Transformasi embrio kelapa sawit menggunakan Agrobacterium tumefaciens

PUMS99:1 UNIVERSITI MALAYSIA SABAH

'. BORANG PENGESAHAN STATUS TESIS@

JUDUL:_~...; ~ ,--- l7, -,-, {o ...; { vW{ ~ S _ i"l· -.;; ~ ~ hrJ ",-I ;... \J--,--, k-e.k ~ f ..;..:.. a _ ~ -=-- W7 _ --r ,----, ~ _~ ...

^{Y1Ct::..:.l[ c q y ,;....}

~ -

" , , - - _

4iro~VW\ - fuMP/:rJM6

Ij

aZah:_ ~_ O(d-j~ _ LVl _ Ct_ ~ _ du

^{_ _}

^{5ai _ '_ nS __ ( _ /;1 _ -} * _ l:4t1 _ ol--\'~I-) _ _ _ _ _ _

SF.$I PENGAJIAN:

'7-002

Saya

NoR. SttI<.ASH1MA1"uN SAP/AN

j

(HURUF BESAR)

mcnga~""U membeoulcan tcsis (LPSlSarjanaJDolctor Falsafah)· ini·disimpu di PerpustaL:aan Unive..rsiti

I

Malaysia Sabah deng'tm syarat-syarat keguna.a.n seperti beril.-ut

It.

^Tesis adalab baL:.m.ilik

Ucivecsi~

^{MalaysiA Sabah_}

2. ~erpustakaan Universiti Malaysia Sabah dibenarhn membuat salinan untuk tujUaD pengajian sahaja.

3. Perpustakaan dibcnarbn membuat salin.1n tesis ini scbagai bahan pcrtukann antara institusi peogajian tinggi.

4. "Sila tandakan ( / )

D D

[Z]

SULrr

TERI-IAD

(TAND AN PENUUS) Ala.nut Tctap: 0 (,1 J/y"t

r/

^SPr

~t1'11&V1 fgt-. ~"sf,m 7-

l13bSO 1?J+r-r3Cdu gq-t:~:" ⁱ ~o( •

Tan kh:

3-0

(\\ctt- '"}tJ.J ~ ^..,.

•

CA TA TAN·: • Potong yang tidak bcrkcnaan .

(Meogmdungi maldumat yang berdujah kesclamatan atau kepcnti!lgan Mal.aysia seperti yang termaktub di dalam

AK.TA:·RAHSlA RASMll972)

(Mengandungi maldumat TERHAD yang tclah ditentuhn olc:h organisasilbadao di maoa penyelidikan dijalankan)

Disahkan oleh

(TA~1)ATANGAN PUSTAKAWAN)

Nama PenyC\ia

Tarikh: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

•• Iik:! tcsis ioi SULIT atau TERHAD. sila lampirbn sura! daripada pihal: bc:rkua.<:aIorganisasi herlcenU1' deogan menya!llkan sekaJi scbab dan tempo" I~is ini palu dikdaskan scbagai SULIT d/lll TERHAD.

@ Tesis dimaksudkan 5ebagl.i tcsis bagi Iju...ah Doktor Falscah dan Sarjana scc:ara pc:nyelidikan, ~!3U

discrtasi bagi pcncajian sccara kerja Itursus dan penyclidikan, .tau Laporan Projck Sarjana Muda (LPSM).

TRANSFORMASI EMBRIO KELAP A SA WIT MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens

NOR SARASHIMA TUN SAPIAN HS 2002 3087

TESIS INI DIKEMUKAKAN UNTUK MEMENUHI

SEBAHAGIANDARIPADA SYARATMEMPEROLEHIDAZAH SARJANA MUDA SAINS DENGAN KEPUnAN

PROGRAM BIOTEKNOLOGI SEKOLAH SAlNS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITI MALAYSIA SABAH

MAC 2005

111

PENGAKUAN

Saya akui bahawa karya ini adalah hasil kerja saya sendiri kecuali nukilan dan ringkasan yang setiap satunya telah saya jelaskan sumbemya.

29 Mac 2005

(NOR SARASHIMATUN SAPIAN) HS 2002 - 3087

IV

PERAKUAN PEMERIKSA DIPERAKUKAN OLEH

Tandatangan 1. PENYELIA

(DR. ZALEHA ABD. AZIZ)

2. PEMERIKSA 1

(pROF. DR. HO COY CHOKE)

3. PEMERIKSA 2

(DR. ROZIAH HJ. KAMBOL)

4. DEKAN

(PROF. MADYA DR. AMRAN AHMED)

v

PENGHARGAAN

Dengan Nama Allah yang Maha Pemurah lagi Maha Pengasih,

Syukur kepada Dahi atas kasih dan kurniaanNya, yang telah memberkati saya sepanJang tempoh menyiapkan disertasi ini, walaupun pelbagai rintangan yang dibadapi.

Setinggi-tinggi penghargaan ditujukan kepada Dr. Zaleha Abd Aziz selaku penyelia di atas bimbingan dan tunjuk ajar yang diberikan dalam menyiapkan disertasi ini. Ucapan terima kasih juga kepada pemeriksa, pensyarah UMS, kakitangan UMS, dan pelajar pascasiswazah yang banyak membantu dan memberikan tunjuk ajar secara langsung mahupun tidak langsung. Tidak lupa kepada saudari Roseline Baun Ajang, serta rakan-rakan seperjuangan saya yang bersama- sarna melakukan disertasi ini.

Ribuan terima kasih yang tidak terhingga juga di tujukan kepada ayah, Sapian Hj.

Ismail, ibu, Rahimah Mohd. Amin, serta Mohd Shafiq dan Mohd. Shaifullah tersayang yang tidak j emu-j emu memberikan galakan., dorongan serta doa restu yang diberikan. Juga kepada Hasmin Azroy Abdullah yang sentiasa memberikan pertolongan dan dorongan tidak kira di mana jua berada. Terima kasih atas segala- galanya, dan semoga Allah memberkati kita semua. Amin.

VI

ABSTRAK

Kajian ini melibatkan transformasi embrio kelapa sawit menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain ERA pBI 121. Strain EHA 105 ini membawa plasmid yang mengkodkan gen NPTII dan gusA. Embrio kelapa sawit (Elaeis tenera) dikulturkan dalam media MS (Murashige & Skooge). Terdapat lima tempoh pra-kultur herlainan yang diuji iaitu pada minggu sifar, minggu pertama, minggu ke-2, minggu ke-3 dan minggu ke-4. Dalam setiap tempoh pra-kultur yang diuji ini , terdapat pula tiga jenis rawatan iaitu (i) eksplan dilukakan dan diinokulasi dengan Agrobacterium bersama 200 ~M aeetosyringone, (ii) eksplan dilukakan dan diinokulasi dengan Agrobactetium tanpa acetosyringone dan (iii)kawalan di mana eksplan dilukakan, dan direndamkan dengan air suling autoklaf sahaja. Selepas diinokulasi, eksplan akan dikulturkan dalam media ko-kultivasi selama 5 hari kemudian disubkulturkan pula dalam media pemilihan. Selepas 5 bari di atas medium pemiliban, sebabagian eksplan diuji dengan ujian bistokimia GUS. Daripada kajian ini, didapati bahawa tempoh pra- kultur terbaik untuk transformasi embrio kelapa sawit menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain ERA 105 adalah pada minggu ke-3, dan kesan kebadiran acetosyringone terhadap pengespresan warna him X-glue dalam ujian bistokimia GUS adalah rendah.

V11

ABSTRACT

This research involves the use of Agrobacterium tumefaciens strain ERA 105 pBI 121 for transformation of oil palm. This strain carries a plasmid pBI 121 encoded genes NPTlJ and gusA. Embryos of oil palm (Elaeis tenera) were cultured in MS (Murashige & Skooge) medium. There are five type of pre-culture period that had been research such as week-O, week-I, week-2, week-3 and week-4. In this each pre- culture period, there are three type of treatment such as (i) inoculation of wounded explants in Agrobacterium with 200 JlM acetosyringone, (ii) inoculation of wounded explants in Agrobacterium without acetosyringone, and (iii)control whereas inoculation of wounded explants in double distilled water only. After inoculation, explants will be cultured in co-cultivation medium. in 5 days then, sub-cultured it to the selection medium. After 5 days explants in selection medium, several of them are tested with Histochemical GUS Test. According to this research, the best pre-culture period for transformation of oil palm using Agrobacterium tumefaciens strain ERA 105 is in week-3, and the effectiveness of acetosyringone to the expression rate of X- gluc blue spot in explants is low.

PENGAKUAN

PERAKUAN PEMERIKSA PENGHARGAAN

ABSTRAK ABSTRACT

SENARAI KANDUNGAN SENARAI FOTO

SENARAI JADUAL SENARAl LAMPIRAN SENARAI RAJAH SENARAI SIMBOL SENARAI UNIT

BABIPENDAHULUAN

1.1 Pengenalan ].2 Objektifkajian

KANDUNGAN

BAB 2

ULASAN PERPUSTAKAAN

2.1 Elaeis guineensis

2.1.1 Perkembangan sumber genetik kelapa sawit 2.2.2 Kepentingan dan sumbangan kelapa sawit

dalam ekonomi

2.2 Transformasi menggunakan perantaraan Agrobacteruim tumefaciens

2.2.1 Gen penanda pilihan 2.2.2 Gen pelapor

2.2.3 Mekanisma pemindahan T -DNA

Mukasurat

111

IV V VI

Vll VlU

x

Xl

XlI

Xlll

XIV xv

1 1 2

3 3 3

6

8 10 11 12

Vlll

BAB 3 BAHAN DAN KAEDAH 3.1 Penyediaan larutan stok

3.2 Penyediaan medium pengkulturan 3.3 Pengkulturan embrio kelapa sawit

3.3.1 Pensterilan permukaan biji kelapa sawit

3.3.2 Pengkulturan embrio kelapa sawit dalam medium pra-kultur

3.4 PengkulturanA. tumefaciens ERA lOS pBI 121 3.S Inokulasi embrio kelapa sawit dengan A tumefaciens

ERA 105 pBI 121 3.6 Ujian histokirnia GUS

BAB 4 KEPUTUSAN

4.1 Pengkulturan embrio kelapa sawit 4.2 Koloni tunggal strain ERA lOS pBI 121 4.3 Tempob pra-kultur embrio kelapa sawit

BAB 5 PERBINCANGAN

5.1 Pengkulturan embrio kelapa sawit

5.2 Transformasi kultur embrio kelapa sawit menggunakan A. tumefaciens

BAB 6 KESIMPULAN

RUJUKAN LAMPIRAN

15 15 16 18 18

18 19

20 22

24 24 25 25

29

29

31

36

38 42

IX

No Foto

4.0 4.1

SENARAI FOTO

Kultur embriogenik kelapa sawit

Kesan transfonnasi Agrobacterium tumefaciens ERA 105 terhadap tempoh pra~kultur embrio kelapa sawit dalam rawatan yang berbeza.

x

Halaman 24

28

Xl

SENARAI JADUAL

No.jadual Halaman

3.0 Penyediaan medium MS sebanyak 1 liter 17

3.1 Medium pengkulturan embrio kelapa sawit 18

3.2 Tempoh bagi pra-kultur embrio kelapa sawit 19

3.3 Komposisi medium LB 19

3.4 Rawatan terhadap transformasi embrio kelapa sawit Menggunakan A. tumefaciens ERA 105 pBI 121 21 4.0 Bilangan eksplan yang mengandungi warna biru

X-glue setelah melakukan ujian histokimia GUS 26 4.1 Bilangan eksplan yang berjaya hidup di daJam

Medium Pemilihan 26

4.2 Kualiti wama bim X-glue mengikut tempoh

pra-kultur dalam rawatan yang berbeza berdasarkan

indeks (Gambarajab 3.0) 27

Lampiran

A

B C

SENARAI LAMPIRAN

Senarai peralatan asas yang digunakan dalam kajian yang dijalaokan

Resepi media MS

Ringkasan proses transfonnasi menggunakan Agrobacterium

Halaman

42 43

44

XlI

No. rajah

2.0

2.1

2.3

SENARAI RAJAH

Kacukan Dura dan Pisifera menghasilkan hibrid barn iaitu Tenera

Segrnen T-DNA di dalam plasmid Pbi 121 vektor binari

Mekanisrna pemindahan T-DNA ke dalam genom sel tumbuhan

xiii

Halaman

5

11

14

ASG DMF LB Kan

MS npt II I-DNA I i

Vir X-Gluc X-Gal

~03

KN03 CaCb.2H20 MgS04.7H20 KH2P04 CoCh.6H20 MnS04.7H20 ZnS04. 7H20 H3B03 KI

CuS04.5H20 NaFeEDIA HCON(CH3)2

SENARAI SIMBOL

acetosyringone dirnethylformarnide Luria-Bertani kanamycin

Murashige & Skoog

neomysin phosphotransferase II transfer DNA

tumor-inducing virulent

5-bromo-4-chlo-3-indolyl-p-glucuronide 5-bromo-4-chlo-3-indolyl-p-galactosidase ammonium nitrate

kalium / potassium nitrate calcium chloride dihydrate magnesium sulphate hepthahyd kalium dihydrogen phosphate cobalt chloride

manganase sulphate hextahyd zinc sulphate heptahydrate boric acid

kalium iodide cupric sulphate

monosodium ferric ethylenediaminetetraacetic acid dimethylfortnamide

XlV

xv

SENARAI UNIT

L Liter

~g mikrogram

ml mililiter

~l mikroliter

mg miligram

mm milimeter

cm sentimeter

g gram

° c

darjab celsius

M molar

mM milimolar

BAB1

PENDAHULUAN

1.1 Pengenalan

Seiring dengan perkembangan pesat dalam industri, pokok kelapa sawit telah menjadi fokus utama penyelidikan saintifik. Begitu juga dengan program pembaikbiakan yang telah giat dijalankan dengan meluas. Pembiakan mikro atau kultur tisu kelapa sawit merupakan antara yang sukar dilakukan jika dibandingkan dengan spesies monokot yang lain.

Jika dibandingkan dengan pembiakbakaan secara konvensional, tumbuhan transgenik dapat meningkatkan kualiti hasil tanaman yang lebih baik. Matlamat utama yang ingin dicapai di dalam program penghasilan transgenik kelapa sawit ialah;

peningkatan pengeluaran hasil minyak; pengurangan ketinggian batang pokok;

penghasilan minyak adalah untuk tujuan makanan dan kegunaan industri tertentu; dan pembentukan kerintangan terhadap penyakit.

2

1.2 Objektif kajian

Objektif utama projek ini adalah untuk mengkaji kesan tempoh pra-kultur embrio kelapa sawit terhadap frekuensi transformasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Kajian juga dilakukan untuk mendapatkan sel transgenik yang berupaya tumbuh dalam media yang mengandungi antibiotik Kanamycin dan dapat mengespresikan gen GUS apabila

ujian histokimia GUS dijalankan terhadapnya.

BAB2

ULASANPERPUSTAKAAN

2.1 Elaeis guineensis

Kelapa sawit (Elaeis guineensis) tergolong di dalam Famili Polmae yang memiliki 198 genera dan 2650 spesies. E. guineensis berasaJ dari Afrika Barat, yang dijumpai di kawasan lembap, tetapi kini E. guineensis ditanam dengan meluas di kawasan penanaman khas lain seperti di Afrika Tengah, Amerika Selatan dan Asia Tenggara. Kelapa sawit menjadi tanaman komersial perladangan terbesar bagi kepentingan ekonomi sesebuah negara (George, 1993).

2.1.1 Perkembangan sumber genetik kelapa sawit

Usaha untuk memperbaiki tanaman kelapa sawit di Malaysia bermula pada tahun 1922.

Kebanyakan penyelidikan yang dijaJankan pada masa itu adaJah oleh Jabatan Pertanian.

Pihak swasta hanya mula mengambil bahagian beberapa tabun kemudiannya.

Kebanyakan usaha pada masa itu tertumpu kearah memperbaiki pokok Duro yang

4

mempunyai tempurung yang tebal. Pemilihan yang dijalankan adalah untuk menambahkan berat tandan. (Rajanaidu et. al., 1993)

Pada tahun 1941, Beirnaert dan Vanderweven telah mendapati bahawa ketebalan tempurung mempengaruhi pengeluaran hasil minyak buah kelapa sawit. Mereka juga mendapati bahawa ketebalan tempurung dikawal oleh satu gen major. Kelapa sawit jenis Dura dikawal oleh gen tempurung tebal yang homozigus, manakala Pisifera adalah homozigus untuk gen yang mengawal sifat tanpa tempurung. Apabila pokok Dura dikacukkan dengan pokok Pisifera, pokok hibrid yang terbentuk dikenali sebagai DxP (Tenera) yang mempunyai tempurung yang sederhana tebal dan mengeluarkan hasil minyak 20 - 25% lebih tinggi dari hasil minyak pokok Dura. Pokok jenis Pisifera, sebenamya, adalah betina mandul atau hampir mandul dan seterusnya mempunyai hasil yang sangat rendah. (Rajanaidu et. at., 1993). Hasil kacukan ini ditunjukkan dalam Rajah 2.0 di muka surat sebelah.

l\If'sokal) (20-0:-()0)

Lm'ong - - f -__ ~ ("-2~0(o)

TflrqnU1lllg ---T-~~

(20-~00o)

D1U'~l (Sh"- Sh+)

HOlnozlgns (DomOUlIt)

l\Ifsol':~ll)

(00-960 0)

X I

Istrong _--1'---:-1- (13-1~Uo)

TtIDlnu'11llg - - - ; - - (3-200 0)

Ttnt-nl (Sb-' Sho) HilJlill (Htttl"ozlgllS)

l\ltsok~.p

(9.2-9"'0 0)

-+--t-. I~l1'ong (3-80 0)

Pisiftl ... iSh' Sh-) HOlDoztgnS (RtSff.1f)

5

Rajab 2.0: Kacukan Dura dan Pisifera menghasilkan hibrid barn iaitu Tenera (Rajanaidu et al., 1993).

Pokok kelapa sawit merupakan tumbuhan saka, dan seJems tanaman monokotiledon. Maka secara amnya, kelapa sawit hanya dapat dibiakkan dengan menggunakan biji. Tinggi pokok, 8.3 - 20 m dan berbatang besar. Pokok adalah monosius di mana bunga jantan dan betina terletak pada gugusan yang berlainan tetapi di dalam satu pokok. Panjang petiol 1.3 - 2.3 m, lebar 12.5 - 20 em. Panjang pi nat 3.3 - 5

6

meter dengan 100 - 150 pasang dedaun, di mana panjang dedaun 60 -120 em, 3.5 - 5 em lebar setiap satu.

Hasil tuaian pertama diperolehi selepas 3 - 4 tahun ditanam di atas tanah, tetapi berkemungkinan menghasilkan buah yang keeil dan kurang berkualiti. Biasanya ini dielakkan dengan membuang gugusan betina muda. Gugusan yang masak adalah setelah 5 - 6 bulan mengalami pendebungaan. Gugusan buah perlu dituai mengikut darjah kematangan yang tepat, di mana sekiranya tidak meneapai tahap kematangan, buah hanya mengandungi sedikit kandungan minyak dan sekiranya dituai apabila sudah terlalu matang, buah akan mengandungi asid lemak yang tinggi. Penuaian biasanya dilakukan sekali dalam setiap minggu.

2.1.2 Kepentingan dan sumbangan keJapa sawit dalam ekonomi

Dengan kehadiran karotin yang tinggi, minyak kelapa sawit boleh digunakan sebagai pengganti minyak hati ikan kod yang kaya dengan vitamin A. Di dalam setiap 100 g, buah kelapa sawit mengandungi;

Komponen Kuantiti (g)

Air 26.2

Protein 1.9

Lemak 58.4

Karbohidrat 12.5

Fiber 3.2

Abu 1.0

7

Minyaknya mengandWlgi 878 kalori, 0.5% air, 99.1% lemak, 0.4 g karbohidrat, 7 mg kalsium, 8 mg potassium, 5.5 mg ferum, 27,280 ug B-karotin, 0.03 mg riboflavin, dan sedikit thiamine di dalam setiap 100 g. Komposisi lemak di da1am minyak adalah 0.5- 5.9% miristik, 32.3-47.0 % palmitik, 1.0-8.5 % stearik, 39.8-52.4 % oleik, dan 2.0-11.3 % linoleik.

Terdapat dua jenis minyak yang boleh di dapati daripada kelapa sawit iaitu minyak mesokap kelapa sawit dan minyak isirong kelapa sawit. Minyak mesokap kelapa sawit di dapati terus daripada sabutnya di mana ia mengandungi 45 - 55% minyak yang bervariasi warna dari kuning cair hingga jingga, dan pencairannya pada suhu 25°C hingga 50°C. Minyak dari mesokap kelapa sawit mengandungi asid palmitik tepu, asid oleik dan asid linoleik, memberikan nilai asid tak tepu yang tinggi berbanding dengan minyak isirong kelapa sawit dan minyak kelapa biasa. Minyak mesokap kelapa sawit digunakan dalam pembuatan sahun, dan lilin, dan terkini, pembuatan margerin dan minyak masak.

Minyak isirong kelapa sawit diekstrak daripada endosperma isirong, dan mengandungi lebih kurang 50% komposisi minyak. Serupa dengan minyak kelapa biasa, yang mengandungi kandungan asid tepu yang tinggi iaitu asid laurik, sifat fizikalnya adalab pejal pada suhu yang normal. Minyak isirong kelapa sawit digunakan di dalam pembuatan aiskrim dan mayonis, penghasilkan sabun mandi dan bahan pencuci.

Merujuk kepada Hartwell (1967-1971), minyak kelapa sawit digunakan untuk menyahaktifkan tumor. Dilaporkan ia dapat melegakan kesakitan (anodyne), penawar bagi kesan racun (antidotal), membangkitkan keinginan seks (aphrodisiac), dan diuretik:.

8

Kelapa sawit secara amnya adalah penawar bagi kanser, sakit kepala dan penyakit reumatik (Duke et a/., 1981).

2.2 Traosformasi menggunakan perantaraan Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumeraciens adalah bakteria tanah yang menjangkiti kawasan yang terluka pada tumbuhan lalu menyebabkan pembentukan tumor. Bukti pertama yang menunjukkan bakteria ini adalah agen causative terhadap crown gall telah dilihat lebih sembilan puluh tahun dahulu (Smith et al., 1907).

Bakteria ini memiliki plasmid Ti (Ti-plasmid) yang mengkod gen-gen vi.ru1en (Vir) dan DNA pemindah (T -DNA). Fungsi gen-gen virulen adalah bertindak di dalam pemprosesan dan pemindaban T -DNA dari plasmid Ti ke dalam sel tumbuhan terpilih dan kemudiannya berintegerasi ke dalam hos genom. Bakteria ini mempunyai keupayaan untuk mengalami pertumbuhan dalam kultur yang tidak mengandungi hormon pertumbuhan seperti auksin dan sitokinin (Hughes, 1996).

Berbanding dengan transformasi menggunakan senapang biolistik, rekaan senapang biolistik menggunakan tungsten pelindung-DNA atau kepingan emas yang akan ditembak menembusi k1oroplas ataupun tisu sasaran. Teknik ini tidak memerlukan mekanisma biologi untuk memindahkan plasmid menembusi dinding sel tumbuhan, tetapi senapang biolistik tidak mudah didapati dan peralatannya sangat mahal, serta keberkesanannya terhadap transformasi adalah rendah.

9

Elektroforasi, media membran elektrik, juga dikenali sebagai teknik yang boleh digunakan untuk tranformasi genetik asing menembusi dinding sel tumbuhan. Teknik:

elektroforasi memiliki kelemahan berbanding transformasi A. tumefaciens kerana elektroforasi melibatkan perubahan terhadap membran sitoplasmik sel tumbuhan di mana rawatan menggunakan arus elektrik diperlukan untuk mernudahkan perpindaban DNA.

Transformasi menggunakan A. tumefaciens mernberikan kelebihan di mana ia adalab teknik sistem transformasi secara semulajadi serta keberkesanannya terhadap transformasi adalah tinggi. Prosedumya adalah mudah, kaedahnya lebih efisyen dan tidak memerlukan kos yang tinggi untuk rnengendalikannya.

Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi keberkesanan transformasi iaitu:

(1 )faktor jenis eksplan - biji kelapa sawit yang pra-matang dalam lingkungan 4-5 bulan digunakan kerana embrio pra-matang menunjukkan kadar pertumbuhan yang tinggi kerana kesan mekanisma penyesuaian terhadap persekitaran rnengambil masa yang singkat. Biji kelapa sawit dipilih sebagai eksplan kerana biji terhasil di dalam kuantiti yang banyak, maka pertumbuhan daripada biji tidak melibatkan kos yang tinggi. Biji juga boleh disimpan dalam tempoh masa yang panjang tanpa kehilangan kebolehan untuk hidup. Embrio di dalam biji sulcar dijangkiti oleh perosak dan penyakit kerana ia dilindungi (George, 1993), (2)faktor tempoh masa pra-kultur - parameter bagi pra-kultur eksplan adalah dalam tempoh minggu sifat, minggu pertama, minggu kedua, minggu ketiga dan minggu keempat pembentukan kalus oleh embrio ke1apa sawit sebelum

38

RUJUKAN

A Dictionary of Science, 1999. Oxford, New York.

Duke, lA and Wain, KK, 1981. Medicinal plants of the world. Computer index with more than 85,000 entries. 3 vols.

George, E.F., 1993. Plant propagation by Tissue Culture Part I and II.

Exegeties Limited, England.

Gustavo, AR, Joel, G.C., Roberto, V.P., Camilo, A.P., 1998. Agrobacterium

tumefaciens: a natural tool for plant transformation. Electronic Journal of Biotechnology. Vol I (3), Issue of December 15

Hartwell, lL., 1971. Plants used against cancer, A survey. Lloydia 30-34.

Hartwell, L.H., Hood, L., Goldberg, M.G., Reynolds, AE., Silver, L.M., Veres, R.c., 2000. Genetics From Genes to Genome. Me Graw Hill, United State.

Hinchee, M.AW., Corbin, D.R, Armstrong, C.L., Fry, lE., Sato, S.S., DeBoer, D.L., Petersen, W.L., Armstrong, T.A, Connor, D.V., Layton, J.G., and Horch, RB.,

39

1994. Plant transformation. DIm. Vasil, I.K, and Thorpe, A.T., (pnyt.). Plant cell and tissue culture: 231-270. Netherland: Kluwer Academic Publisher.

Hughes, M.A., 1996. Plant Molecular Genetics. United Kingdom. Addison Wesley Logman.

Hunault G., 1985. Organic acids, pH, ammonium and nitrate interactions on the growth of Asparagus tissue cultivated in vitro. Ann. Sci. Nat., Bot. 13, 63~ 75.

Jefferson, RA., Kavanagh, T.A., Bevan, M.W., 1987. GUS fusions: (3-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marke in higher plants. EMBO Vol 6, 3901-3907.

Kosugi, S., Ohashi, Y, Nakajiwa, K, Arai, Y, 1990. An improved assay for

fJ-

glucuronidase in transformed cells: methanol almost completely suppresses a putative endogenous fJ-glucuronidase activity. Plant Science 70: 133-140.

Lee KH., 2005. Thesis: Transformasi Embrio Kelapa Sawit Menggunakan Agrobacterium tumefaciens (strain AGL1 pCAMBIA 1303).

40

Lerch K., 1981. Copper monooxygenases: tyrosine and dopamine p-monooxygenase.

pp. 143-186 in Sigel H. (ed.) 1981 Metal ions in Biological Systems 13 Marcel Dekker Inc. New York, Bassel.

Manoharan, M., Sree Vidya C.S., and Lakshmi S.G., 1998. Agrobacterium- mediated genetic transformation in hot chilli (Capsicum annuum L. var. Pusa jwala). Plant Science 131, 77-83.

Paranjothy and Rao, V, 1984. An introduction to the oil palm. PORlM Bulletin 18: 9- 17.

Rajanaidu, N., lalani, B. S., Cheah, S.C., dan Ahmad Kushairi. D., 1993. Oil palm breeding: Current issues and future development. PORlM international Oil Palm congress. September 1993, Kuala Lumpur.

Sangwan, R. S., Ducroq, C., Sangwan-norreel, B. S., 1991. Effect of cultures condition on Agrobacterium-mediated transformation of Datura. Plant Cell Report 10: 90- 93.

Schott, M., 1995. Selectable marker and reporter gene. DIm. Potrykus, 1. and Spangenberg, G. (pnyt.). Gene transfer to plants. German: Springer-verlag City.

41

Seidman, L.A., and Moore, C.l, 2000. Basic Laboratory Methods for Biotechnology.

Upper Saddle River, New Jersey.

Shain-dow Kung and Ray Wu, 1993. Transgenic Plant Engineering and Utilization Volume I and II. Academy Press, California.

Smith, E.F. and Townsend, e.O., 1907. A plant tumor of bacterial origin. Science (25),671-673.

Stachel, S.B., Mersen, E., Van Montagu, M., and Zambryski, P., 1985. Identification of the signal molecules produced by wounded plants cells that activate T -DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature 318: 624-629.

Yamashita, T., Lida, A., and Morikawa, H., 1991. Evidence that more than 90% of ~­

galactosidase - expressing cells after particle bombardment directly receive the foreign gene in their nucleus. Plant Physology 97: 829-83].

Zakri, A.H., 1993. Sumber Genetik Tumbuhan. Kuala Lumpur: Dewan Bahasa dan Pustaka.