セミナー室
植物の高CO2応答-9葉肉コンダクタンス
溝上祐介，寺島一郎
東京大学大学院理学系研究科
はじめに
光合成の基質であるCO2 は，外気から葉緑体内のス トロマまで濃度勾配に従って拡散し，カルビン・ベンソ ン回路のリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ／オキ シゲナーゼ （RuBisCO） によって固定される．実験室で 光合成や蒸散を測定する場合には，同化箱内の空気をよ く撹拌するので，葉の表面と空気との摩擦による空気の よどみである境界層の拡散抵抗 （ b） は無視できるほど 小さい．したがって，通常，CO2 拡散に対する抵抗を，
外気から気孔を介して細胞間隙に至る拡散に対する気孔 抵抗 （ s） と，葉内の細胞間隙中の拡散，細胞壁液相へ の溶込み，および細胞壁表面から葉緑体ストロマへの拡 散に対する抵抗をまとめた葉肉抵抗 （ m） の2つに分け て考える．外気中のCO2 濃度 （ a） は，気孔抵抗によっ て細胞間隙のCO2 濃度 （ i） まで低下し，さらに，葉肉 抵抗によって葉緑体内のCO2 濃度 （ c） にまで低下す る．気孔抵抗，葉肉抵抗の逆数は，CO2 の通りやすさを 表し，気孔コンダクタンス （gs）, 葉肉コンダクタンス
（gm） と呼ばれる（図1）．CO2 はRuBisCOの存在する葉 緑体内で固定されるため，光合成速度の環境応答を研究 するためにはgs, gm, およびこれらによって決定される
c を正確に知ることが重要である．
葉肉抵抗は，細胞間隙，細胞壁，細胞膜，細胞質，葉 緑体包膜，ストロマの拡散抵抗の総和である．外気から
細胞間隙への拡散距離に比べて，細胞壁表面から葉緑体 ストロマまでの距離は短いが，液相におけるCO2 の拡 散速度は気相中の約1/10,000程度（25℃におけるCO2 の大気中，水中それぞれの拡散係数は1.56×10−5, 1.7×
10−9 m2 s−1）であることなどにより，葉面積あたりの 気孔抵抗と葉肉抵抗の値は同程度になる（1, 2）．すなわ ち，葉肉抵抗は無視できない大きさなのである．
gm 研究の歴史
葉肉抵抗が光合成を律速する原因として重要視され始 めたのは，それほど昔のことではない．Nobelら（3） は，
葉肉細胞表面積（葉面積あたりの細胞間隙に接した葉肉
図1■大気中から葉緑体ストロマへのCO2 拡散経路
細胞表面積の積算値： mes/ は，陰葉では3程度だが，
陽葉では50にも及ぶ）と光合成との強い相関を見いだ していた．また，Laiskら（4） や刈谷・角田（5） は，細胞 間隙に接した葉緑体表面積の積算値 （ c） がより重要で あることを指摘していた．しかし，1980年代前半まで は，葉肉での抵抗は無視されることも多かった．たとえ ば，Faquharらの光合成モデル（6） でも， i は c と等し いとみなされ，細胞間隙から葉緑体ストロマにかけての CO2 濃度の低下は考慮されていない．Evans（7） は，葉 をすりつぶしてすぐに測定したRuBisCOのカルボキシ ラーゼ活性に対して，飽和光下で測定した光合成速度
（ ） の i に対する依存性を表した ‒ i カーブの，低 CO2 濃度域の傾き（初期勾配）をプロットすると，直線 ではなく上に凸の曲線になることを見いだした（図2）． 低CO2 濃度域ではRuBisCOによるカルボキシラーゼ反 応が光合成を律速するので， i＝ c としたFaquharモ デ ル で は，RuBisCOの カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ 活 性 と ‒
i カーブの初期勾配とは直線関係になる．凸になるこ とは，葉肉抵抗の存在を強く示唆する．Evansら（8） は，
RuBisCOが 12CO2 と 13CO2 を分別して固定するという 性質（同位体分別）を利用した炭素安定同位体法によっ て，初めて gm を測定した．
gm の測定方法
現在，gm はおもに3つの方法で測定される．炭素安 定同位体法， ‒ カーブフィッティング法，蛍光法で ある．いずれも，ガス交換法による光合成速度の測定が 基本となっている．まず，Farquharら（9） の理論に従 い，Evansら（8） が炭素安定同位体法を用いた測定を 行った．この方法は，RuBisCOが 12CO2 を 13CO2 より 好んで固定するという同位体分別の性質を用いている．
RuBisCOは開放系にあれば 12CO2 を優先して固定する．
一方，閉鎖系では，12CO2 も 13CO2 も固定し尽くす．葉 はこれらの中間にあたるいわば半開放系である．半開放 系においても，葉は 12CO2 を優先的に固定するので，同 化箱に入る空気の 13CO2 /12CO2 よりも，出てくる空気 の 13CO2/12CO2 は大きくなる．何らかのストレスで大気 から葉緑体内ストロマへCO2 が拡散しづらくなった場 合などには，より閉鎖系の度合いが高まるので，葉は相 対的に 13CO2 をより固定するようになる．葉が固定する CO2 の絶対量とその 13CO2/12CO2 比などから，gm が計 算できる．12CO2 と 13CO2 の存在比の測定には質量分析 器が用いられる．最近では，同位体も測定できる高性能 の 分 光 法，TDLAS （tunable diode laser absorption spectroscopy）, を利用した高時間分解能の測定も行われ るようになってきた.
‒ i カーブフィッティング法では，ガス交換法によ る測定データだけを用いる．強光下で測定した光合成速 度 （ ） は， i＜200 ppmでは，RuBisCOによるカルボ キシラーゼ反応， i＞300 ppmでは，RuBP再生反応，
より高 i の， が一定となるまたは低下する領域では トリオースリン酸利用反応 （TPU） によって律速され る． ‒ i カーブから gm を求めるためには，gm を一定 と仮定し， i から， ＝gm（ i‒ c） によって c を算出 し， ‒ c カーブがFarquharの理論にうまくフィット する gm を求める．そのためには，RuBisCOのミカエリ ス 定 数 な ど が 既 知 で あ る 必 要 が あ る． ‒ i カ ー ブ フィッティング法は，もっとも簡便な gm の測定法であ るが，後述のように i の変化に伴い gm が変化すること が知られているので，gm を一定とする仮定には問題が あ ろ う（詳 細 は，Ethier and Livingston（10）, Sharkey ら（11） を参照）．
蛍 光 法 で は，ガ ス 交 換 測 定 と パ ル ス 変 調 蛍 光 計
（PAM） によるクロロフィル蛍光測定を同時に行う．ガ ス交換法による光合成速度（CO2 固定速度）は，RuBP 図2■コムギにおける ‒ i カーブ，
および ‒ c カーブの初期勾配と で測定したRuBisCOカル ボキシラーゼ活性との関係 a : ‒ i カーブの低CO2 濃度域の傾 き（初期勾配）と で測定し たRuBisCOカルボキシラーゼ活性の 相関，b : ‒ i カーブの低CO2 濃度 域 の 傾 き（初 期 勾 配） の 逆 数 と RuBisCOカルボキシラーゼ活性の逆 数の相関，c : ‒ c カーブの低CO2 濃度域の傾き（初期勾配）とRuBis- COカ ル ボ キ シ ラ ー ゼ 活 性 の 相 関．
Evans（7） による.
カルボキシラーゼ反応速度を C, オキシゲナーゼ反応速 度を O, ミトコンドリアの呼吸速度を d とすれば，1 回のオキシゲナーゼ反応あたり0.5分子のCO2 が失われ るので， ＝ C−0.5 O− d である．同時にPAMを 用いた蛍光測定も行い，光化学系IIの量子収率である ΦPSII から，葉面積あたりのH2OからNADP＋ までの非 循環的電子伝達速度 （ ） を求める．NADPHの生産速度 は /2である．こうして生産されたNAPDHのすべてが カルビン・ベンソン回路（その速度を C とする）また は光呼吸経路（その速度を O とする）の駆動に用いら れると仮定しよう．これらの反応では，1カルボキシ ラーゼ反応，1オキシゲナーゼ反応あたりどちらも2分 子のNAPDHが使われるので， C＋ O＝ /4である．
これらから Cと Oが求められる．RuBisCOの速度論 パラメーター（カルボキシラーゼ反応とオキシゲナーゼ 反応の最大値， Cmax と Omax, CO2 およびO2 に対する ミハエリス定数， C と O）が既知であれば，以下の計 算式から c が計算され，それから gm（gm＝ /（ i−
c）） も算出できる．
C VV V
V K
K O VV S O
c C
O Omax Cmax
C O
C O
= ⋅ ⋅ ⋅ = ⋅ ⋅ ,
ここで， は比特異係数 （specificity factor） と呼ばれ る． は酸素濃度である．
蛍光法は，このほかにもいくつかの方法がある．詳し くはPonsら（12） を参照していただきたい．
gmの環境応答
gm の絶対値は植物種によって大きく異なり，さらに 環境変化に応答して変化する．gm の制御機構の解明を 目指した研究も行われ始めている．特に，近年の地球大 気CO2 濃度の上昇と関連して，CO2 濃度の変化に対す る gm の変化が注目されている．Flexasら（13） は上述の3 つの gm 測定法を用いて，多くの種において， i が上昇 すると gm が低下すると報告した．一方，Tazoeら（14）
のコムギを用いた実験では， i が変化しても gm がそれ ほど変化しないことが示された．このように，CO2 濃度 変化に対する gm の応答は，植物種によって異なる可能 性もある．現在，CO2 濃度変化に対して gm が変化する メカニズムは全くわかっていない．
乾燥ストレスや塩ストレス条件下では，gs と gm がと もに低下するという報告が多い．しかし，コムギなどの gm がCO2 濃度に応答して変化しない種では，gs と gm
とは，独立した動きを見せるようである．また，空気が 乾燥しVPD（飽和水蒸気圧差）が大きくなると気孔が 閉じ，gs も低下するが，gm はほとんど影響を受けな い（15）．TDLASを用いた研究で，gm はgs よりもCO2 濃 度変化への応答が速いことも示唆されている（16）．
gs, gm が独立して応答するということは，gs とgm は 独立して制御されていることを示している．一方，
gm の計算には，呼吸や光呼吸からのCO2 が影響してい る た め に，gs が 低 下 す れ ば，計 算 に よ っ て 得 ら れ る gm が必然的に低下することも指摘されている（17）． gm の値をより精確に知りたい場合には，低O2 条件で測 定すべきである．これまでに，葉内のCO2 拡散モデル は1次元で考えられてきたが，3次元の拡散モデルの構 築も試みられており，呼吸系や光呼吸系からの影響も含 め，より精確な値の評価が可能になりつつある（18）．
gm の決定要因
gm を決定する要因は，大きく形態的要因と生化学的 要因に分けられる．形態的要因として重要性が指摘され ているのは，細胞間隙の拡散経路，葉緑体が細胞間隙に 接している面積 （ c），細胞壁の厚さである．
細胞間隙の拡散経路のgm への影響は種によって異な る．細胞間隙の抵抗は，通常組成の空気とhelox（窒素
図3■ホウレンソウの葉肉組織
葉緑体が細胞間隙に面していることがわかる．矢印は気孔を示す．
をヘリウムに置き換えた空気，ガスの拡散係数が通常の 空気中の2.3倍になる）を用いて，ガス交換速度を測定 し比較する．Parkhurst and Mott（19） は，厚い葉をもつ 観葉植物 などを用い，同じ i で はhelox中のほうが，光合成速度が有意に高いという結 果 を 得 た．一 方，Gentyら（20） は と
× を用いた比較実験で，大 気とheloxでは差が見られないことを報告している．つ まり，植物種によって葉内の形態が異なるので，細胞間 隙の拡散経路がgm に与える影響も異なる．一般的には，
厚い下面気孔葉では細胞間隙の拡散抵抗は無視できない が，薄い葉や草本植物に多い両面気孔葉では，細胞間隙 の拡散抵抗はほとんど無視できる．
細胞間隙を拡散したCO2 はまず細胞壁に含まれる水 に溶ける．葉緑体が細胞間隙に接している面積 （ c） が，CO2 溶込みの際に有効な面積として重要であること は，古くから指摘されていた（4, 5）．実際に，gm と c と の間には強い正の相関が得られる（21）．葉緑体は光合成 時に細胞間隙に接するように細胞膜に面している（図3）． 葉緑体が細胞膜から離れると，液相での拡散距離が長く なるためにCO2 拡散への抵抗が増すと考えられる．
Tholenら（22） は，葉緑体の光定位運動が正常でないシロ イヌナズナ変異体を用いて， c とgm に良い相関がある ことを示した．また，野生型でも，青色光の照射によっ て葉緑体の位置が変わるので c が短時間で変化する．
Tholenら（22） は，これに伴い gm も変化することも見い だした．
液相に溶け込んだCO2 は細胞壁を横断するので，細 胞壁の厚さは gm の重要な決定要因である．Kogami ら（23） は，富士山の高地と低地のイタドリを比較し，高 地のものは葉肉細胞の細胞壁が厚く gm が低いことを報 告した．gm は一年生草本，多年生草本，落葉広葉樹，
常緑広葉樹などの植物の機能型 （functional type） に よって異なり，この順に小さくなる．この傾向のかなり の部分は，細胞壁の厚さの違い（1年生草本の0.1
μ
mか ら常緑広葉樹の0.4 〜0.5μ
mまで，上記の機能型の順に 厚くなる）によって説明できる．生化学的な要因としては，カルボニックアンヒドラー ゼ （CA） と細胞膜局在型アクアポリン （PIP） の関与が 考えられている（図4）．CAは葉肉細胞の細胞膜，細胞 質，葉緑体包膜，ミトコンドリアに局在し，pHに依存 して，CO2＋H2O⇄HCO3−＋H＋, の反応を触媒する．
アポプラストのpHは約5.8で，細胞質のpHは約7.4, 強 光下のストロマのpHは約8.0である．このため，液相 に溶け込んだCO2 は，細胞質やストロマではCAによっ
てHCO3− となる（pH 5.8では ［HCO3−］/［CO2］＝0.063, 7.4では15.8, 8.0では63.1である（2）．気相のCO2 濃度が一 定であり，液相の ［CO2］ と平衡状態にあるとすれば，
液相の ［CO2］ は一定である．したがってCAの活性が 十分であれば，高pH条件では拡散する無機炭素種の濃 度が上昇することになる．HCO3− の液相中の拡散は，
CO2 よりもやや遅いが，サイトゾルと葉緑体内では HCO3− 濃度勾配も形成され，拡散が促進されていると される．Priceら（24） によって，タバコの葉緑体局在型 CAのアンチセンス体が作成され，gm へのCAの寄与が 検討されたが，明確な結果は得られていない．シロイヌ ナズナでは高発現型の
α
タイプCAが3分子種，β
タイ プCAが6分子種存在している．CA分子種の一つのア ンチセンス体を作成しても，ほかのCAによる相補が考 えられるため，多重変異体などを用いた実験が望まれる．細 胞 膜 局 在 型 の ア ク ア ポ リ ン （plasma membrane intrinsic protein） PIP は，水の拡散を促進する水チャン ネルとして発見された．近年，PIPの分子種のうちに CO2 透過能をもつものが報告され，葉肉細胞でのCO2 拡散への関与が注目されている．過剰発現体やアンチセ ンス体の作出により，特定のPIPが gm に影響すること が報告されている（25, 26）．なお，筆者らは，CO2 透過能 をもつPIPをcooporinと呼ぶことを提唱している．coo はCO2 を意味するとともに，カーボニックアンヒド ラーゼとcooperateしていることも意味している（27）．
水透過型PIPでは，乾燥ストレス時の脱リン酸化によ る活性低下が報告されている（28），また，pHによるプロ トン化による活性の変化も報告されている（29）．coopo- rinでも，リン酸化・脱リン酸化やプロトン化による短 期的な活性制御を受け，それが gm に反映されている可 能性がある．
図4■カルボニックアンヒドラーゼ （CA） とCO2 透過型アクア ポリン （PIP） の葉内CO2 拡散への寄与を想定した模式図
gm の問題点と解明によって期待されること gm の測定は，いくつかの仮定を含むモデルに従って 行 わ れ て い る．つ ま り，直 接，葉 肉 組 織 に お け る CO2 の透過性を測定することができていない．そのた め，現在でも，モデルの改良が行われている．また，
gm を精確に測定するためには，質量分析器やTDLAS 分析器などの高価な装置を用いる必要があることも，研 究の進展を律速する要因となっている．
gm の制御機構を解明することで，葉肉組織をCO2 が 透過しやすく，乾燥ストレス時などでもCc を高く保つ ような植物体の作出が期待されている．また，いくつか の植物種について報告されているように，CO2 濃度の上 昇は長期的にもgm の低下を招き，光合成速度を低下さ せる．高CO2 条件で起こる光合成のダウンレギュレー ション現象を含めた植物の高CO2 応答を解明するため にも，高CO2 環境下でのgm 低下メカニズムの解明を急 がなければならない．
謝辞：筆者らの研究は，文部科学省新学術領域「植物高CO2 応答」の科 研費によっています．
付記：筆者らの研究室で管理している質量分析器は，最先端研究基盤事 業「植物科学最先端研究拠点ネットワーク」の備品で，どなたでも利用 できます．興味のある方は以下のURLをご覧ください （http://www.
psr-net.riken.jp/index.html）. 新学術領域「植物高CO2 応答（領域代表：
寺島一郎）」の活動については以下のURLをご覧ください （http://plant.
biology.kyushu-u.ac.jp/shinryoiki/index.html）.
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プロフィル
溝上 祐介（Yusuke MIZOKAMI）
＜略歴＞2009年国際基督教大学教養学部 理学科卒業／2011年東京大学大学院理学 系研究科修士課程修了，現在同大学院博士 課程在学中／日本学術振興会特別研究員
（DC2）＜研究テーマと抱負＞葉の蒸散と CO2 取り込みのバランスとジレンマ＜趣 味＞テニス，サーフィン，ピザ作り 寺島 一郎（Ichiro TERASHIMA）
＜略歴＞1985年東京大学大学院理学系研 究科博士課程修了（植物学専攻），理学博 士／同年オーストラリア国立大学博士研究 員／1988年東京大学理学部助手／1994年 筑波大学生物科学系助教授／1997年大阪 大学大学院理学研究科教授／2006年東京 大学大学院理学系研究科教授＜研究テーマ と抱負＞葉の光合成系の構築機構，ソー ス‒シンク関係，植物の発生過程における システミック制御＜趣味＞音楽（コンサー ト通いとクラリネットによる騒音発生）， 落語（寄席通いと被害者の多い実演），気 の合う人と酌み交わす酒
