はじめに
海洋は地球の総面積の7割を占め，地球生態系におい て，物理化学的な均衡を保つための大きな緩衝材となっ てきた．海洋には大気中の約50倍もの炭素が蓄積され ており，化石燃料の燃焼などにより放出された二酸化炭 素の約3分の1を吸収しているとIPCCによって報告さ れている（IPCC第4次報告書，2007）．海洋による大気 からの二酸化炭素吸収量は，2000 〜 2005年の年平均で は22±5億トン（炭素重量換算）と見積られている．こ れは，同期間に人間活動により放出された二酸化炭素
（炭素重量換算）の約3分の1に相当する（1, 2）．このよう な海洋の保全は地球環境保全と直結するものであり，現 在海洋環境の詳細な調査が進められている．
一方，生物が海で誕生して以来，海は多種多様な環境 を提供し，そこでは多くの生物種の進化が繰り返されて きた．海洋には，陸上にはない特殊環境が多く存在し，
多様な生物種の存在が期待されている．現在までのとこ ろは，発見された生物種は陸上生物種に比べて少ない が，先端技術の開発を背景に海洋生物学は広がりを見せ ており，多くの新奇（新規）生物種が発見されている．
マリンバイオテクノロジーの分野も，近年の分子生物学 やゲノムサイエンスの飛躍的な進展により新しい展開が 始まっている．特に，高速次世代シークエンサーやさま ざまなオミックス解析技術，ハイスループットスクリー
ニング技術は，新たな研究戦略を可能にしている．
このような状況のなか，海洋生物遺伝子資源として海 洋微生物の解析と有効利用研究が進められている．さま ざまな環境に微生物は生息しており，深海も含め多くの 特殊環境からの分離培養が試みられ，それらの生理機 能，遺伝子の解析が行われてきた．しかしながら，豊富 な生物資源のなかで，99%以上が「難培養微生物（バク テリア），生きているが培養ができないバクテリア （via- ble, but nonculturable （VBNC） bacteria）」であること も知られている．ゲノム解析のコスト減と高速化，分子 生物学技術の向上などから直接的なゲノム活用の道が拓 かれつつあり，「難培養微生物」も直接ゲノムを解析す る「メタゲノム解析」アプローチによって資源活用する 研究が盛んになってきた．また，それらの遺伝子情報か ら新しい「難培養微生物学」も起こりつつある．
本稿では，海洋カイメン共在バクテリアメタゲノム解 析と有用遺伝子スクリーニング，さらに難培養微生物の 解析を推し進めるための一手法として有効なシングルセ ル解析に関しても紹介する．
海洋微生物のメタゲノム解析
環境微生物のメタゲノム解析は近年進展しており，多 くのプロジェクトが推進されている．たとえば，アメリ カ の ゲ ノ ム デ ー タ ベ ー ス Genome Online Database
セミナー室
海洋生物資源への期待：マリンバイオテクノロジーの現場から-5海洋生物遺伝子資源活用への新しいアプローチ
シングルセルゲノム情報に基づいたメタゲノム解析への期待
竹山春子 *1，モリテツシ *
2
*1早稲田大学先進理工学部生命医科学科，*2早稲田大学創造理工学部国際教育センター
（Gold : http://www.genomesonline.org/cgi-bin/GOLD/
index.cgi） におけるメタゲノムシークエンスは2,000を 超えている．シークエンス対象のカテゴリーは300以 上，その3分の2は自然環境サンプルであり，残りの大 半は宿主共生系，一部に活性汚泥などの工業的サンプル が含まれている．海洋微生物（バクテリア）でのメタゲ ノム解析プロジェクトは日本でも少しずつ数が増えてい るが，必ずしも大型プロジェクトの数は多くない．平成 23年度からスタートした科学技術振興機構・戦略的創 造研究推進事業・CREST 「海洋生物多様性および生態 系の保全・再生に資する基盤技術の創出」では，海洋生 態系の評価にメタゲノム手法を取り入れたプロジェクト がいくつか進められている（3）．
1. カイメン共在バクテリアメタゲノム解析
多くの生物の体内に共生している微生物が多く報告さ れている．海洋生物，特に無脊椎動物における共生・共 在微生物の解析が進みつつある．無脊椎動物であるカイ メン（ポリフェラ門，約15,000種）からは，産業や医療 分野において非常に重要な生理活性をもつ二次代謝産物
であるポリケチド，抗生物質（4），抗腫瘍物質（5），免疫抑 制剤（6） などが多く発見されている（図1）．このような 二次代謝物はカイメンの化学的な防衛機構の一つと考え られている（7）．また，カイメン共生・共在バクテリアの メタゲノム解析により多くの有用物質や新規のポリケチ ド合成遺伝子（ポリケチドシンターゼ遺伝子）がカイメ ン共生バクテリアから発見され（8, 9），二次代謝産物の真 の生産者がカイメン内に存在するバクテリアであること が支持されている（10）．
筆者らは，沖縄（石垣）を中心としてカイメン共在バ クテリアメタゲノム解析とその利用研究を展開してき た（11） （図2）．海域に広く存在する2種類のカイメン
, の共在バクテリアからメ タゲノムの取得，16S rDNAを指標にした多様性解析，
メタゲノムライブラリーの作成を行った． 結果，多様 な未知バクテリアの存在を確認することができ，たとえ 時期が異なっていてもホストのカイメン種に特有なバク テリアプロファイルが見いだされることが示された（図 3）．一方，別途解析を行っていたサンゴの共在バクテリ アでは，同種でも個体や季節の違いによってバクテリア
図1■カイメン共在バクテリアの重要性
プロファイルは大きく変動することが示されている．サ ンゴは，よりきれいな環境を好むことから，バクテリア 叢もその環境変動を大きく受けること，バクテリアとホ ストとの相互関係に違いもあると推測される．
メタゲノムから40 kbp程度までの長鎖のインサート や3 〜5 kbp程度のゲノム断片を大腸菌をホストとして メタゲノムライブラリーを構築した．遺伝子解析と
での有用遺伝子のスクリーニングを目的として，
インサートの両端配列のシークエンスとデータベース化
（遺伝子名，COG ID，ホモロジーなどでターゲット酵 素の新規配列検索することが可能）を行った．（図4）．
2. メタゲノムライブラリーからの有用遺伝子スクリー ニング
シークエンスデータ（約110 Mbp）から工業的に重要 とされる45変換酵素遺伝子を選択し，そのホモローグ を配列情報を基にスクリーニングしたところ，4,075遺 伝子が見いだされた．すでに報告のある酵素遺伝子に高 い相同性をもつものは，全体で1%程度であったが，中 程度の相同性（相同性が50 〜 80%）を示すものが30%
程度，それ以下が70%の割合で見いだされた．新規配 列をスクリーニングするには，既知の配列とはあまり相 同性の高くないものをターゲットとすることが必要であ 図2■カイメン共在バクテリアメタ ゲノム解析とその利用研究 マリンメタゲノム
共在・共生微生物
メタゲノムのクローニング
海洋無脊椎動物 活性スクリーニング
遺伝子配列解析による スクリーニング
メタゲノムの確保と保存
（ライブラリー作成）
図3■海洋カイメン共在バクテリア の16S rDNA解析
ることからも，これらの情報は，まだ分離培養されてい ない未知バクテリアのポテンシャルを示すものでもあ る．シークエンスパフオーマンスが向上した現時点で は，メタゲノムを有用遺伝子の分離源とすることによっ て多くの宝を得ることが可能だと思われる．
一方，有用遺伝子の活性スクリーニングとして，エス テラーゼの活性スクリーニングを行った．得られたエス テラーゼ活性陽性クローンの全挿入塩基配列を解析した ところ，一般的なエステラーゼに見られるモチーフをも たず，GDSL配列をもつGDSLファミリーに属するユ ニークな分類の酵素遺伝子が見つかった（12）．GDSL配 列はこのファミリーの加水分解酵素に見られるが，報告 例は多くない．特にGDSLファミリーに属するエステ ラーゼはほとんどなく，新規エステラーゼであることが 示された．また，耐塩性についても非常にユニークで，
通常，酵素活性は回復することなく高塩濃度で失活する ところ，NaCl存在下0 〜1.9 Mまでは，塩濃度上昇に伴 い活性が45%まで減少したが，1.9 〜 3.8 Mでは活性が 68%まで回復した．
大腸菌ホストの表現型をターゲットとした耐塩性，重 金属濃縮機能を付与する遺伝子群スクリーニングから は，ATP-dependent protease の一種であるFtsHがス クリーニングされてきた．FtsH遺伝子はホストの大腸 菌にも存在する遺伝子であるが，ホスト大腸菌のFtsH 遺伝子をプラスミドに組み込み，ホスト内で高発現させ ても同様な塩耐性が見られなかったことから，海洋バク テリア由来のFtsH遺伝子の新規特徴と考えられた．重 金属濃縮機能遺伝子としては，カドミウム濃縮にかかわ
る新規の遺伝子を見いだした．遺伝子配列にはユニーク な繰り返し配列と2つの機能未知の配列部位が存在し た．現在それらの遺伝子配列の機能解析を行っている．
このように，表現型を指標にスクリーニングをするこ とによって，新しい機能や未知の遺伝子がスクリーニン グされる．ここでは，ホストとして大腸菌を用いている が，さまざまなほかのバクテリアを用いることによって より興味深い遺伝子（群）を手に取ることが可能であろ う．または，ホストのゲノムを改変することなく，目的 とした特性を付与したホストを作り出すことにもメタゲ ノムが利用できると考える．
シングルセル解析への展開
有用微生物の単離培養から難培養微生物のメタゲノム 解析，遺伝子資源の活用と研究は展開しているが，そこ には大きな課題が存在する．すなわち，遺伝子のホスト 生物が依然として未知のまま，明らかにすることができ ないことである．これを解決するために塩基の配列を基 本にしたSOM解析などで推測することも試みられてき たが，遺伝子の水平伝播などが繰り返されるゲノムでは その手法論では必ずしも良い成果が得られていない．
シングルセル解析は，細胞生物学研究を中心として最 近重要な解析ツールとして注目されている．培養細胞に おいても細胞間に個性が存在することが明らかになって おり，それらの平均値を求めるような網羅的な解析手法 がいかに集団を理解するうえで精度の低い方法論である かが指摘されている．個々の細胞を1細胞レベルで解析 図4■メタゲノムデータベース
することが重要であり，その手法論も精力的に開発され ている．環境微生物解析も同様に，メタゲノムなどの環 境微生物叢の網羅的解析の情報を個々の未知微生物のゲ ノム情報として解析しデータベース化することができれ ば，今まで手つかずであった難培養（未知）微生物の解 析，利用の分野を大きく発展させることができる．この ような解析において，シングルセルの分取・ゲノム抽 出・シークエンス解析を効率よく行うシステムも必要で ある．すでにゲノム増幅手法は進みつつあり，細胞一つ を効率的にハンドリングするためのマイクロ流体工学を 利用したデバイス作りも進展しつつある．シングルセル 解析によって得られたリファレンスシークエンスを基に することによって，メタゲノムから移行しつつあるメタ トランスクリプトームの情報もより明確に解析しやすく なる．
1. カイメン共在バクテリアのシングルセルゲノム解析 シングルセル解析とは細胞集団内の個々の細胞におけ る状況や機能を解明する解析アプローチであり，今では フローサイトメトリーやマイクロ流体デバイスなどを用 いた解析法が主流になっている（13）．また，バクテリア
シングルセルゲノム解析も今まさに進みつつあり，その 対象は腸内細菌から環境難培養微生物へと広がってい る．
従来の分子生物学的手法などを取り入れながら，カイ メン内の共生バクテリアとカイメンから発見されたポリ ケチドの関連性をシングルセルレベルで解析した例を紹
介する． からは抗腫瘍物質である
Onnamide Aが分離されている（14）．また，メタゲノム 解析を用いた近年の研究で，このOnnamide Aがカイメ ン共在バクテリア由来であることが判明している（8）．し かしながら，それを証明にするには，生産菌の分離が求 められるが，難培養バクテリアであることから，分子生 物学的なアプローチによりOnnamide Aを生産するバ クテリアの同定を行った．まず， 内部組織 を破壊し，遠心分離によってバクテリア画分を取得し，
セルソーターでシングルセルを分取，細胞破砕を行い，
Multiple displacement amplification （MDA） 法により ホールゲノム増幅を行った．そして，Onnamide A生産 菌の同定を行うために，増幅ゲノムに対してNested- PCRによりOnnamide A合成PKS遺伝子断片の増幅を 行った．最後にOnnamide A合成PKS遺伝子断片が確
図5■単一細胞解析技術を用いたカイメン共在バクテリアおよびカイメンから発見された有用化合物の関連性の解明
認されたサンプルに対し，16S rDNA解析を行い，On- namide A生産共生細菌を同定した（図5）．このよう に，シングルセル解析技術を応用することにより，二次 代謝産物および生理活性物質とその生産細菌を直接関連 づけることができるだけではなく，その生産菌または目 的となるバクテリアのゲノム情報なども取得することが できる．
シングルセルオミックス解析では，動物細胞では，ト ランスクリプトームまでは技術が発展しているが，プロ テオーム，メタボロームにはまだまだ多くの課題があ り，より高感度な計測技術の開発が不可欠である．バク テリアレベルでは，もっとメッセージ量が少ないことか らゲノム解析でとどまっているが，将来的には難培養微 生物の機能解析がトランスクリプトーム解析から明らか になる日もくるであろう．
2. シングルセル解析をサポートするマイクロ流体デバ イス技術
フローサイトメータは細胞などの生体試料からさまざ まな大きさの粒子まで，多様なターゲットを解析するこ とが可能である．一つひとつにレーザーを当て，粒子の 大きさや粒子内部の構造，標識蛍光などの情報を取得す る．その解析速度は，現在，最高で30,000粒子／秒であ る．さらに，欲しい特徴をもつ粒子集団をソーティング によって個別に分取することが可能である．ハイスルー プット技術として最も普及している装置ではあるが，簡 便性は必ずしも高くはない．そこで小型化をめざし，微 細加工技術を用いて作製されるマイクロ流路デバイスを 一細胞捕捉，一細胞解析用に最適化する研究が増えてい る．
特に，マイクロ流体デバイス内でのドロップレットの 作成とその利用に関しては，ハイスループットスクリー ニング，微量サンプルやシングルセルの解析への応用に 非常に有用な技術として期待されている．マイクロド ロップレットは，2相（有機相と水相）システムによっ
て作成され，有機相中に水相ドロップレット（1 pL 〜 数十 μL）を形成する．有機相と水相のように混ざらな い流体からなるマイクロドロップレットは特に化学や生 化学分野において，高効率な反応場として幅広い応用が 進んでいる．ドロップレットが小さくなるほど，単位体 積あたりの表面積が大きくなるため，反応効率が高くな る．そのため近年では，より小さなサイズのドロップ レットを作成する手法が報告されている．筆者も，図6 に示すようにマイクロ流体工学を利用したデバイスによ り作成したマイクロドロップ内へのシングルセル包埋を 行っており，今後この技術によりバクテリアシングルセ ル解析が効率的に進むと考えている．
おわりに
日本は国土を海洋に囲まれた海洋国家であり，排他的 経済水域 （exclusive economic zone ; EEZ） は世界第6 位の広さである．このような海洋をいかに有効利用する かは，今後の日本の発展に大きく寄与するものである．
2007年4月に海洋基本法が成立したが，海洋資源開発は その施策の重要項目である．多くの研究者が，精力的に これらの資源の利活用を進めており，新たなネットワー クができることを期待している．
文献
1） IPCC第4次報告書，2007.
2） 気象庁 HP （http://www.data.kishou.go.jp/kaiyou/db/
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3） JST戦略的創造研究推進事業「海洋生物多様性および生
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www.jst.go.jp/kisoken/crest/research̲area/ongoing/bu- nyah23‒3.html）
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7） T. R. Thomas, D. P. Kavlekar & P. A. LokaBharathi : 図6■単一細胞解析に向けたマイク ロ流体デバイスを用いたマイクロド ロップの作製
（A） シリコン基板を用いたマイクロ デバイス流路内でのマイクロドロッ プ形成，（B） マイクロドロップ ス ケールバー：50 μm，（C） マイクロド ロップ内に包埋された単一バクテリ ア（GFP発現大腸菌）蛍光画像で観 察
, 8, 1417 （2010）.
8） J. Piel, D. Hui, G. Wen, D. Butzke M. Platzer : , 101, 16222 （2004）.
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12） Y. Okamura, T. Kimura, H. Yokouchi, M. Meneses-Oso- rio, M. Kato, T. Matsunaga & H. Takeyama :
, 12, 395 （2010）.
13） 竹山春子，岡村好子： シングルセル解析の最前線 ，松
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pp. 208‒214, 2010.
14） S. Matsunaga, N. Fusetani & Y. Nakao : , 48, 8369 （1992）.
竹山 春子（Haruko TAKEYAMA）
＜略歴＞1992年東京農工大学工学研究科物質生物工学専攻博士後 期課程修了，博士（工学）／マイアミ大学博士研究員／1994年よ り東京農工大学工学部生命工学科（助手，准教授，教授）／2007 年より早稲田大学先進理工学部生命医科学科教授＜研究テーマと 抱負＞環境生物遺伝子資源の解析と有効活用，それらを支える解 析技術の開発．難培養微生物学の扉を開くことを目指しています
＜趣味＞庭いじり
モリ テツシ（Tetsushi MORI）
＜略歴＞2009年東京農工大学大学院工学府生命工学専攻博士後期 課程修了，博士（工学）／2009 〜 2010年日本学術振興会 （JSPS）
外国人特別研究員／2010年早稲田大学創造理工学部国際教育セン ター助教，現在に至る＜研究テーマと抱負＞単一細胞解析分野に 興味をもち，現在，カイメンから検出されている二次代謝産物を ターゲットとし，単一細胞解析技術を用いて，その生産細菌の探 索を行っている．さらに，環境の微生物からメタゲノムを抽出し，
新規および高活性海藻分解酵素生産菌の探索も行っている＜趣 味＞水泳，テニス，映画鑑賞
