糸状菌，いわゆるカビは，古来より 発酵や醸造に利用されてきたが，一 方，様々な二次代謝産物を生産するこ とでも知られる．
β
-ラクタムに代表さ れる抗生物質や高脂血症薬スタチン類 などの医薬として，あるいはアフラト キシンのようなマイコトキシンなど，良くも悪くもヒトに対して生理活性を 示す化合物の生産が数多く報告されて いる．なかでも酢酸‒マロン酸経路で 作り出されるポリケタイド化合物は，
芳香族化合物から環状・非環状脂肪族 系化合物，テルペノイドやアミノ酸・
ペプチドなどとのハイブリッド化合物 など，化学構造的にも極めて多様性に 富む化合物群であり，糸状菌がこれら ポリケタイド化合物を生合成する機構 が注目されている．
ポリケタイドとしての炭素骨格を最 初に構築する鍵酵素がポリケタイド合 成 酵 素 Polyketide Synthase （PKS）
である．PKSの触媒する中心反応は，
acetyl-CoAなどのアシルスターター と malonyl-CoA伸長単位との縮合反 応であり，その繰返し回数により生成 物の炭素鎖が決定される．また，各縮 合反応ごとに生成した
β
-カルボニル 基の還元反応が制御されており，さら に閉環反応やPKS酵素からの遊離反 応など，PKSは多段階の反応を触媒，制御し，各PKSに特異的なポリケタ イド化合物を生成する．
PKSはそのタンパク質構造の特徴 から，1本のポリペプチド上に各触媒 酵 素 ド メ イ ン が 存 在 す る 多 機 能 型
type I 型と，各酵素が独立のポリペ プチドとして存在する type II 型，そ して縮合酵素KS単独の type III 型の 3種類に分けられる．PKSは，糸状菌 のみならず，バクテリア，植物に存在 し，最近では，動物での存在も報告さ れているが，それぞれ特徴があり，糸 状菌のPKSは主として type I 型であ り，それもバクテリアのマクロライド 生合成に見られるモジュール型 mod- ular type とは異なり，各触媒酵素ド メインが繰り返して機能するsingle moduleの繰返し型 iterative type I 型 で あ る．ま た，数 は 少 な い な が ら type III 型PKSの存在も明らかにされ ている．本稿では，糸状菌の itera- tive type I PKS （iPKS） について，そ の構造と反応機構に関する研究の現状 と課題を考えてみたい．
糸状菌のiPKS
多機能型マルチドメイン酵素である iPKSにおいて，PKSとして機能する ために必須のドメインは，縮合酵素 ketosynthase （KS）, アシル基転移酵 素 acyltransferase （AT）, およびアシ ルキャリヤープロテイン acyl carrier protein （ACP） である．ATによる基 質のロード，KSおよびACP上のacyl 基と伸長単位の縮合による炭素鎖の伸 長がPKSとしての中心反応であり，
これら3つのドメインを中心として，
他の機能ドメインが付加してiPKSと
なる．糸状菌のiPKSはそのドメイン 構成により大きく3つに分類される．
1） 6-methylsalicylic acid synthase
（MSAS）, 2） non-reducing type PKS
（NR-PKS）, 3） highly reducing type PKS （HR-PKS）, である．MSASとそ の生産物である 6-methylsalicylic acid は，Birchによる酢酸仮説の実証，ポ リケタイド経路の確立に重要な役割を 果たし，また，Lynenによって最初に PKSとしての酵素活性が確認された 歴 史 的 なPKSと 産 物 で も あ る．
MSASはPKS反応中の還元反応の関 与 か ら partially reducing type PKS
（PR-PKS） と 呼 ば れ る 場 合 も あ る．
NR-PKSは，芳香族ポリケタイドを，
また，HR-PKSは脂肪族ポリケタイド を生成する．これら3種のiPKSの基 本的なドメイン構成を図1に示すが，
KS-AT-ACPの基本ドメインに各々特 徴的なドメインを付加している．NR- PKS間，HR-PKS間においては基本的 なドメイン構成は同じでありながら，
プログラミングともいうべき制御機構 の違いにより，各PKS特異的に様々 な骨格のポリケタイド化合物が作り出 されるが，このプログラミング機構の 解明がiPKS研究の重要課題となって いる．
スターターの選択
PKS反応において，スターターと なるacyl基の選択は，生成物の化学
生 物 コ ー ナ ー
糸状菌のポリケタイド生合成反応
構造にかかわる重要な要因である．一 般的にはacetyl-CoAがスターター基 質となることから，スターター選択の 特異的なドメインについてはあまり考 慮されてこなかったが，特殊なスター ターを用いるNR-PKSの解析からその 存在が明らかにされた．
Norsolorinic acid synthase （NSAS）
は，アフラトキシン生合成のPKSで ありhexanoyl基をスターターとして7 つのmalonyl-CoAとの縮合によりnor-
solorinic acid anthroneを 生 成 す る．
NR-PKSのN-末領域は，重要な機能が あると考えられてはいたものの，他の 機能タンパク質との相同性が低くその 役 割 は 不 明 で あ っ た．Townsendら は，この領域がATの GHSXG motif と 類 似 し た GXCXG motif を も ち，
ATの活性中心である His-Cys cata- lytic dyad の存在から，この領域が starter-ACP acyltransferase （SAT）
ドメインであると予想した．実際，大
腸菌で発現させたNSASのSATドメ インタンパク質を用いてhexanoyl基 を選択的にtransferするその機能を実 証した．アフラトキシン生合成遺伝子 クラスターに存在するHexA/HexB脂 肪酸合成酵素がそのACP上に生成す るhexanoyl基がNSASのSATドメイ ン に よ りNSASにtransferさ れ，
NSAS反応のスターターとなる（1）
．同
様のacyl基 transfer が，zearalenone の生合成において報告されており，こ図1■代表的なiPKSのアーキテクチャとドメイン構成
の場合は，HR-PKSによって生成した acyl中間体がSATドメインの働きに よりNR-PKSに渡されると考えられ る．このSATの場合，興味深いこと にスターターの選択性は非常に甘く，
C6-C16のacyl-CoAを 基 質 と し て も NR-PKSに受け入れられ，炭素鎖伸長 が進行する（2）
．一方，HR-PKSおよび
MSASにおいては，対応するSATド メインは存在していない．β
-カルボニル中間体の生成とその還元スターター acyl基に対して，malo- nyl伸長単位が縮合し，炭素鎖の伸長 が起こる．糸状菌のiPKSにおいては，
バクテリアに見られるようなメチルマ
ロニルやエチルマロニルなどの修飾マ ロニル単位はほとんど利用されず，専 らmalonyl-CoAが伸長の基質となっ ており，ATドメインの機能により malonyl基がACPのホスホパンテテ インアームにロードされる．スター ター acyl基とmalonyl伸長単位がKS の働きによって，脱炭酸を伴うクライ ゼン型の反応で縮合し，
β
-カルボニル 中間体が生成する．NR-PKSの場合に は，β
-カルボニル中間体は還元を受け ずにさらにC2単位の伸長が所定の鎖 長に達するまで進行する．一方，HR- PKSにおいては，伸長サイクルごと に還元反応がプログラムされており，完全に飽和されたメチレンから，水酸 基，二重結合，そして全く還元を受け ないカルボニル基まで還元の多様性が
もたらされている．
HR-PKSにおいては，ケト還元KR，
脱水DH，エノイル還元ERの還元ド メインが揃っているが，縮合サイクル ごとに
β
-カルボニルがどこまで還元さ れるかが異なっている．その制御機構 は，大変興味深いものの詳細は不明で ある．また，ロバスタチン生合成の LovB PKSのように本体のERドメイ ンが不活性型であり，独立したERタ ン パ ク 質 を 要 求 す る 例 も あ る（3）．
LovBにおいても，ERタンパク質は縮 合回数特異的に関与しており，その相 互作用と制御についても今後の研究課 題として残されている．図2■iPKSの基本反応と関与する ドメイン
炭素鎖伸長中の修飾
スターター acyl基とmalonyl伸長単 位が縮合して生成した
β
-カルボニル中 間体に対して，還元以外の修飾反応も 起こる場合がある．その一つは，α
-炭 素のC-methyl化である．糸状菌iPKS では，methylmalonyl基を伸長単位として利用しない代わりに，メチルトラ ンスフェラーゼMeTドメインを用い て縮合により生成した
α
-炭素にメチル 基を導入する．このMeTドメインは，専らHR-PKSに見られるが，NR-PKS においても存在しており，前者におい ては，PKSタンパク質の中央にMeT ドメインがあり，後者においては，C 末側のACPドメイン下流に存在して
いる．このMeTドメインも繰り返さ れる縮合反応ごとに関与しうるはずで あるが，多くの場合，縮合回ごとに選 択 的 に 機 能 し て お り，そ の on-off switch の機構は不明である．もっと も顕著なメチル化の例は筆者のグルー プが報告したPKSNによるalternapy- roneの生成反応であろう．ジャガイ モ 夏 疫 病 菌 よ り ク
図3■糸状菌におけるポストPKS反応の例
ローニングしたHR-PKSであるPKSN
を で発現させたと
ころ，新規化合物alternapyroneが生 産された．alternapyroneは，標識酢 酸およびメチオニンの投与実験から，
デカケタイド鎖にメチオニン由来の8 個の側メチルが導入され生合成される 化合物であり，PKSNのMeTドメイ ンにより，9回の縮合反応のうち，8 回の各縮合反応後にACP上の
β
-ケト アシルチオエステルに -アデノシルメ チオニンを基質としてメチル基を導入 するものと考えられている（4）．
ま た，Lovastatin生 合 成 のPKSで あるLovBでは，炭素鎖伸長途中の段 階でPKS自身によりDiels‒Alder環化 が起こると考えられ，実際にVederas らはtriene中間体の -acetylsysteam- ine thioesterを基質としたLovBの
反 応 で，LovB特 異 的 なDiels‒
Alder環 化 体 の 生 成 を 確 認 し て い る（5）
．同様のDiels‒Alder環化はcom-
paction 生 合 成 の PKS や HIV inte- grase阻害剤であるequisetin生合成の PKS反応でも進行すると考えられて いる．炭素鎖伸長後の修飾
NR-PKSおよびMSASにおいては，
生成したポリケトメチレン鎖中間体が いわゆるアルドール型の閉環反応によ り環化・芳香化される．この反応にか かわるドメインとして，NR-PKSにお
いて同定されたドメインがproduct template （PT） ドメインである．
Townsendらは，前述のNSASにつ いて，SATドメインと同様に機能不 明であったATとACP間の領域につ いて，これが炭素鎖伸長により生成す るポリ-
β
-ケト中間体の安定化とアル ドール型の閉環・芳香化に関わるドメ インであると考え，これをPTドメイ ンとして， の系で実証した（6）．
例 え ば，NSASをSAT-KS-ATのN側 部分とPTを含むC側部分とに分けて 発現，再構成することにより，PTド メインの機能を確認し，さらにPTド メインタンパク質の結晶構造解析から 閉環チャンバーと閉環を触媒するHis- Asp触媒残基を見いだし，変異導入に より確認している（7）．アルドール閉環
した芳香族化後物を与えるNR-PKSに おいては，PTドメインおよびこれら の触媒残基が保存されており，PTド メインの閉環チャンバーのサイズによ りポリ-β
-ケト鎖の大きさ，炭素鎖長 が決定され，位置特異的な閉環，芳香 化が進行すると考えられる．生成物のリリース
ポリケトメチレン鎖の伸長とそれに 伴うメチル化や還元，あるいは環化に よって生成したPKS産物は，ACP上 のホスホパンテテインアーム上にロー ドされた状態となり，最終的にチオエ ステルからの遊離によって生成物を与
える．この生成物のリリース反応にお いても，各iPKSにより異なる制御機 構が存在している．
NR-PKSにおいては，そのC-末にチ オエステラーゼTEドメインが存在す るものがある．当初，このTEドメイ ンは，専ら最終産物の加水分解による 遊離を触媒する単なるチオエステラー ゼと考えられていたが，
の WA PKS の解析から，このドメイ ンがクライゼン型の閉環を伴うPKS からの産物の遊離を触媒することが明 らかにされ（8）
，この機能をもつドメイ
ンは，Claisen cyclase （CLC） ドメイ ンと呼ばれ，その結晶構造も明らかに されている（9）．また，HR-PKSと協同
で働き，HR-PKSで生成したacyl鎖を スターターとして芳香環を付加する NR-PKSにおいては，そのTEドメイ ンがバクテリアのmodular PKSのTE と同様にマクロラクトン化を触媒する 例も報告されている（10）．同じくNR-
PKSである糸状菌のオルセリン酸合 成酵素も同様のTE様ドメインをもつ が，この場合には，生成物の構造から もCLCとは異なり，単なるチオエス テラーゼとして機能していると考えら れる（11）．また，NR-PKSの一部では，
このようなTE様ドメインをもたない PKSもあり，その生成物の遊離機構 に興味がもたれていたが，この場合に は，PKS遺伝子の近傍に
β
-lactamase 様遺伝子の存在が認められ，この酵素 と TE-less PKS を共発現させること により，期待されたPKS生成物が遊離することが報告されている（12）
．ま
た，このβ
-lactamase様タンパク質が Claisen型の閉環反応に関与する例も 報告されており（13），その触媒能の違
いは興味深い点である．一方，ほとんどのHR-PKSはこのよ うなTE様ドメインをもたず，alter- napyroneに見られるように，ピロン 環の生成がPKS酵素からの生成物遊 離のドライビングフォースとなってい ると考えられる．
MSASもTE様ドメインをもたず，
その生産物の遊離機構について，いく つかの仮説が提案されていた．最近，
森 口 ら は，MSASで あ る
のATXを用いて解析を行い，
これまでDHドメインとされてきたド メインが実際には最終産物の遊離を触 媒するドメインであることを明らかに し た（14）
．
こ の ド メ イ ン の 変 異 体 は 6MSAを 生 産 し な い が，6MSAを ACPに結合しており，さらにこのド メインを含む単独のタンパク質によっ て変異体に結合した6MSAが遊離さ れることが示された．このドメインは 6MSA-ACPチオエステルを加水分解 して生成物をリリースすることから，新たに thioester hydrolase （TH） ド メインと命名された．
PKS反応後の修飾
PKSによって生成，遊離した化合 物は，通常，さらに代謝変換されて最
終産物となる．特に酸化的反応が多く 関与し，PKS産物とは見かけ上全く 異なる骨格となることも多い．その典 型的な例はアフラトキシンであり，そ の70 kbにも及ぶ生合成遺伝子クラス ター中には，P450などの酸素添加酵 素だけをとって見ても7個の遺伝子が 存在している．このようなPKS反応 後の修飾反応は様々ではあるが，最 近，遺伝子レベルで解明された例をい くつか紹介する．
Diels‒Alder環化
Diels‒Alder環化については，LovB のようにPKS自身が触媒する例もあ り，また，化合物の構造から見ても天 然物生合成においてしばしば出現する 重要な反応である（16）
．笠原らは，so-
lanapyrone生産菌である よ り，HR-PKS遺伝子をクローニング し，これを足掛かりにsolanapyrone 生合成遺伝子クラスターの同定に成功 した（17）．Solanapyrone生合成におい
ては，Diels‒Alder酵素であるsolana- pyrone synthase が及川らにより酵素 レベルで研究されていた（18）．その不
安定性などのため，実態解明が進んで いなかったが，solanapyrone生合成 遺伝子クラスター中にsolanapyrone synthaseと考えられる遺伝子が見い だされ，これを で発現，精製 した酵素を用いて，Diels‒Alder産物 を特異的に与えることが確認された．フェノール酸化的カップリング ポリケタイドに限らず，フェノール 酸化的カップリングも重要な生合成反 応であり，二次代謝産物骨格形成の鍵 反応となっている．その例として，
griseofulvinの生合成系が有名である が実態は最近まで不明であった．最 近，Tangらのグループは，griseoful- vin生産菌のショットガンゲノム解析 よ りgriseofulvin生 合 成 のNR-PKSを 同定した．スピロ骨格を作るフェノー ル酸化的カップリング反応を触媒する 酵素遺伝子を検索したところ，これが P450と考えられることを報告してい る（19）
．類似のスピロ骨格を作るフェ
ノール酸化的カップリング酵素として は，筆者らのグループが報告したgeo- din生合成のブルー銅酸化酵素の例が ある（20）が，同様の反応が異なるタイ プの酸化酵素により触媒されること は，生合成系の多様性を考えるうえで も大変興味深い．プレニル化ポリケタイド
テルペノイドと他の生合成系産物と の複合型の化合物はメロテルペノイド と称されるが，最近，糸状菌の芳香族 ポリケタイドとイソプレノイドからな るメロテルペノイド複合経路が解明さ れた（21）
．本誌において久城らによっ
て紹介されている（22）が，ピリピロペン生産菌のゲノム情報より，PKS遺 伝子，プレニル基転移酵素，テルペン 環化酵素などを含む生合成遺伝子クラ スターを検索し，候補遺伝子クラス ターの遺伝子を異種発現で機能同定す ることによりピリピロペン生合成遺伝 子クラスターであることが同定されて いる．ポリケタイドベースのメロテル ペノイドは，これまで放線菌などにお いてよく研究されてきたが，糸状菌に おいても，arisugacin類やandrastatin 類などの興味深い化合物の生産が知ら れており，その生合成機構が解明され ていくものと期待される．
糸状菌のiPKSはマルチドメインの 非常に大型の酵素であり，かつ還元や メチル化の修飾酵素ドメインが炭素鎖 伸長の縮合回数ごとにon-offがプログ ラムされており，その解明はまだ途上 に あ る．し か し，NR-PKSのSATド メ イ ン，PTド メ イ ン，MSASのTH ドメインなどが新たなドメインが同定 され，iPKS反応にかかわる役者はほ ぼ出揃ったと考えられる．今後，各ド メ イ ン タ ン パ ク 質 の 構 造，そ し て iPKS全長のタンパク質構造が解明さ れることにより，この繰返し型特有の 制御プログラムが明らかにされていく ことを期待したい．また，次世代，
次々世代シークエンサーの開発によ り，糸状菌のゲノム情報が極めて迅速 に得られるようになっている．糸状菌 においては，二次代謝産物の生合成遺 伝子がクラスターを形成していること
が多く，iPKS本体のみならず，PKS 反応後の修飾酵素に関する情報も一気 に取得できる時代になってきている．
これらの情報を集約することによっ て，近い将来には，iPKSをベースと した炭素骨格構築とその後の修飾反応 のプログラムを人の手で書き上げ，デ ザインした化合物を生物合成できる日 がくるのではと願っている．
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