【解説】
糖鎖修飾はタンパク質の主要な翻訳後修飾の一つであり，さ まざまな疾患で糖鎖構造の変化がタンパク質の機能変異を引 き起こしている例が報告されている．しかし，糖鎖の機能解 析は難しく，糖鎖構造の差異が特定のタンパク質の機能に及 ぼす影響や病態との因果関係を明らかにすることは既存の方 法では困難であるために，多くの分子機構は依然として不明 である．そこでわれわれは，特定のタンパク質上の特定の糖 鎖構造がタンパク質の動態に及ぼす影響やその分子メカニズ ム を 明 ら か に す る た め に，蛍 光 共 鳴 エ ネ ル ギ ー 移 動
（FRET） の 原 理 を 用 い た 糖 タ ン パ ク 質 イ メ ー ジ ン グ ツ ー ル を開発した．本稿では，われわれの開発した糖タンパク質イ メージング法の概要と実例を紹介するとともに，克服すべき 問題点と今後の展望について概説する．
糖鎖は「細胞の顔」と呼ばれる．糖鎖は生体内では主 に細胞表層に存在しており，細胞の表面を密に覆ってい る．「顔」としての役割の有名な例がABO式血液型であ ろう．血液型は赤血球の表面にある糖鎖の微細な構造に よって決まっている．糖鎖の特徴として構造多様性と不
均一性が挙げられるが，それゆえに糖鎖が関与する生命 現象は多岐にわたる．
糖鎖の多くはタンパク質や脂質に結合しており，細胞膜 タンパク質や分泌タンパク質の大部分は糖鎖修飾を受けた 糖タンパク質である．生体内の糖タンパク質上の糖鎖構造 は不均一である．タンパク質部分が同じでも，糖鎖構造が 異なるものが複数存在している．これらはグライコフォーム と呼ばれている．グライコフォームは発生や組織分化，が ん化，老化などによっても変化し，タンパク質の機能や物 理的性質を変化させる．なぜ不均一になるのか？ 糖鎖の 合成には多くの種類の酵素が必要である．タンパク質のよ うに設計図があるわけではないため，微小環境からの影響 を受けやすい．すなわち，より敏感に生体内の環境変化を 反映させやすいということでもある．その柔軟さとバリエー ションの豊富さが糖鎖研究を難しく，かつ面白くしている． それでは，生きている細胞内で糖鎖構造の異なる糖タ ンパク質だけを「見える」ようにできないだろうか？
本稿では，タンパク質の機能に微細な糖鎖構造の差異が 及ぼす影響とその重要性を解説するとともに，われわれ の開発したグライコフォームイメージング法を用いた機 能解析について紹介する．
特定の糖鎖構造をもつ標的タンパク質 の蛍光イメージングと細胞内動態解析
芳賀淑美，鈴木 匡
Visualization of Specific Protein Glycoforms by Fluorescence Reso- nance Energy Transfer
Yoshimi HAGA, Tadashi SUZUKI, 理化学研究所グローバル研究 クラスタ糖鎖代謝学研究チーム
糖鎖研究手法の今昔
糖鎖の機能を明らかにするために，従来糖転移反応や プロセシングの，ある特定のステップに対する阻害剤が 広く用いられてきた．さらに，多くの糖転移酵素・糖鎖 修飾酵素遺伝子がクローニングされてからは，これら糖 鎖関連遺伝子のノックアウト・ノックダウンや過剰発現 が行われてきた．これらの研究手法によって糖鎖機能に 関する多くの情報が蓄積し，現在でも糖鎖の複雑な構造 と機能の相関を知るうえで最もスタンダードなものであ る．しかしながら，これらの方法では細胞がもつすべて のタンパク質の糖鎖構造が変化してしまうため，観察さ れた現象が実際に研究対象としているタンパク質の糖鎖 の変化による直接的な効果ではなく，二次的な要因によ る可能性を完全に除外することができない．実際，後述 するようないくつかの例を除き，遺伝子を破壊した結果 もたらされた表現型の分子メカニズムは十分に明らかに されていない．
において特定の糖タンパク質の性質，機能を 生化学的に解析することは可能ではあるが，目的のタン パク質を直接精製する必要があり，大量の出発材料と高 度な精製技術，多大な労力を必要とする．さらに，精製 したタンパク質では における生体内の挙動を追 うことができないという問題もある．
他方，特定の糖をラベル化する研究も進められてい る．シアル酸にケトン基を挿入する方法（1） や過ヨウ素
酸酸化を用いた方法（2, 3） などいくつか報告されている が，現在最もよく用いられているのはアジド‒アルキン ペアのクリック反応を用いた方法である（4, 5）．2000年に Bertozziらによって発表されたこの手法は，糖鎖科学界 に大きな衝撃を与えた．クリック反応とは，シートベル トが「カチッと音を立てて （clicking）」つながるように 素早く簡単かつ安定な結合を作る反応のことである．こ の方法の優れた点は，ほかにどのような官能基が共存し ていても，生体に存在しないアジドとアルキンのみが反 応すること，および，水中でも反応が進行するためにタ ンパク質などの生体分子の活性を損なわないことが挙げ られる．反応に銅イオンが必要なことから生体での使用 が困難であったが，近年銅イオンを必要としない新しい アルキン化合物が次々と報告されており，生細胞や個体 への応用が急速に進んでいる．この方法は，ラベル化し たい糖（もしくはその前駆体）にアジド基またはアルキ ン基を導入した糖誘導体を動物細胞に投与し，その細胞 がもつ糖のサルベージ経路を利用して目的の糖の一部を タグ付き糖に置き換えるというメタボリックラベリング 法である（図1）．現在は動物細胞を用いた実験だけで なく，ゼブラフィッシュやマウスを用いた イ メージングへと研究が展開している（6〜8）．
一方，この方法では外から取り込ませた修飾糖をもつ 複合糖鎖すべてが検出されてしまうため，プロテオミク スなどの網羅的解析や，特定の糖の継時的な局在パター ンの変化の観察には威力を発揮するものの，機能解析に
図1■糖のメタボリックラベリング法
シアル酸の前駆体であるマンノサミンにアジド基を導入した糖誘導体アセチル化アジドマンノサミン （Ac4ManNAz） を用いてシアル酸を ラベル化する例を示す．細胞膜を透過させるため水酸基をアセチル基で保護したAc4ManNAzは，動物細胞に投与されると細胞内でエステ ラーゼによる加水分解を受け，アジドマンノサミン （ManNAz） へと変換される．これが細胞内でシアル酸に代謝変換されることにより，
糖鎖末端のシアル酸部位にアジド基という「タグ」が導入される．アジド糖が取り込まれた細胞を，細胞膜非透過性の蛍光標識クリックプ ローブでラベル化すると，細胞表面の糖鎖が蛍光標識される．
は不向きである．さらに，修飾糖の取り込みによって複 合糖質全体の糖鎖組成や糖鎖の伸長に影響が出る可能性 を否定できない．これまで用いられているアジド糖・ア ルキン化糖によるラベル化法のうち，シアル酸とフコー スの標識に関しては，特に哺乳動物においてはその修飾 は主に非還元末端に限られることから比較的影響は少な いと考えられる．しかし，GalNAz（ -アセチルガラク トサミンの誘導体）のように糖鎖の内部（還元末端側）
を構成する糖に関しては，アジド糖が取り込まれたこと による糖鎖構造の変化の影響は常に考慮に入れておく必 要がある．また，これと関連して，最近GalNAzを用い た実験の際，細胞内の酵素によってGalNAzがGlcNAz に変換されることが示されており（9），少なくとも一部の ラベル化法に関してはその実験結果を慎重に解釈するこ とが求められる．
糖タンパク質グライコフォームと疾病との関係 近年，糖鎖関連遺伝子ノックアウトマウスの詳細な病 態解析により，細胞膜上の受容体などの特定の糖タンパ ク質上の微細な糖鎖構造の変化と疾病との間に関連性が あることが徐々に明らかになり始めた．例として，アス パラギン結合型糖鎖（N型糖鎖）の根元の -アセチル グルコサミンにフコースを転移するFut8 （
α
-1,6 fucosyl- transferase） 遺伝子ノックアウトマウスの研究が挙げられる（10, 11）．Fut8ノックアウトマウスの多くは出生早期
に死亡してしまう．生存した個体についても著しい成長 障害や，肺気腫様症状など，重篤な症状を示す．この原 因を探っていくと，これらの病態は数多くのタンパク質 にフコースがつかないことによる機能変異が積み重なっ て引き起こされたわけではなく，TGF-
β
受容体やEGF 受容体といった特定の糖タンパク質のN型糖鎖にフ コースの付加がなされないことに起因していることが明 らかになった．また，いくつかの種類の筋ジストロ フィーも，α
-ジストログリカンという特定のタンパク質 上の糖鎖修飾の異常によってラミニンとの結合能の低下 が起こることが原因となっている（12）．このように，特 定の糖タンパク質上のグライコフォームの変化がタンパ ク質の生理的性質に影響を与える例の報告は近年ますま す増えてきている（13）．そのため，生体における糖鎖の機能を解明するため に，従来の手法に加えて，特定の糖鎖構造をもつタンパ ク質の挙動を生きた細胞内で解析する技術が求められて いた．
標的タンパク質のグライコフォームの可視化 そこでわれわれは，上述の糖ラベル化技術とGFP可 視化技術を組み合わせ，蛍光共鳴エネルギー移動 （fluo- rescence resonance energy transfer ; FRET） の原理を 用いた糖タンパク質イメージングツールを開発した．わ れわれの開発した手法は，目的のタンパク質に融合させ た蛍光物質と，糖鎖に結合させた蛍光物質間でFRET を観察することで，特定の糖タンパク質における糖付加 状態の差異を明らかにするものである（図2）．FRET とは，近接した2個の色素分子の間で励起エネルギーが 電子の共鳴により直接移動する現象である．このため，
一方の分子（ドナー）の吸収スペクトルに相当する光で 励起すると，供与体で吸収された光のエネルギーによっ て他方の分子（アクセプター）から蛍光が放射される．
具体的には，まず，C末端にGFPを融合させたター ゲットとなるタンパク質を動物細胞に発現させる．次に アジド基というタグをもつ単糖の誘導体（アジド糖）を 細胞の培養液に添加して培養する．今回はシアル酸をラ ベ ル 化 す る た め，ア セ チ ル 化 ア ジ ド マ ン ノ サ ミ ン
（Ac4ManNAz） を用いた（図1）．Ac4ManNAz は細胞 内で代謝され，アジド基をもつシアル酸 （SiaNAz） へ と変換される．これによって，糖鎖末端のシアル酸部位 にアジド基という「タグ」が導入される．アジド糖が取 り込まれた細胞を，細胞膜非透過性の蛍光標識クリック プローブでラベル化すると，細胞表面の糖鎖が蛍光標識 される．標的の糖タンパク質に特定の糖鎖構造が結合し たときにのみFRETのシグナルが検出できる仕組みで ある．
図2■標的糖タンパク質の特定の糖鎖修飾可視化のスキーム まずGFP（ドナー）を目的のタンパク質に融合させて細胞内に発 現させる．その細胞にアジド糖を取り込ませた後，アジド基に蛍 光物質（アクセプター）を結合させる．特定の糖をもっていない 場合にはGFPのシグナルしか検出できないが，特定の糖で修飾さ れていた場合，FRETシグナルが検出される．
モデルタンパク質を用いた糖タンパク質糖鎖の可視 化と動態解析
モデルタンパク質としてインスリン応答性グルコース 輸送体GLUT4を用いた例を紹介する．GLUT4は，主 に脂肪細胞や筋肉に存在し，血中グルコース濃度の恒常 性維持を担う12回膜貫通型タンパク質で，細胞外ルー プに唯一のN型糖鎖をもつ．GLUT4は通常はそのほと んどが細胞内の特殊な小胞（GLUT4貯蔵小胞）に蓄積 しているが，インスリンの刺激に応答して小胞輸送に よって細胞表面へと移行し，グルコースを細胞内に取り 込む．血糖値が平常化してインスリンがなくなると，細 胞膜に存在していたGLUT4はエンドサイトーシス後に 適切なソーティング過程を経て，一部がGLUT4貯蔵小 胞へと帰還し，貯蓄される．その輸送を正確に制御する 細胞内情報伝達機構は複雑であり，局在変化の制御メカ ニズムはいまだ不明な点が多い．しかし，近年，糖鎖構 造を変えたGLUT4や糖鎖欠損GLUT4はインスリン応 答経路を通らないことが明らかとなり，GLUT4上のN 型糖鎖の構造が正しい経路を通るための目印となってい る可能性が示唆されている（14）．
GFPを 融 合 し たGLUT4をHeLa細 胞 に 発 現 さ せ，
Ac4ManNAz含有培地で培養後，蛍光標識クリックプ ローブを反応させた．共焦点レーザー顕微鏡で観察した ところ，GLUT4を標識したGFPと，アジド化シアル酸
（SiaNAz） を標識したテトラメチルローダミン双方がそ ろったときにのみ，FRETシグナルを検出した（図3）．
すなわち，さまざまな糖鎖構造をもつGLUT4のうち，
シアル酸をもつものだけを区別して可視化することに成 功した．
本研究の重要なポイントは，そのFRETシグナルが 真に，同一タンパク質からの分子内FRETによっても たらされたものか，を注意深く検討することである．今 回われわれは，（1） 488 nmの励起光における蛍光の波 長スキャンをし，GLUT4-GFPと蛍光標識されたアジド 糖が共存するときにだけ580 nm付近に蛍光発光スペク トルのピークが観察されること，（2） その蛍光発光スペ クトルのピークが糖鎖を付加できない GLUT4-GFP
（N57Q） を用いたときはほとんど検出されないこと，
（3） アクセプターフォトブリーチング法（アクセプター を褪色させたときに，エネルギーを受け取る相手がいな くなることによりドナーの蛍光回復が起こる．これに よってFRETの真偽を評価する方法）によってGFPの 蛍光強度の増強を確認すること，といったさまざまなコ ントロールをとることによって，検出された蛍光が同一 タンパク質内の分子内FRETによって得られるもので あり，GFP蛍光の漏れ込みやほかの分子上の糖鎖から くるFRETではないことを証明している（実験の詳細 は原著論文を参照されたい）（15）．
さらに，Boonsらによって開発された銅イオン非依存 的なアルキン誘導体（16, 17） を用いてアジド化シアル酸を 生細胞において蛍光標識し，ライブセルイメージングを 行 っ た．タ イ ム ラ プ ス 観 察 と，細 胞 表 層 に お け る
図3■FRETに よ る シ ア リ ル 化 GLUT4の可視化
GLUT4-GFPを発現させたHeLa細胞
（A, C）, またはコントロールのHeLa 細 胞 （B） を Ac4ManNAz 含 有 （B, C）, または非含有 （A） 培地で培養後，
蛍光プローブを反応させた．GLUT4- GFP：緑，SiaNAz-テトラメチルロー ダ ミ ン：赤，FRET：疑 似 カ ラ ー．
（文献15より転載．）
GLUT4の細胞内取り込みのキネティクス解析によって，
インスリン除去刺激による細胞表面GLUT4のエンドサ イトーシスの動態（GFPの蛍光）とシアル酸含有の GLUT4（FRETシグナル）について，取り込み速度が 異なる可能性があることを示唆するデータを得ることが できた（図4）．
脂質二重膜を挟んだFRETの検出
本研究結果の特筆すべき点は，脂質二重膜を介した FRETを検出している点である．すなわち，GFP（ド ナー）は細胞内側に，糖を標識した蛍光物質（アクセプ ター）は細胞外側にあり，その間には約3 nmの脂質二 重膜が存在する．そのため，特に生物学者にとっては脂 質二重膜を挟んだFRETシグナルの検出は感覚的に難 しいと信じられてきた．しかしながらわれわれはFRET が起こりうる距離が最大10 nmであることに着目し，事 実今回の研究成果から，脂質二重膜を越えて励起エネル ギーが移動できることが実証できた．今回特異的な FRETシグナルが検出できたのは，実はこのドナーとア クセプターの適度な距離も功を奏した可能性もあるので はないかと考えている．
おわりに
以上，標的タンパク質のグライコフォームの違いを可 視化する手法について解説した．われわれの提案した新 しいイメージング技術が，糖タンパク質の細胞内での動 きや役割を多角的に調べるツールとなれば，既存のノッ クアウト生物・細胞を用いた解析と相補的な役割を果た して糖鎖の機能解析に大きな貢献を果たすことが期待さ れる．今後，Split‒GFPのシステム（18） を用いたタンパ ク質複合体上の糖鎖の検出，あるいは光活性化 GFP
（photoactivatable GFP）（19） を用いた局所的なタンパク 質の動態追跡など，さまざまな応用が期待される．さら にアジド-アルキン系と共存しうるような新規のクリッ ク反応が確立できれば，dual FRETの手法（20〜22） によ り 同一糖タンパク質の異なるグライコフォーム や，
異なるタンパク質の同一のグライコフォーム などを 同時に可視化する技術の開発も期待できる．
一方，このFRETによる糖タンパク質検出法には今 後解決されるべき課題が存在することは事実である．そ の多くは現状のクリック反応による糖鎖のラベリングの 手法自身による．たとえば，アジド糖などの修飾糖がど のくらいの効率で複合糖質に取り込まれるのか，修飾糖 の取り込みによって複合糖質全体の糖鎖組成や糖鎖の伸 長に変化はないのかはまだ系統的に調べられていない．
メタボリックラベリング法であるがゆえに，すべての糖 が修飾糖に置き換わるわけではない点にも注意を払う必 要がある．さらに，修飾糖の取り込みとその蛍光標識が 細胞内の糖タンパク質の動態や性質に影響を及ぼしうる 可能性を十分に検証する必要がある．特にレクチン‒糖 タンパク質の相互作用など，糖鎖の認識を介した生体反 応ではこのような糖の修飾による二次的影響は慎重に検 討されるべきであろう．
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図4■シアリル化GLUT4のエンドサイトーシスのタイムラプ スイメージング
GLUT4（緑）およびシアル酸をもつGLUT4（赤）の，細胞内への取 り込みを観察した共焦点画像．GLUT4-GFPを発現させたHeLa細 胞のシアル酸を蛍光標識し，インスリン除去刺激応答のライブセ ルイメージングを行った．（文献15より転載．）
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プロフィル
芳賀 淑美（Yoshimi HAGA）
＜略歴＞2003年東京大学工学部化学生 命工学科卒業／2005年米国パシフィック ノースウエスト研究所訪問研究員／2008 年東京大学大学院工学系研究科化学生命工 学専攻博士課程修了．博士（工学）／2008 年理化学研究所特別研究員／2011年日本 学術振興会特別研究員PD＜研究テーマと 抱負＞生化学と有機化学を基盤として，糖 鎖の機能の一端を明らかにしたいと考えて います＜趣味＞長風呂しながら読書，子供 の離乳食作り，ヴァイオリン演奏（最近ご 無沙汰）
鈴 木 匡（Tadashi SUZUKI）
＜略歴＞1997年東京大学理学系研究科生 物化学専攻博士課程修了（博士（理学））／
1997 〜 2001年ニューヨーク州立大学ス トーニーブルック校ポストドクトラル フェロー，研究科学者，研究助教授（そ の間1997 〜 1998年日本学術振興会特別研 究員 （PD），1998 〜 2000年日本学術振興 会海外特別研究員）／2001年さきがけ研 究21研究員（日本科学技術振興機構）／
2002年東京大学理学部科学技術振興特任 教員（特任助手）／2004 〜 2007年大阪大 学医学部特任助教授，特任准教授／2007 年 よ り 現 職（理 化 学 研 究 所 チ ー ム リ ー ダー）／2010年埼玉大学大学院理工学研究 科客員教授（兼任）＜研究テーマと抱負＞
細胞質PNGaseの生理機能の解明と非リ ソソーム糖鎖代謝機構の全容解明を目指 したい＜趣味＞楽器演奏，野鳥観察，神 社仏閣巡り，街歩き，夏の山登り，お酒
（シャンパン，日本酒），などなど 写真提供：独立行政法人理化学研究所
