ ﺮﻓﺎﺑ ﺮﺘﻴﻟوﺮﻜﻴﻣ ياﺮـﺑ10X
ﺶﻨﻛاو ﻲﻳﺎﻬﻧ ﻢﺠﺣ 25
ﺎﻔﺘـﺳا درﻮﻣ يﺮﺘﻴﻟوﺮﻜﻴﻣ ﻊـﻗاو هد
ﺪﻧﺪــﺷ . ﻲﻳﺎــﻣد نﺎــﻳداﺮﮔ 55
ﺎــﺗ 65 ﺪــﻨﻳآﺮﻓ ياﺮــﺑ ﻪــﺟرد
ﺎـﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ لﺎﺼﺗا )
يﺎـﻣد
Annealing
(
ﻪـﻨﻴﻬﺑ ياﺮـﺑ يزﺎـﺳ
ﺶﻨﻛاو PCR
ﺪـﺷ مﺎـﺠﻧا .
ﻪـﻨﻴﻬﺑ زا ﺲـﭘ يزﺎـﺳ
زا ،PCR
ﻢﻳﺰــﻧآ
Pfu DNA
ﻪــﺑ رﻮﻛﺬــﻣ نژ ﺮــﻴﺜﻜﺗ ياﺮــﺑ زاﺮــﻤﻴﻠﭘ
ﺶﻬﺟ زا يﺮﻴﮔﻮﻠﺟ رﻮﻈﻨﻣ ﺪﻳدﺮﮔ هدﺎﻔﺘﺳا ﻪﺘﺳاﻮﺧﺎﻧ يﺎﻫ
.
ﻪﺧﺮﭼ يﺎﻫ ﻪﺑPCR
دﻮﺑ ﺮﻳز حﺮﺷ :
ﻪـﻴﻟوا ﻲﮕﺘﺷﺮﺳاو
يﺎﻣد رد 95 ﻲـﻃ ﻪﺟرد 5
رد ﻪـﻳﻮﻧﺎﺛ ﻲﮕﺘـﺷﺮﺳاو ،ﻪـﻘﻴﻗد
يﺎﻣد 94 فﺮﻇ ﻪﺟرد 30
ﻪﺘـﺷر ﻪـﺑ ﺎﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ لﺎﺼﺗا ،ﻪﻴﻧﺎﺛ
يﺎـﻣد رد ﻮﮕﻟا 62
ﻲـﻃ ﻪـﺟرد 40
ﻪﺘـﺷر شﺮﺘـﺴﮔ ،ﻪـﻴﻧﺎﺛ
يﺎﻣد رد زاﺮﻤﻴﻠﭘ ﻢﻳﺰﻧآ ﺖﻴﻟﺎﻌﻓ ﻪﻄﺳاو ﻪﺑ ﺪﻳﺪﺟ 72
ﻪﺟرد
تﺪﻣ ﻪﺑ 45 ﻪـﻠﺣﺮﻣ ﻚﻳ ًﺎﺘﻳﺎﻬﻧ و ﻪﻴﻧﺎﺛ رد ﻪﺘـﺷر شﺮﺘـﺴﮔ
يﺎﻣد 72 تﺪﻣ ﻪﺑ ﻪﺟرد 5
ﻪﻘﻴﻗد . ﻪـﻛ ﺖـﺳا ﺮـﻛذ ﻪﺑ مزﻻ
ﻪﺧﺮﭼ داﺪﻌﺗ ﺎـﺗ ﻪﻳﻮﻧﺎﺛ ﻲﮕﺘﺷﺮﺳاو ﻪﻠﺣﺮﻣ زا ﺮﻴﺜﻜﺗ ياﺮﺑ ﺎﻫ
ﺰﺘﻨﺳ لﺎﺣ رد ﻪﺘﺷر شﺮﺘﺴﮔ ﻪﻠﺣﺮﻣ 34
دﻮﺑ راﺮﻜﺗ
) 15
.(
لﻮﺼﺤﻣ يزﺎﺳ نﺎﺴﻤﻫ رﻮﺘﻛو ردPCR
pET28a(+)
:
ﺖـﻴﻛ ﻂـﺳﻮﺗ نآ ﺺﻴﻠﺨﺗ و ﻲﻧژ ﻪﻌﻄﻗ ﺮﻴﺜﻜﺗ زا ﺲﭘ ﺖﻛﺮﺷ
Bioneer
ﻪﻧﺎﮔود ترﻮﺻ ﻪﺑ ﻲﻤﻳﺰﻧآ ﻢﻀﻫ ﺶﻨﻛاو ،
تﻻﻮﺼﺤﻣ يور ﺮﺑ ﻢﻫ وPCR
ﺪﻴﻤﺳﻼﭘ ﻦﻴﻨﭼ
pET28a(+)
ﻢﻳﺰﻧآ ﻂﺳﻮﺗ ﺮﺛﻷادوﺪﺤﻣ يﺎﻫ
BamHI
و
HindIII
مﺎـﺠﻧا
ﺶﻨﻛاو و ﺪﺷ تﺪﻣ ﻪﺑ ﻲﺷﺮﺑ يﺎﻫ
6 يﺎـﻣد رد ﺖﻋﺎـﺳ 37
ﺪﻧﺪﺷ ﻪﺑﻮﻜﻧا ﻪﺟرد .
،ﻲـﻤﻳﺰﻧآ ﻢـﻀﻫ نﺎـﻣز مﺎـﻤﺗا زا ﺲـﭘ
پﻮــﻴﺗ لﺎــﻘﺘﻧا ﺎــﺑ رﻮﻛﺬــﻣ ﺪــﻨﻳآﺮﻓ ﻣ يﺎــﻫ
ياﺰــﺟا يﻮــﺘﺤ
يﺎﻣد ﻪﺑ ﺶﻨﻛاو 80
تﺪـﻣ ﻪـﺑ ﻪـﺟرد 10
لﺎـﻌﻓﺮﻴﻏ ﻪـﻘﻴﻗد
ﺪﻧﺪﺷ . يﺎـﻣد ﺎﺑ زرﺎﮔآ لژ يور ﺮﺑ هدرﻮﺧ شﺮﺑ ﺪﻴﻤﺳﻼﭘ ﺪﻴﻤـﺳﻼﭘ هدرﻮﺧ شﺮﺑ ﺪﻧﺎﺑ ﺎﺗ ﺪﺷ زرﻮﻓوﺮﺘﻜﻟا ﻦﻴﻳﺎﭘ بوذ
ددﺮﮔ جاﺮﺨﺘﺳا ﻲﺻﺎﺼﺘﺧا ﻞﻜﺷ ﻪﺑ .
ﺶﻨـﻛاو زا ﻞﺻﺎﺣ تﻻﻮﺼﺤﻣ ﺺﻴﻠﺨﺗ زا ﺲﭘ يﺎـﻫ
ﻪﺘــﺷر يور ﺮــﺑ ﻲــﻤﻳﺰﻧآ ﻢــﻀﻫ يﺎــﻫ
ﭘ وDNA
،ﺪﻴﻤــﺳﻼ ﻢﻳﺰــﻧآ زا هدﺎﻔﺘــﺳا ﺎــﺑ رﻮــﺘﻛو نورد نژ قﺎــﺤﻟا ﺶﻨــﻛاو
T4 DNA Ligase
ﻲﻠﻗاﺪــﺣ ﺖـﻈﻠﻏ ﻦﺘﻓﺮـﮔ ﺮـﻈﻧ رد ﺎـﺑ
ناﺰﻴﻣ ﻪﺑ ﺪﻴﻤﺳﻼﭘ 50
لﻮـﻣﺮﻓ يﺮﻴﮔرﺎـﻛ ﻪﺑ ﺎﺑ و مﺮﮔﻮﻧﺎﻧ 1
ﻢـﺠﺣ ﺎـﺑ هدﺎﻔﺘـﺳا درﻮـﻣ نژ ﺖﻈﻠﻏ ﻪﺒﺳﺎﺤﻣ ياﺮﺑ 3
ﺮـﺑاﺮﺑ
ﺖﻓﺮﻳﺬﭘ ترﻮﺻ قﺎﺤﻟا ﺶﻨﻛاو ياﺮﺑ .
ﺎـﺑ ﺶﻨـﻛاو ياﺰﺟا
ﺪﻧﺪﺷ ﺐﻴﻛﺮﺗ ﻢﻫ يﺎـﻣد رد ﻪﻧﺎﺒﺷ ترﻮﺻ ﻪﺑ ﺶﻨﻛاو و
8
ﻲﺘﻧﺎﺳ ﻪﺟرد ﺪﺷ ﻪﺑﻮﻜﻧا داﺮﮔ
) 15
.(
لﻮﻣﺮﻓ 1 :
= قﺎﺤﻟا ﺶﻨﻛاو رد هدﺎﻔﺘﺳا درﻮﻣ نژ ﺖﻈﻠﻏ
مﺮﮔﻮﻧﺎﻧ ﺐﺴﺣﺮﺑ 50
ﺖـﺳﺎﻛ ﻂـﺳﻮﺗ ﻲﻧﺎﻴﺑ نﺎﺑﺰﻴﻣ يﺎﻫ لﻮﻠﺳ ندﻮﻤﻧ ﺖﺨﻳراﺮﺗ هﺪﺷ ﻪﺘﺧﺎﺳ :
لﻮﻠﺳ يﺮﺘﻛﺎﺑ ﺪﻌﺘﺴﻣ نﺎﺑﺰﻴﻣ يﺎﻫ
E.coli BL21(DE3)
ﺑ دراﺪﻧﺎﺘﺳا ﻚﻤﻧ زا هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ ﻲﻳﺎﻴﻤﻴﺷ شور ﻪ
يﺎـﻫ
Mgcl2
و
Cacl2
ﺪﻧﺪــﺷ ﻪــﻴﻬﺗ .
ﺲﭙــﺳ 10 لﻮــﺼﺤﻣ زا ﺮــﺘﻴﻟوﺮﻜﻴﻣ
لﻮﻠـﺳ ﻪـﺑ ﻲﺗراﺮﺣ كﻮﺷ ترﻮﺻ ﻪﺑ قﺎﺤﻟا ﺶﻨﻛاو يﺎـﻫ
لﻮﻠﺳ و ﺪﺷ ﻞﻘﺘﻨﻣ ﺪﻌﺘﺴﻣ ﺮـﺑ هﺪـﺷ ﺖـﺨﻳراﺮﺗ نﺎﺑﺰﻴﻣ يﺎﻫ
ﺖــﺸﻛ ﻂﻴــﺤﻣ يور ﻚــﻴﺗﻮﻴﺑ ﻲــﺘﻧآ يوﺎــﺣ رﺎــﮔآLB
ﻦﻴﺴﻳﺎﻣﺎﻧﺎﻛ )
µg/ml
80 ( ﻪـﺑ و ﺪﻧﺪـﺷ هداد ﺖﺸﻛ ترﻮـﺻ
يﺎﻣد رد ﻪﻧﺎﺒﺷ 37
ﻲﺘﻧﺎﺳ ﻪﺟرد ﺪﻧﺪﺷ ﻪﺑﻮﻜﻧا داﺮﮔ
) 15
.(
نژ يزﺎﺳ نﺎﺴﻤﻫ ﺪﻴﻳﺄﺗ
داﺪﻌﺗ 3
نﻮـﻠﻛ زا ﻲﻧﻮـﻠﻛ يور ﺮـﺑ ﻪـﺘﻓﺎﻳ ﺪـﺷر يﺎـﻫ
ﻲﺑﺎﺨﺘﻧا ﻂﻴﺤﻣ ﻂﻴـﺤﻣ ﻪـﺑ و ﺪﻧﺪـﺷ بﺎﺨﺘﻧا رﺎﮔآLB
LB
ﻦﻴﺴﻳﺎﻣﺎﻧﺎﻛ ﻚﻴﺗﻮﻴﺑ ﻲﺘﻧآ يوﺎﺣ ثاﺮﺑ )
µg/ml
80 ( ﻞﻘﺘﻨﻣ
ﺪﻧﺪﺷ . لﻮﻠﺳ يرﻮﻧ بﺬﺟ ﻪﻛ ﻦﻳا زا ﺲﭘ ﺎﻫ
رد لﻮﻃ جﻮﻣ
600nm
ﻪﺑ 8 / 0 ،ﺪﻴـﺳر ﺰـﻴﻟ شور ﻪـﺑ ﺪﻴﻤـﺳﻼﭘ جاﺮﺨﺘـﺳا
ﺖﻓﺮﻳﺬـﭘ ترﻮـﺻ ﻲﻳﺎﻴﻠﻗ .
نﺎـﺴﻤﻫ ﺪـﻴﻳﺄﺗ ياﺮـﺑ نژ يزﺎـﺳ
رﻮﺘﻛو نوردespA pET28a(+)
ﻚـﻴﻨﻜﺗ ﻪـﺳ زا ، ،PCR
ﻢـﻫ و ﻲـﻤﻳﺰﻧآ ﻢـﻀﻫ ﺶﻨﻛاو ﻂـﺳﻮﺗ ﻲﺑﺎـﻳ ﻲﻟاﻮـﺗ ﻦﻴـﻨﭼ
ﻲﻣﻮﻤﻋ يﺎﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ ﺪﻳدﺮﮔ هدﺎﻔﺘﺳا رﻮﺗﺎﻨﻴﻣﺮﺗ و رﻮﺗاﺮﭘاT7
.
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ نﺎﻴﺑ ﻲﺳرﺮﺑ :espA
نژ يزﺎﺳ نﺎﺴﻤﻫ ﺪﻴﻳﺄﺗ زا ﺲﭘ نﻮﻠﻛ زا ،espA
يﺎـﻫ
وﺎﺣ رﻮﺘﻛو ﺖﺧﺎﺳ ي
نژ EspA
16 نارﺪﻧزﺎﻣ ﻲﻜﺷﺰﭘ مﻮﻠﻋ هﺎﮕﺸﻧاد ﻪﻠﺠﻣ
هرود
مرﺎﻬﭼ و ﺖﺴﻴﺑ هرﺎﻤﺷ ،
117 ، ﺮﻬﻣ 1393
ﻂﻴﺤﻣ رد هدﺮﻛ ﺪﺷر ناﺰـﻴﻣ ،ﻪﻧﺎﺒـﺷ ترﻮـﺻ ﻪﺑ ثاﺮﺑLB
50 ﻪــﺑ ﺮــﺘﻴﻟوﺮﻜﻴﻣ 5
ﻲــﻠﻴﻣ ﻂﻴــﺤﻣ ﺮــﺘﻴﻟ و هزﺎــﺗ ثاﺮــﺑLB
ﻲﺘﻧآ يوﺎﺣ ﻞﻳﺮﺘﺳا ﻦﻴـﺴﻳﺎﻣﺎﻧﺎﻛ ﻚﻴﺗﻮﻴﺑ
)
µg/ml
40 ( ﻞـﻘﺘﻨﻣ
ﺪﻳدﺮﮔ . ﻪﻳﻮـﺳ رد نژ نﺎـﻴﺑ ﻪـﻛ ﻦـﻳا ﻪﺑ ﺮﻈﻧ
BL21(DE3)
لﺮﺘﻨﻛ ﺖﺤﺗ نوﺮﭘا
ﻲﻣlac
بﺬـﺟ ﻪـﻛ ﻦـﻳا زا ﺲﭘ ،ﺪﺷﺎﺑ
لﻮﻃ رد ﺖﺸﻛ ﻂﻴﺤﻣ يرﻮﻧ جﻮﻣ
600nm
ﻪﺑ دوﺪـﺣ 5 / 0
ﻞـﻴﭘوﺮﭘوﺰﻳا ﻲﻋﻮﻨـﺼﻣ ﺮﮔءﺎـﻘﻟا هدﺎﻣ زا ،ﺪﻴﺳر β-
- -D
1 -
ﺪــﻳزﻮﻧاﺮﻴﭘﻮﺘﻛﻻﺎﮔ )
(IPTG
درﻮــﻣ نژ نﺎــﻴﺑ يﺎــﻘﻟا ياﺮــﺑ
ﺪـﺷ هدﺎﻔﺘـﺳا ﺮﻈﻧ .
لژ يور ﺮـﺑ نﺎـﻴﺑ ﺞﻳﺎـﺘﻧ
SDS-PAGE
14 ﺪﻳدﺮﮔ ﻲﺳرﺮﺑ ﺪﺻرد )
16 .(
ﺗوﺮﭘ ﺪﻴﻳﺄﺗ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧ ﻦﻴﺌ نﺮﺘﺳو يراﺬﮔ ﻪﻜﻟ ﻂﺳﻮﺗEspA
:
ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ ﺪـﻴﻳﺄﺗ رﻮـﻈﻨﻣ ﻪﺑ شور زا ﺐـﻴﻛﺮﺗﻮﻧEspA
ﻲـﺘﻧآ زا هدﺎﻔﺘـﺳا ﺎﺑ نﺮﺘﺳو تﻼﺑﻮﻨﻤﻳا لﺎـﻧﻮﻠﻛ ﻲـﻠﭘ يدﺎـﺑ
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ هﺪﻧﺮﻴﮔﺮﺑ رد ﺮﻤﻳﺎﻛ نژ ﻲﺘﻧآ ﻚﻳ ﻪﻴﻠﻋ ﻪـﺑEspA
ﺪـﻳدﺮﮔ هدﺎﻔﺘـﺳا نآ يﺎﻫﺪـﺣاو ﺮـﻳز زا ﻲﻜﻳ ناﻮﻨﻋ .
اﺪـﺘﺑا
ءﺎﻘﻟا ﻪﻧﻮﻤﻧ ﻲﻟﻮﻠﺳ هرﺎﺼﻋ ﻦﻴـﻨﭼ ﻢـﻫ و هﺪـﺸﻧ ءﺎﻘﻟا و هﺪﺷ
ﻦﻴﺌﺗوﺮـــﭘ لژ يور ﺮـــﺑBSA
SDS-PAGE
14 ﺪـــﺻرد
ﺪﻧﺪﺷ زرﻮﻓوﺮﺘﻜﻟا .
ﺮـﺑ نﺮﺘـﺳو يراﺬـﮔ ﻪﻜﻟ ﺪﻨﻳآﺮﻓ ﺲﭙﺳ
ﻪـﻜﻟ ﻢﺘـﺴﻴﺳ زا هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ ﺰﻟﻮﻠﺳوﺮﺘﻴﻧ ﺬﻏﺎﻛ يور يراﺬـﮔ
BioRad
نآ صﻮﺼﺨﻣ ﺮﻓﺎﺑ و )
ﻦﻴﺴﻳﻼﮔ 192 ﻲـﻠﻴﻣ
،رﻻﻮـﻣ
ﺲﻳﺮــﺗ 25 ،رﻻﻮــﻣ ﻲــﻠﻴﻣ 1SDS
لﻮﻧﺎــﺘﻣ و ﺪــﺻرد 20
رد ﺎــﺑ ﺪــﺻ
pH=8.3
( ﺖﻓﺮﻳﺬــﭘ ترﻮــﺻ .
ندﻮــﻤﻧ كﻼــﺑ
لﻮـﻠﺤﻣ زا هدﺎﻔﺘـﺳا ﺎـﺑ ﻪﻧﺎﺒـﺷ ترﻮﺻ ﻪﺑ ﺰﻟﻮﻠﺳوﺮﺘﻴﻧ ﺬﻏﺎﻛ يوﺎﺣ ﮓﻨﻴﻛﻼﺑ 5
ﺪـﺷ مﺎـﺠﻧا ﻚﺸﺧ ﺮﻴﺷ ﺪﺻرد .
ﻪـﻧﻮﻤﻧ
زا ﺲــﭘ 3 هزﺎــﺑ رد ﻮــﺸﺘﺴﺷ رﺎــﺑ ﻲﻧﺎــﻣز يﺎــﻫ
10 ﻪــﻘﻴﻗد يا
ﺮﻓﺎﺑ ﻂﺳﻮﺗ PBST
ﻲـﺘﻧآ ضﺮـﻌﻣ رد ، لﺎـﻧﻮﻠﻛ ﻲـﻠﭘ يدﺎـﺑ
ﺖﻗر ﺎﺑ رﻮﻛﺬﻣ 3500
/ 1 تﺪﻣ ﻪﺑ 1 ﺎـﺳ يﺎـﻣد رد ﺖﻋ 37
ﻲﺘﻧﺎﺳ ﻪﺟرد ﺖﻓﺮﮔ راﺮﻗ داﺮﮔ
. ﻞـﺒﻗ ﺪـﻨﻧﺎﻣ ﻮﺸﺘﺴﺷ ﺪﻨﻳآﺮﻓ
ﻲـﺘﻧآ زا رﺎـﺑ ﻦـﻳا و ﺪﺷ راﺮﻜﺗ ﻲـﺷﻮﻣ لﺎـﻧﻮﻠﻛ ﻲـﻠﭘ يدﺎـﺑ
ﺖﻈﻠﻏ ﺎﺑ ﻪﮔﻮﺠﻧﺎﻛ 1500
/ 1 ﺬـﻏﺎﻛ ﺢﻄـﺳ نﺪﻧﺎـﺷﻮﭘ ياﺮﺑ
يﺎﻣد رد 37 تﺪﻣ ﻪﺑ و ﻪﺟرد 1
ﺪـﻳدﺮﮔ هدﺎﻔﺘـﺳا ﺖﻋﺎﺳ .
ﮓﻧر ﺶﻨﻛاو ،ﻮﺸﺘﺴﺷ ﺪﻨﻳآﺮﻓ راﺮﻜﺗ زا ﺲﭘ ﺪـﻧﺎﺑ يﺮﻳﺬـﭘ
طﻮﺑﺮﻣ ﻪﺑ ﻪـﮔﻮﺠﻧﺎﻛ ﻢﻳﺰـﻧآ ياﺮﺘـﺴﺑﻮﺳ ندوﺰـﻓا ﺎﺑEspA
)HRP
ﺲﻳﺮﺗ 50 ،رﻻﻮـﻣ ﻲﻠﻴﻣ 6
ﻲـﻠﻴﻣ مﺮـﮔ وDAB
10
ﺮــﺘﻴﻟوﺮﻜﻴﻣ
H2O2
( ﺪــﺷ مﺎــﺠﻧا .
ﻒــﻗﻮﺗ ياﺮــﺑ ﺖــﻳﺎﻬﻧ رد
ﮓﻧر ﺶﻨﻛاو ﻂﻴـﺤﻣ زا اﺮﺘـﺴﺑﻮﺳ يﻮﺘﺤﻣ لﻮﻠﺤﻣ ،يﺮﻳﺬﭘ
ﻂﺳﻮﺗ ﺬﻏﺎﻛ يﻮﺸﺘﺴﺷ ﺎﺑ
ddH2O
ﺪﻳدﺮﮔ فﺬﺣ
) 16
.(
ﺎﻫ ﻪﺘﻓﺎﻳ
نژ زاﺮـــﻤﻴﻠﭘ يا هﺮــﻴﺠﻧز ﺶﻨــﻛاو زا هدﺎﻔﺘـــﺳا ﺎــﺑespA
ﻲﺻﺎﺼﺘﺧا يﺎﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ :
نژ ياﺮـﺑ وﺮـﻴﭘ و وﺮـﺸﻴﭘ يﺎـﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ ﻪﻛ ﻦﻳا زا ﺲﭘ مﺮــﻧ ﻂــﺳﻮﺗ ﺮــﻈﻧ درﻮــﻣ راﺰــﻓا
Oligo 7
ﺎــﺑ ،ﺪــﺷ ﻲــﺣاﺮﻃ
راﺰﻓا مﺮﻧ زا هدﺎﻔﺘﺳا
Blast
نآ ﺖﻴﺻﺎﺼﺘﺧا ناﺰﻴﻣ ياﺮـﺑ ﺎﻫ
نژ ﻲﺳرﺮﺑespA
ﺷ ﺮﻤﻳاﺮﭘ ود ﺮﻫ ﻪﻛ ﺪﻳدﺮﮔ ﺺﺨﺸﻣ و ﺪ
ار ﺮــﻈﻧ درﻮــﻣ نژ ﻻﺎــﺑ ﺖﻴــﺻﺎﺼﺘﺧا ﺎــﺑ ﻲــﻧژ ﻚــﻧﺎﺑ رد
ﻲﻣ ﻲﻳﺎﺳﺎﻨﺷ ﺪﻨﻨﻛ
. هدﺎﻣآ و ﺎﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ ﺖﻓﺎﻳرد زا ﺲﭘ يزﺎﺳ
نآ ﻪﻨﻴﻬﺑ ،ﺎﻫ ﺶﻨﻛاو يزﺎﺳ نژ ﺮـﻴﺜﻜﺗ ياﺮـﺑPCR
ردespA
ﻢﻳﺰﻧآ ﻂﺳﻮﺗ ﻮﮕﻟا ﻪﺘﺷر ﻪﺑ ﺮﻤﻳاﺮﭘ ﻒﻠﺘﺨﻣ لﺎﺼﺗا يﺎﻫﺎﻣد
Taq DNA
ﺖﻓﺮﻳﺬﭘ ترﻮﺻ زاﺮﻤﻴﻠﭘ )
هرﺎﻤـﺷ ﺮﻳﻮﺼﺗ 1
.(
نﺎﺴﻤﻫ ﺖﺤﺻ رﻮﻛﺬﻣ ﻢﻳﺰﻧآ ﻪﻛ ﻦﻳا ﻪﺑ ﺮﻈﻧ ﻳﻻﺎـﺑ يزﺎﺳ
ﻲ
ﻢﻳﺰـﻧآ ﻂﺳﻮﺗ ﻮﮕﻟا ﻪﺘﺷر ﻲﻳﺎﻬﻧ ﺮﻴﺜﻜﺗ اﺬﻟ ،دراﺪﻧ
PfuDNA
ﺪﺷ مﺎﺠﻧا زاﺮﻤﻴﻠﭘ .
هرﺎﻤﺷ ﺮﻳﻮﺼﺗ 1
ﻪﺠﻴﺘﻧ:
نژ ﺮﻴﺜﻜﺗ زرﺎـﮔآ لژ يور ﺮﺑespA
1 ﺪـﺻرد :
ﻒﻳدر 1 : ﻲﻟﻮـﻜﻟﻮﻣ ﺮﮕﻧﺎـﺸﻧ .DNA
يﺎـﻫ ﻒـﻳدر 2
ﺎـﺗ 9 : لﻮـﺼﺤﻣ
ﻲﻳﺎﻣد نﺎﻳداﺮﮔ ردPCR
55 ﺎﺗ 65 ﻲﺘﻧﺎﺳ ﻪﺟرد داﺮﮔ
.
نژ قﺎﺤﻟا ﺑ رﻮﺘﻛو ردespA
ﻲﻧﺎﻴ
pET28a(+)
:
ﺶﻨﻛاو مﺎﺠﻧا ﺎﺑ ﻂـﺳﻮﺗ ﻪـﻧﺎﮔود ﻲـﻤﻳﺰﻧآ ﻢـﻀﻫ يﺎﻫ
ﻢﻳﺰــﻧآ يﺎــﻫ
BamHI
و
HindIII
تﻻﻮــﺼﺤﻣ يور ﺮــﺑ
رﻮﺘﻛو وPCR pET28a(+)
ﻪـﻧﺎﻳﺎﭘ نﺪـﻣآ ﻢﻫاﺮﻓ ﺎﺑ ، يﺎـﻫ
نورد نژ قﺎــﺤﻟا ﺪــﻨﻳآﺮﻓ ،رﻮــﺘﻛو و نژ ياﺮــﺑ هﺪﻨﺒــﺴﭼ ﻢﻳﺰﻧآ ﻂﺳﻮﺗ رﻮﺘﻛوMCS T4 DNA
ﺪـﺷ مﺎـﺠﻧا زﺎـﮕﻴﻟ .
ﺎـﻫ نﻮﻠﻛ لﺎﻘﺘﻧا زا ﺲﭘ ﻞـﻣﺎﺣ ﻂـﺳﻮﺗ هﺪـﺷ ﺖـﺨﻳراﺮﺗ ي
ﺎـﺑ ،ﺪﻴﻤـﺳﻼﭘ جاﺮﺨﺘـﺳا و ﻊﻳﺎﻣ ﺖﺸﻛ ﻂﻴﺤﻣ ﻪﺑ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧ ﺶﻨﻛاو زا هدﺎﻔﺘﺳا
ﻢﻳﺰـﻧآ ﻂـﺳﻮﺗ ﻲﻤﻳﺰﻧآ ﻢﻀﻫ يﺎﻫ يﺎـﻫ
رﻮﻛﺬــﻣ ﺮﺛﻻادوﺪــﺤﻣ )
هرﺎﻤــﺷ ﺮﻳﻮــﺼﺗ 2
( ، ﻂــﺳﻮﺗPCR
ﺪـﻳدﺮﮔ ﺺﺨـﺸﻣ ﻲﺑﺎﻳ ﻲﻟاﻮﺗ و نژ ﻲﺻﺎﺼﺘﺧا يﺎﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ نﺎﺴﻤﻫ رﻮﺘﻛو نورد ﺖﻴﻘﻓﻮﻣ ﺎﺑ نژ ﻪﻛ ﺖﺳا هﺪﺷ يزﺎﺳ
.
هرﺎﻤﺷ ﺮﻳﻮﺼﺗ 2
ﺐـﻴﻛﺮﺗﻮﻧ رﻮـﺘﻛو يور ﺮـﺑ ﻲـﻤﻳﺰﻧآ ﻢـﻀﻫ ﻲـﺳرﺮﺑ:
pET28a-espA
: ﻒﻳدر 1 : ﻲﻟﻮﻜﻟﻮﻣ ﺮﮕﻧﺎﺸﻧ .DNA
ﻒﻳدر 2 : رﻮﺘﻛو
pET28a-espA
هدرﻮﺨﻧ شﺮﺑ .
ﻒﻳدر 3 : ﻢﻳﺰـﻧآ ﻂﺳﻮﺗ رﻮﺘﻛو ﻢﻀﻫ
BamHI
. ﻒﻳدر 4 : ﻢﻳﺰـﻧآ ﻂـﺳﻮﺗ رﻮﺘﻛو ﻢﻀﻫ
HindIII
. ﻒـﻳدر 5 :
يﺎﻫ ﻢﻳﺰﻧآ ﻂﺳﻮﺗ رﻮﺘﻛو ﻪﻧﺎﮔود ﻢﻀﻫ
BamHI
و
HindIII
.
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧ نﺎﻴﺑ ﻲﺳرﺮﺑ :EspA
نوﺮﭘا لﺮﺘﻨﻛ ﺖﺤﺗ ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ نﺎﻴﺑ يﺎﻘﻟا ﺎﺑ ﻂﻳاﺮﺷ ردlac
لﻮﻠﺳ ،دراﺪﻧﺎﺘﺳا نﻮﻴﺳﺎﺑﻮﻜﻧا ﺎﻘﻟا يﺎﻫ
ء ﺎـﻘﻟا و هﺪﺷ ء
هﺪـﺸﻧ
ﻊﻤﺟ ﻪـﻧﻮﻤﻧ ﺮﻓﺎـﺑ ندوﺰـﻓا زا ﺲﭘ و ﺪﻧﺪﺷ ﻪﺘﺴﻜﺷ و يروآ
يوﺎــﺣ 10SDS
لژ يور ﺮــﺑ ﺪــﺻرد
SDS-PAGE
14
ﺪﻧﺪﺷ زرﻮﻓوﺮﺘﻜﻟا ﺪﺻرد .
ﻧ ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ نﺎﻴﺑ ﻪﻛ داد نﺎﺸﻧ ﺞﻳﺎﺘ
هﺪـﺸﻧ ﺎـﻘﻟا ﻪـﻧﻮﻤﻧ ﺎـﺑ ﻪـﺴﻳﺎﻘﻣ رد هﺪﺷ ﺎﻘﻟا ﻪﻧﻮﻤﻧ ردEspA
ﻲﻣ ﺮﻴﮕﻤﺸﭼ و ﺐﺳﺎﻨﻣ رﺎﻴﺴﺑ ﺪﺷﺎﺑ
) هرﺎﻤﺷ ﺮﻳﻮﺼﺗ 3
.(
هرﺎﻤﺷ ﺮﻳﻮﺼﺗ 3
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ نﺎﻴﺑ ﻪﺠﻴﺘﻧ:
لژ يور ﺮـﺑEspA SDS-PAGE
14 ﺪﺻرد . ﻒﻳدر 1 : ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﻲﻟﻮﻜﻟﻮﻣ ﺮﮕﻧﺎﺸﻧ .
ﻒﻳدر 2 : ءﺎﻘﻟا ﻪﻧﻮﻤﻧ
ﻮﺗ هﺪﺷ ﻂﺳ .IPTG
ﻒﻳدر 3 : هﺪﺸﻧ ءﺎﻘﻟا ﻪﻧﻮﻤﻧ )
ﻲﻔﻨﻣ لﺮﺘﻨﻛ .(
ﮓﻨﻴﺗﻼﺑ نﺮﺘﺳو ﺰﻴﻟﺎﻧآ :
ﺐـﻴﻛﺮﺗﻮﻧ ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﺖﺤﺻ ﻲﺳرﺮﺑ رﻮﻈﻨﻣ ﻪﺑ نﺎﻳﺎﭘ رد ﺪــﺷ هدﺎﻔﺘــﺳا تﻼــﺑ نﺮﺘــﺳو ﺰﻴﻟﺎــﻧآ زاEspA
. ﻦــﻳا ياﺮــﺑ
ﻪﺴﻳﺎﻘﻣ رد ﺰﻟﻮﻠﺳوﺮﺘﻴﻧ ﺬﻏﺎﻛ يور ﺮﺑ ﻪﺘﻓﺮﮔ ﮓﻧر ﺪﻧﺎﺑ رﻮﻈﻨﻣ
ﻲـﺘﻧآ لﺮـﺘﻨﻛ ﻪـﻧﻮﻤﻧ و هﺪﺸﻧ ءﺎﻘﻟا ﻪﻧﻮﻤﻧ ﺎﺑ ـﺑ
يدﺎ ) ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ
(BSA
ﺺﺨﺸﻣ و ﺪﺷ ﻲﺳرﺮﺑ طﻮﺑﺮﻣ ﻲﮕﻧر ﺪﻧﺎﺑ ﻪﻛ ﺪﻳدﺮﮔ
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﻪﺑ ﻞـﺑﺎﻘﻣ رد شدﻮـﺧ ﺖـﺳرد هﺎﮕﻳﺎﺟ ردEspA
ﺪــﻧﺎﺑ 18 راﺮــﻗ ﻦﻴﺌﺗوﺮــﭘ ﻲﻟﻮــﻜﻟﻮﻣ ﺮﮕﻧﺎــﺸﻧ ﻲﻧﻮــﺘﻟادﻮﻠﻴﻛ
ﺖﺳا ﻪﺘﻓﺮﮔ )
هرﺎﻤﺷ ﺮﻳﻮﺼﺗ 4
.(
هرﺎﻤﺷ ﺮﻳﻮﺼﺗ 4
ﻪﺠﻴﺘﻧ:
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﮓﻨﻴﺗﻼﺑ نﺮﺘﺳو ﺬـﻏﺎﻛ يور ﺮﺑEspA
ﺰﻟﻮﻠﺳوﺮﺘﻴﻧ . ر ﻒﻳد 1 :
ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ ﻲﻟﻮـﻜﻟﻮﻣ ﺮﮕﻧﺎـﺸﻧ .
ﻒـﻳدر 2 : ﻪـﻧﻮﻤﻧ
هﺪــﺸﻧ ءﺎــﻘﻟا .
ﻒــﻳدر 3 : ﻂــﺳﻮﺗ هﺪــﺷ ءﺎــﻘﻟا ﻪــﻧﻮﻤﻧ . IPTG
ﻒــﻳدر 4 :
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ تﻼﺑﻮﻨﻤﻳا ﺶﻨﻛاو لﺮﺘﻨﻛ ناﻮﻨﻋ ﻪﺑBSA
وﺎﺣ رﻮﺘﻛو ﺖﺧﺎﺳ ي
نژ EspA
18 نارﺪﻧزﺎﻣ ﻲﻜﺷﺰﭘ مﻮﻠﻋ هﺎﮕﺸﻧاد ﻪﻠﺠﻣ
هرود
مرﺎﻬﭼ و ﺖﺴﻴﺑ هرﺎﻤﺷ ،
117 ، ﺮﻬﻣ 1393
ﺚﺤﺑ
يﺮﺘﻛﺎــﺑ هدور نژﻮﺗﺎــﭘ يﺎــﻫ ﻲﻛﺎــﻧﺮﻄﺧ ﻞــﻣاﻮﻋ يا
نآ ﺎﺑ ﻪﻠﺑﺎﻘﻣ ياﺮﺑ ﺐﺳﺎﻨﻣ ﻲﺗاﺪﻴﻬﻤﺗ ﻪﭽﻧﺎﻨﭼ و ﺪﻨﺘﺴﻫ رد ﺎﻫ
،دﻮــﺸﻧ ﻪــﺘﻓﺮﮔ ﺮــﻈﻧ ﻲــﻣ
ناﺮــﺒﺟ و يﺪــﺟ ﺐــﻗاﻮﻋ ﺪــﻨﻧاﻮﺗ
ﺪـﻨﻨﻛ دﺎﺠﻳا هدﻮﻟآ دﺮﻓ رد ار يﺮﻳﺬﭘﺎﻧ
) 19 - 17
.(
هدﺎﻔﺘـﺳا ﺎـﺑ
يژﻮﻟﻮﻨﻜﺗ زا ﻲﻣ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧDNA
ﺶﺨﺑ ناﻮﺗ ﻦﻳا زا ﻲﻳﺎﻫ
نآ ﻪﻄـﺳاو ﻪـﺑ ﻲـﻳاز يرﺎﻤﻴﺑ زوﺮﺑ رد ﻪﻛ ﻞﻣاﻮﻋ ﺶـﻘﻧ ﺎـﻫ
ﺪـﻳﺪﻧﺎﻛ ناﻮـﻨﻋ ﻪـﺑ ﺎـﺗ دﻮﻤﻧ نﺎﻴﺑ و نﻮﻠﻛ ار ،ﺪﻧراد ﻲﺳﺎﺳا ـﻫ نآ يزﺎﺳ ﻦﻤﻳا ناﺰﻴﻣ ﻦﺴﻛاو درﻮـﻣ نژﻮﺗﺎـﭘ نآ ﻪـﻴﻠﻋ ﺎ
ﺪﻧﺮﻴﮔ راﺮﻗ ﻲﺳرﺮﺑ
) 20
.( E. coli
ﻪﻳﻮـﺳ
O157:H7
ﺎـﺑ ﺰـﻴﻧ
ﺐﻴﺳآ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﻦﻴﺴﻛﻮﺗ ﺪﻴﻟﻮﺗ ﻪـﻟﻮﻟ هراﻮـﻳد ﻪـﺑ يﺪﺟ يﺎﻫ
ﻢﻴﺧو ﻞﻜﺷ رد و شراﻮﮔ ﻪـﺑ ﻼﺘﺒﻣ داﺮﻓا ﻪﻴﻠﻛ ﻪﺑ ﺐﻴﺳآ ﺮﺗ
ﻲﻣ نآ دﻮﺷ
) 21
.(
يﺎـﻫرﻮﺘﻛﺎﻓ ﻲﺳرﺮﺑ ﺎﺑ ﻪﻌﻟﺎﻄﻣ ﻦﻳا رد اﺬﻟ
رﻮﻛﺬﻣ نژﻮﺗﺎﭘ ﻲﻨﻳﺰﮔ ﻪﻧﻻ رد ﻞﻴﺧد ﻪﻛ ﺪﻳدﺮﮔ ﺺﺨﺸﻣ
ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ EspA
ﻲـﻣ ﻞﻜـﺷ ار ﻲـﻳاﺮﺠﻣ هدﻮﻟﺎـﺷ ﻪـﻛ ﺪـﻫد
يرﺎﻤﻴﺑ يﺎﻫرﻮﺘﻛﺎﻓ ﺮﻳﺎﺳ لﺎﻘﺘﻧا ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ نﺎـﺑﺰﻴﻣ لﻮﻠﺳ ﻪﺑ از
ﻲــﻣ ﺪﻧﻮــﺷ . يرﺎــﻤﻴﺑ يﺎــﻫرﻮﺘﻛﺎﻓ ﻪــﻠﻤﺟ زا زا ﺮــﮕﻳد ياز
يﺮﺘﻛﺎﺑ
E. coliO157:H7
و ﺪﻴﻟﻮﺗ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧ ﻞﻜﺷ ﻪﺑ ﻪﻛ
ﻪﺑ هﺪﺷ ﻲﺳرﺮﺑ ﻦﺴﻛاو ﺪﻳﺪﻧﺎﻛ ناﻮﻨﻋ ﻲﻣ ،ﺪﻧا
ﻓ ﻪﺑ ناﻮﺗ رﻮﺘﻛﺎ
FepA
ﻦﻴـﺴﻛﻮﺗ ﻒـﻠﺘﺨﻣ يﺎﻫﺪـﺣاو ﺮﻳز ،ﻦﻴﻤﻴﺘﻨﻳا ، يﺎـﻫ
و ﺎﮕﻴﺷ دﻮﻤﻧ هرﺎﺷاTir
) 22
، 23
.(
ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ ﺪـﻴﻟﻮﺗ رﻮـﻈﻨﻣ ﻪﺑ EspA
ﺖـﺳﺎﻛ ﻪـﻴﻬﺗ و ﻲـﺣاﺮﻃ ﻪﺑ زﺎﻴﻧ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧ ﻞﻜﺷ ﻪﺑ دﻮﺑ ﻲﻧژ . ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ ﻖـﻴﻗد ﻲﻟاﻮـﺗ اﺬﻟ
EspA
ﻲـﻧژ ﻚـﻧﺎﺑ زا
ﻲﻟاﻮﺗ نﺪﻧادﺮﮔﺮﺑ زا ﺲﭘ و ﺪﻳدﺮﮔ سﺎﺒﺘﻗا
ﻪـﺑ يﺪﻴـﺳا ﻮـﻨﻴﻣآ
ﻲﻟاﻮﺗ
،يﺪﻴﺗﻮﺌﻠﻛﻮﻧ ياﺮـﺑ ﻲـﺻﺎﺼﺘﺧا يﺎﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ ﻲﺣاﺮﻃ
ﺪﺷ مﺎﺠﻧا نآ .
ﻪـﺑ رﻮﻛﺬﻣ نژ ﺮﻴﺜﻜﺗ ،ﺎﻫﺮﻤﻳاﺮﭘ ﻪﻴﻬﺗ زا ﺲﭘ
ﻚﻴﻨﻜﺗ ﻚﻤﻛ مﺎـﺠﻧا ﺎﺑ ﻪﻣادا رد و ﺖﻓﺮﻳﺬﭘ ترﻮﺻPCR
ﺶﻨﻛاو يﺎﻫ ﻢﻀﻫ لﻮﺼﺤﻣ يور ﺮﺑ ﻲﻤﻳﺰﻧآ
،رﻮﺘﻛو وPCR
ﺪﺷ مﺎﺠﻧا ﺖﻴﻘﻓﻮﻣ ﺎﺑ رﻮﺘﻛو نورد نژ قﺎﺤﻟا ﺪﻨﻳآﺮﻓ .
يﺮﺘﻛﺎــﺑ
E. coli
ﻲــﻜﻳ زا ﻦﻴــﻟوا و ــﺳو ﻊﻴ ﻦﻳﺮــﺗ
نﺎﺑﺰﻴﻣ ﻲﻳﺎﻫ ﺖﺳا ﻪﻛ ياﺮﺑ ﺪﻴﻟﻮﺗ ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ يﺎﻫ گﻮـﻟوﺮﺘﻫ هدﺎﻔﺘﺳا
ﻲﻣ نﺎـﻴﺑ ﻪـﻠﻤﺟ زا ﻲـﻧاواﺮﻓ يﺎـﻳاﺰﻣ ياراد و دﻮـﺷ
ﻢــﻛ ﺪــﻴﻟﻮﺗ ﻪــﻨﻳﺰﻫ و لﻮــﺼﺤﻣ يﻻﺎــﺑ نﺎﻣﺪــﻧار ،ﻊﻳﺮــﺳ ﻲــﻣ ﺪــﺷﺎﺑ
) 24
. (
نﺎــﻴﺑ ياﺮــﺑ ﻪــﻛ ﻲﻧﺎــﺑﺰﻴﻣ ﻪــﻛ ﻦــﻳا ﻪــﺑ ﺮــﻈﻧ
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﺐﻴﻛﺮﺗﻮﻧ ﺎﺑ ،دﻮﺑ ﻪﺘﻓﺮﮔ راﺮﻗ ﺮﻈﻧ ﺪﻣEspA
يﺮﺘﻛ
E. coli BL21(DE3)
رﻮـﺘﻛو زا اﺬـﻟ ،دﻮـﺑ
pET28a(+)
هدﺎﻔﺘــﺳا ﺖــﺳا رﺎﮔزﺎــﺳ نﺎــﺑﺰﻴﻣ ﻲﻧﺎــﻴﺑ ﻢﺘــﺴﻴﺳ ﺎــﺑ ﻪــﻛ ﺪﻳدﺮﮔ
) 24
.(
ﻦـﻳا رد ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ نﺎـﻴﺑ ﻪـﻛ ﺖﺳا ﺮﻛذ ﻪﺑ مزﻻ
يﻮـﻗ نوﺮﭘا لﺮﺘﻨﻛ ﺖﺤﺗ ﺎﻫرﻮﺘﻛو زا ﻪﺘﺳد ﻲـﻣlac
ﺪـﺷﺎﺑ
ﻪﺑ ﺎﺑ ﻪﻛ زﻮـﺘﻛﻻﻮﻟآ ﻲﻋﻮﻨﺼﻣ گﻮﻟﺎﻧآ يﺮﻴﮔرﺎﻛ )
(IPTG
ﺮﭘ نﺎﻴﺑ ﻪﺑ ﻖﻓﻮﻣ ﻦﻴﺌﺗو
رد ﺐـﺳﺎﻨﻣ رﺎﻴـﺴﺑ راﺪـﻘﻣ ردEspA
ﻢﻳﺪﺷ هﺪﺸﻧ ﺎﻘﻟا ﻪﻧﻮﻤﻧ ﺎﺑ سﺎﻴﻗ .
ﻦﻴـﻤﻫ زا ﺰﻴﻧ نارﺎﻜﻤﻫ وGu
ياﺮﺑ ﻪﻧﺎﻣﺎﺳ نﺎﺴﻤﻫ
نﺎﻴﺑ و يزﺎﺳ هدﺎﻔﺘﺳاEspA
و ﺪﻧدﺮﻛ
ار ﻲﺑﻮﺧ ﺞﻳﺎﺘﻧ ﻪﺑ
ﺖﺳد ﺪﻧدروآ
) 10
، 11
.(
نﺎﺴﻤﻫ يزﺎﺳ نﺎﻴﺑ و
ترﻮﺻ ﻪﺑ ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﻦﻳا قﺎﺤﻟا
يﺎـﻫرﻮﺘﻛﺎﻓ ﺮﻳﺎـﺳ ﺎـﺑ هﺪـﺷ
رﺎﻤﻴﺑ رد ﻞﻴﺧد ي
ﻞﻣﺎﻋ ﻲﻳاز ﺖﻴﻘﻓﻮﻣ ﻞﻜﺷ ﻪﺑEHEC
ﺰـﻴﻣآ
ﻞﻜـﺷ ﻪـﺑ ﺮﺠﻨﻣ و هﺪﺷ مﺎﺠﻧا ﻲﺒـﺳﺎﻨﻣ يﺎﻫرﺎﺘﺧﺎـﺳ يﺮـﻴﮔ
ﺖﺳا هﺪﺷ نآ راﺪﻳﺎﭘ نﺎﻴﺑ ياﺮﺑ
) 11
، 12
.(
رﻮـﻈﻨﻣ ﻪﺑ نﺎﻳﺎﭘ رد
ﻲـﻔﻴﻛ ﺶﻨـﻛاو زا هﺪـﺷ نﺎـﻴﺑ ﻦﻴﺌﺗوﺮـﭘ ﺖﺤﺻ زا نﺎﻨﻴﻤﻃا ﻪﻜﻟ
ﻲـﺘﻧآ زا هدﺎﻔﺘـﺳا ﺎﺑ نﺮﺘﺳو يراﺬﮔ
ﻲـﻠﭘ يدﺎـﺑ لﺎـﻧﻮﻠﻛ
ﻪﻛ ﺮﻤﻳﺎﻛ ﻲﻧژ ﻲﺘﻧآ ﻪﻴﻠﻋ نآ يﺎﻫﺪـﺣاو ﺮـﻳز ءﺰﺟEspA
ﻲﻣ ﻲﺘﻧآ ﻪﻛ ﺪﻳدﺮﮔ ﺺﺨﺸﻣ و ﺪﻳدﺮﮔ هدﺎﻔﺘﺳا ،ﺪﺷﺎﺑ يدﺎﺑ
ﭻﻴـﻫ نوﺪـﺑ و ﻲﺑﻮـﺧ ﻪـﺑ ﺖـﺴﻧاﻮﺗ رﻮﻛﺬﻣ ﺶﻨـﻛاو ﻪـﻧﻮﮔ
ساﺮﻛ ﺪﻨﻛ ﻲﻳﺎﺳﺎﻨﺷ ارEspA
.
يراﺰﮕﺳﺎﭙﺳ
نﺎــﻳﺎﭘ زا ﻲــﺸﺨﺑ ﺶﻫوﮋــﭘ ﻦــﻳا ياﺮــﺘﻛد هرود ﻪــﻣﺎﻧ
يژﻮﻟﻮﻨﻜﺗﻮﻴﺑﻮﻧﺎﻧ ﻪﺘﺷر ﻲﺼﺼﺨﺗ ﻲﺸﺨﺑ ﻲﻔﻄﺼﻣ
ﻲﻣ ﺪﺷﺎﺑ
ﻪﻨﻳﺰﻫ ﻪﻛ نآ يﺎﻫ
ﻦﻴـﺴﺣ مﺎـﻣا هﺎﮕـﺸﻧاد ﻂﺳﻮﺗ )
ع ( ﻦﻴﻣﺄـﺗ
ﺖﺳا هﺪﻳدﺮﮔ .
ﻲﻣ مزﻻ ﻦﻴﻟﻮﺌـﺴﻣ و ﺪﻴﺗﺎـﺳا ﻲﻣﺎـﻤﺗ زا ﻢﻧاد
ار ﻲﻧادرﺪﻗ و ﺮﻜﺸﺗ لﺎﻤﻛ هﺎﮕﺸﻧاد ﺶﻫوﮋﭘ هزﻮﺣ مﺮﺘﺤﻣ مراد نﺎﻴﺑ .
References
1. Jafari A, Aslani MM, Bouzari S. Escherichia coli: a brief review of diarrheagenic
pathotypes and their role in diarrheal diseases in Iran. Iran J Microbiol 2012; 4(3): 102-117.
2. Nazarian S, Gargari SL, Rasooli I, Alerasol M, Bagheri S, Alipoor SD. Prevalent phenotypic and genotypic profile of enterotoxigenic Escherichia coli among Iranian children. Jpn J Infect Dis 2014;
67(2): 78-85.
3. Bidet P, Mariani-Kurkdjian P, Grimont F, Brahimi N, Courroux C, Grimont P, et al.
Characterization of Escherichia coli O157:
H7 isolates causing haemolyticuraemic syndrome in France. J Med Microbiol 2005;
54(Pt 1): 71-75.
4. Mousavi SL, Rasooli I, Nazarian S, Amani J.
Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, toxigenic Vibrio cholerae, and Salmonella typhimurium by multiplex PCR.
Iran J Clin Infect Dis 2009; 4(2): 97-103.
5. Eklund M. Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Findings from Humans in Finland. Helsinkh Publications of the National Public Health Institute. 2005.
6. Croxen MA, Finlay BB. Molecular mechanisms of Echerichia coli pathogenicity.
Nat Rev Microbiol 2010; 8(1): 26-38.
7. Mecsas JJ, Strauss EJ. Molecular Mechanisms of Bacterial Virulence: Type III Secretion and Pathogenicity Islands. Emerg Infect Dis 1996; 2(4): 270-288.
8. Wirth T, Falush D, Lan R, Colles F, Mensa P, Wieler LH, et al. Sex and virulence in Escherichia coli: an evolutionary perspective.
Mol Microbiol 2006; 60(5): 1136-1151.
9. Schroeder GN, Hilbi H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev 2008;
21(1): 134-156.
10. Gu J, Liu Y, Yu S, Wang H, Wang Q, Yi Y,
et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli trivalent recombinant vaccine containing EspA, intimin and Stx2 induces strong humoral immune response and confers protection in mice. Microbes Infect 2009;
11(10-11): 835-841.
11. Gu J, Ning Y, Wang H, Xiao D, Tang B, Luo P, et al. Vaccination of attenuated EIS- producing Salmonella induces protective immunity against enterohemorrhagic Escherichia coli in mice. Vaccine 2011;
29(43): 7395-7403.
12. Cheng Y, Feng Y, Luo P, Gu J, Yu S, Zhang W, et al. Fusion expression and immunogenicity of EHEC EspA-Stx2A1 protein: implications for the vaccine development. J Microbiol 2009; 47(4): 498- 505.
13. Stothard P. The Sequence Manipulation Suite:
Java Script programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.
Biotechniques 2000; 28(6): 1102-1104.
14. Vincze T, Posfai J, Roberts RJ. NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Res 2003; 31(13):
3688-3691.
15. Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning laborator manual. 3th ed. NewYork: CSHL Press; 2001.
16. Bollag DM, Rozycki DM, Edelstein SJ.
Protein Methods. 2th ed. New York: Wiley- Liss; 1996.
17. Reis RS, Horn F. Enteropathogenic Escherichia coli, Samonella, Shigella and Yersinia: cellular aspects of host-bacteria interactions in enteric diseases. Gut Pathog 2010; 2(1): 1-12.
18. Nazarian S, Gargari SL, Rasooli I, Hasannia S, Pirooznia N. A PLGA-encapsulated chimeric protein protects against adherence
وﺎﺣ رﻮﺘﻛو ﺖﺧﺎﺳ ي
نژ EspA
20 نارﺪﻧزﺎﻣ ﻲﻜﺷﺰﭘ مﻮﻠﻋ هﺎﮕﺸﻧاد ﻪﻠﺠﻣ
هرود
مرﺎﻬﭼ و ﺖﺴﻴﺑ هرﺎﻤﺷ ،
117 ، ﺮﻬﻣ 1393
and toxicity of enterotoxigenic Escherichia coli. Microbiol Res 2014; 169(2-3): 205-212.
19. Nazarian S, Mousavi Gargari SL, Rasooli I, Amani J, Bagheri S, Alerasool M. An in silico chimeric multi subunit vaccine targeting virulence factors of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) with its bacterial inbuilt adjuvant. J Microbiol Methods 2012; 90(1): 36-45.
20. Demain AL, Vaishnav P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnol Adv 2009; 27(3): 297- 306.
21. Gyles CL. Shiga toxin-producing Escherichia coli: An overview. J Anim Sci 2007;
85(13supp): 45-62.
22. Larrie-Bagha SM, Rasooli I, Mousavi- Gargari SL, Rasooli Z, Nazarian S. Passive immunization by recombinant ferric enterobactin protein (FepA) from Escherichia coli O157. Iran J Microbiol 2013; 5(2): 113- 119.
23. Garcia-Angulo VA, Kalita A, Torres AG. Advances in the development of enterohemorrhagic Escherichia coli vaccines using murine models of infection. Vaccine 2013; 31(32): 3229-3235.
24. Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol 1999;
10(5): 411-421.
