Title Journal , 121(3): 223-226 URL http://hdl.handle.net/10130/5592 Right Description

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Title 【研究成果報告】学長奨励研究助成成果報告

Journal 歯科学報, 121(3): 223‑226

URL http://hdl.handle.net/10130/5592 Right

Description

① ヒト末梢血血液細胞由来 iPS 細胞を用いた 骨再生療法の開発

口腔顎顔面外科学講座 加藤 宏

緒 言

iPS 細胞はその細胞特性から疾患メカニズムの解 明，再生医療の材料としての利用，創薬への応用な ど，その活用方法は多岐にわたる。近年では iPS 細 胞から様々な細胞への誘導が可能となっており，再 生治療への応用の期待は大きくなってきている^１）。

顎骨腫瘍・顎骨嚢胞・唇顎口蓋裂など，口腔外科 領域が対象とする疾患には先天的あるいは後天的に 骨欠損を生じることが多く，骨欠損が広範囲に及ぶ ものに対しては骨移植治療が必要になる。骨移植治 療においては，人工材料の利用など，これまでに 様々な手法が試みられているものの，いまだに自家 骨移植術が骨再生医療の第一選択とされている^２）。 自家骨移植は患者に与える侵襲が大きいため，幹細 胞技術を応用した骨再生治療が代替治療療法として 期待され，現在においても基礎的な研究が数多く行 われている^３）。

本研究は，低侵襲な骨再生療法の開発観点から，

ヒト末梢血血液細胞より iPS 細胞を樹立し，それら を骨芽細胞誘導して移植に用いるべく，その特性を 評価した。

材料および方法

１）ヒト末梢血血液細胞由来 iPS 細胞の樹立 採血は申請者が同意の得られた３２歳の健常者から 実施した。採取した末梢血は ficoll 法を用いて単核 球を分離した後，試薬を添加した血液培地を用いて T 細胞を選択的に取得した。得られた T 細胞には センダイウィルスベクターを用いて初期化因子（Klf

−４，Oct３／４，Sox２，c−Myc）を 導 入 し，iPS 細胞の樹立を行った^４）。

２）骨芽細胞分化誘導

骨芽細胞誘導方法は以前にわれわれが確立したヒ ト iPS 細胞を効率的に骨芽細胞誘導する方法に従っ

て行った^５）。誘導骨芽細胞は real time PCR 法にて 骨芽細胞マーカーの発現の評価を行った。

３）細胞移植

誘導骨芽細胞はラット頭蓋骨欠損モデルに移植し て骨形成能の評価を行った。骨欠損モデルは，ラッ ト頭蓋骨に矢状断を境界に形成した直径５mm 穴を 使用した^６）。足場材料はアテロコラーゲンスポンジ を使用し，細胞（２．０×１０^５／２０µL）を塡入して骨欠 損部に移植し，コントロールとしては，細胞を移植 しないアテロコラーゲンスポンジのみを移植する群 とした。移植後４週後にラット頭蓋骨を摘出し，マ イクロ CT による画像評価後，組織切片を作製し，

組織学的な評価を行った。

結 果

初期化遺伝子を導入後，線維芽細胞と同様に末梢 血血液細胞から iPS 細胞様のコロニーを確認するこ とができた。得られた iPS 細胞は ALP 染色に陽性 反応を示し，RT−PCR にて未分化マーカーである SOX２，OCT３／４，REX１，NANOG の 発 現 を 認 めた。また，テラトーマ形成において，内胚葉・中 胚葉・外胚葉の三胚葉分化を確認することができ た。

１４日間の骨芽細胞誘導後，骨芽細胞マーカーとし てタイプ１コラーゲン，組織非特異的アルカリホス フ ァ タ ー ゼ，RUNX２の mRNA 発 現 を real time PCR にて評価したところ，いずれも経時的に発現 の上昇を認めた。

細胞移植実験においては，細胞移植群が足場単味 群と比較して，骨欠損部に新生骨形成を認めた。新 生骨は骨欠損部周辺からだけでなく，中心部におい ても認めることができた。組織学的評価にて，移植 により形成された骨組織には層板構造が認められ，

成熟骨組織であることが示唆された。

考 察

近年の研究では，iPS 細胞はさまざまな体細胞か ら樹立が可能となっているだけでなく，多くの種類 の細胞を誘導することが可能である。今後も iPS 細 胞研究は再生医療を進歩させる可能性があり，その

研究成果報告

⑴学長奨励研究助成成果報告

歯科学報 Vol．１２１，No．３（２０２１） ２２３

期待は大きい^７）。これまでに末梢血血液細胞から iPS 細胞の樹立の報告はあるが，骨芽細胞誘導した報告 はない。本研究にて，末梢血血液細胞由来 iPS 細胞 から骨芽細胞誘導が可能であることが示唆された。

iPS 細胞は皮膚線維芽細胞から確立されることが多 いが，末梢血細胞の採取は皮膚線維芽細胞の採取よ りも簡便で侵襲性が低いという利点がある。また，

樹立までに要する期間も短く，低侵襲な骨再生治療 の細胞源として末梢血血液細胞由来 iPS 細胞の有用 性が示された。

② Treponema denticola の宿主免疫回避機 構 の解明

微生物学講座 国分栄仁

緒 言

Treponema denticolaは運動能を有するらせん状の 偏性嫌気性菌であり，慢性歯周炎病巣から高頻度で 検出され，歯周病原細菌のひとつとされている。T.

denticolaの示す歯周病原性としては，タンパク分解

酵素（dentilisin）によるサイトカイン分解作用や補 体活性化作用，major outer sheath protein（Msp）

による TLR-２刺激作用等による宿主の免疫機構を 攪乱が代表的なものである^１，２）。また，T. denticola の運動性は口腔内の上皮細胞や組織内への侵入に 関与し^３），病原性に深く関連すると考えられる。

運動性を有するSalmonellaやYersinia属は，マクロ ファージによる貪食と殺菌からの回避機構を持つこ とが報告されている。しかしながら，T. denticola の運動性や組織侵入メカニズム，免疫細胞からの回 避機構は未だに明らかにされていない部分が多い。

そこで今回の研究では，菌体表層の病原因子のT.

denticolaの運動性への関与に注目し，これら病原因

子の欠損株を用いて運動性の変化を解析した。

材料および方法

Treponema denticola ATCC ３５４０５，prtPおよび msp欠損株の３菌株を実験に用いた。各T. denticola は TYGVS 培地にて嫌気条件下にて３日間培養し たものを実験に用いた。運動性の解析は，寒天培地 上に菌懸濁液を滴下して１週間培養し，寒天内に広 がったコロニーの面積を測定した。また，培養した

T. denticolaを１％セルロースに混ぜて生菌のまま

暗視野顕微鏡にて６０FSP での映像を記録した。映 像は ImageJ および Imaris ソフトウェアを用いて 解析を行った。

文 献

１）Daisy A Robinton, George Q Daley : The promise of induced pluripotent stem cells in research and ther- apy. Nature，４８１（７３８１）：２９５−３０５，doi：１０．１０３８

／nature１０７６１，２０１２．

２）Saha A, Shah S, Waknis P, Bhujbal P, Aher S, Vaswani V : Comparison of minimally invasive ver- sus conventional open harvesting technique for iliac bone graft in secondary alveolar bone grafting in cleft palate patients : a systematic review. J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg，４５：２４１−２５３，２０１９．

doi：１０．５１２５／jkaoms．２０１９．４５．５．２４１

３）Melville JC, Mañón VA, Blackburn C, Young S : Cur- rent methods of maxillofacial tissue engineering.

Oral Maxillofac Surg Clin North Am，３１：５７９−５９１, ２０１９．doi：１０．１０１６／j.coms．２０１９．０７．００３

４）Ochiai­Shino H, Kato H, Sawada T, Onodera S, Saito A, Takato T, Shibahara T, Muramatsu T, Azuma T : A novel strategy for enrichment and isolation of os- teoprogenitor cells from induced pluripotent stem cells based on surface marker combination. PLoS One，９，e９９５３４，２０１４．doi：１０．１３７１／journal.pone．

００９９５３４

５）Nishimura K, Sano M, Ohtaka M, Furuta B, Ume- mura Y, Nakajima Y, Ikehara Y, Kobayashi T, Se- gawa H, Takayasu S, Sato H, Motomura K, Uchida E, Kanayasu­Toyoda T, Asashima M, Nakauchi H, Yamaguchi T, Nakanishi M : Development of defec- tive and persistent Sendai virus vector : a unique gene delivery/expression system ideal for cell re- programming. J Biol Chem，２８６：４７６０−４７７１，２０１１．

doi：１０．１０７４／jbc.M１１０．１８３７８０

６）Hayashi K, Ochiai­Shino H, Shiga T, Onodera S, Saito A, Shibahara T, Azuma T : Transplantation of human­induced pluripotent stem cells carried by self­assembling peptide nanofiber hydrogel im- proves bone regeneration in rat calvarial bone de- fects，２０１６．BDJ Open，２：１５００７．doi：１０．１０３８／

bdjopen．２０１５．７

７）Csobonyeiova M, Polak S, Zamborsky R, Danisovic L : iPS cell technologies and their prospect for bone regeneration and disease modeling : a mini review.

J Adv Res，８：３２１−３２７，２０１７．doi：１０．１０１６／j.jare．

２０１７．０２．００４ 東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ ２２４

結 果

寒天内に形成したコロニーの面積は野性株が約 ０．７５cm^２であるのに対し，欠損株はともに０．５cm^２ 程度であった。T. denticolaの動きをトレースした 結果，直線や曲線的な動き，あるいは前後にスイッ チングする像を認め（図左下），移動の際に菌体表 層の一部を基質に固定しながら移動する像を観察し た。また，個々の細菌の速さは一定ではなく，速度 が変化したり，途中で停止したのち再度動き出す像 も認めた。個々の細菌の軌跡から平均移動距離を算 定した結果，野性株では菌体が１回転すると約０．２５ µm 移動し，１分間当たりの移動距離は野性株およ びmsp欠損株はそれぞれ約１６µm/min，１５µm/min で あ る の に 対 し，prtP欠 損 株 で は４µm/min で あった。次に，T. denticolaの動きに関して暗視野 顕微鏡で観察をすると，菌体の一部は光の反射が異 なっており，その部分は菌体の移動に変化しないこ とを認めた（図右上）。時間の変化を色分けしてト レースすると，移動の軌跡は波状を呈していた（図 右下）。

考 察

本菌の遺伝子欠損株は寒天ゲル内での移動，お よび基質上での移動が低下したことから，表層タン パクが運動性に影響することを認めた。両遺伝子欠 損株では運動性が低下していたが，液体中での回転

速度に関しては差を認めなかったため，dentilisin も Msp もT. denticolaの回転運動に影響を与えない と考えられた。しかしながら欠損株の移動距離は減 少していることから，菌体と基質との相互作用に影 響していると考えられた。また，本菌の移動には液 体の粘度や温度に強く影響することが報告されてお り^４），その基質と菌体表層タンパクの相互作用が菌 株の運動性の違いに影響していることが示唆され た。Msp と dentilisin は菌体表面に存在しており，

Msp はフィブロネクチン接着性がある^１）。Dentilisin の不活化は Msp の発現に影響する^５）ことから，口腔 環境でも同様に歯肉溝内や粘膜上 皮 で の 移 動 に dentilisin と Msp が関わることが示唆され，これら の病原遺伝子の歯周組織上での運動に与える特性を さらに解析する必要がある。

文 献

１）Fenno JC, Muller KH, McBride BC : Sequence analy- sis, expression, and binding activity of recombinant major outer sheath protein（Msp）of Treponema den- ticola, Journal of Bacteriology，１７８：２４８９−２４９７，

１９９６．

２）Ishihara K, Miura T, Kuramitsu HK, Okuda K : Characterization of the Treponema denticola prtP gene encoding a prolyl-phenylalanine-specific pro- tease（dentilisin）．Infect Immun，６４：５１７８−５１８６，

１９９６．

左上：暗視野顕微鏡で撮影したT. denticola各細菌に異なる色付けを行っ た。左下：色付けした菌体の動きを５分間トレースし１画像上に表示し た。右上：T. denticolaを１０秒間コマ送りで表示。同右上：kymograph に よる１０秒間の連続描写。右下：菌体の移動と時間変化を色により示した写 真。

歯科学報 Vol．１２１，No．３（２０２１） ２２５

３）Ellen RP, Galimanas VB : Spirochetes at the fore- front of periodontal infections. Periodontology ２０００：３８（２００５）１３−３２．

４）Ruby JD, Charon NW : Effect of temperature and viscosity on the motility of the spirochete Tre- ponema denticola. FEMS Microbiology Letters，

１６９：２５１−２５４，１９９８．

５）Bian XL, Wang HT, Ning Y, Lee SY, Fenno, JC : Mutagenesis of a novel gene in the prcA-prtP pro- tease locus affects expression of Treponema denti- cola membrane complexes, Infect, Immun，７３：１２５２

−１２５５，２００５．

東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ ２２６