3 EKSTRAKSI DAN BIOAKTIVITAS Brucea javanica, Tephrosia vogelii, DAN Piper aduncum
3.2 Bahan dan Metode 1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Toksikologi Serangga, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB), pada bulan Maret 2011 sampai Februari 2013.
3.2.2 Tumbuhan Sumber Ekstrak
Bahan tumbuhan yang digunakan adalah buah Brucea javanica diperoleh dari pinggiran pantai daerah Padang Pariaman-Sumatera Barat, daun Tephrosia vogelii berbunga ungu yang berasal dari Kawasan Agropolitan, Kecamatan Pacet, Kabupaten Cianjur-Jawa Barat, dan Piper aduncum diperoleh dari areal kampus Institut Pertanian Bogor (IPB) Darmaga.
3.2.3 Ekstraksi
Ekstraksi B. javanica, P. aduncum, dan T. vogelii dilakukan dengan metode perendaman/maserasi menggunakan pelarut etil asetat:metanol (9:1) untuk B. javanica dan pelarut etil asetat untuk P. aduncum dan T. vogelii. Pemilihan pelarut berdasarkan penelitian sebelumnya dan studi literatur. Lina et al. (2010) melakukan ekstraksi bertingkat pada B. javanica dilanjutkan dengan pengujian terhadap C. pavonana. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa ekstrak heksana tidak aktif terhadap serangga uji, ekstrak etil asetat mematikan 100% serangga uji, sedangkan ekstrak metanol mematikan 31.11% serangga uji. Kombinasi pelarut etil asetat : metanol (9:1) memberikan hasil ekstrak maksimal dan aktivitas yang baik terhadap serangga uji C. pavonana. Ekstraksi T. vogelii dan P. aduncum menggunakan pelarut etil asetat, mengacu pada penelitian ekstrak kasar yang dilakukan oleh Abizar dan Prijono (2010); Nailufar (2011); Lago et al. (2009);dan Flores et al.(2009).
Masing-masing bahan tumbuhan sumber ekstrak dipotong-potong (± 3 cm) kemudian diletakkan di atas nampan bambu yang dialasi kertas koran dan dibiarkan kering udara tanpa terkena cahaya matahari langsung. Setelah kering bagian-bagian tanaman tersebut masing-masing digiling dengan menggunakan blender. Bahan tumbuhan yang sudah diblender, kemudian diayak menggunakan pengayak bermata 0.5 mm hingga diperoleh serbuk. Pada tahap pertama, 50 g serbuk masing-masing bagian tanaman dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dan direndam dalam pelarut yang sesuai berdasarkan penelitian sebelumnya. T. vogelii direndam dalam 500 mL etil asetat (Nailufar 2011), untuk P. aduncum juga direndam menggunakan etil asetat (Abizar dan Prijono 2010), sedangkan B.
javanica direndam dalam etil asetat:metanol-9:1 (Lina 2010) masing-masing
selama 24 jam. Kemudian cairan ekstrak disaring menggunakan corong kaca (diameter 9 cm) beralaskan kertas saring. Hasil saringan ditampung dalam labu penguap, kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 45 oC dan tekanan 227 mbar. Etil asetat dan etil asetat-metanol (9:1) yang diperoleh kembali dari penguapan digunakan untuk merendam ulang ampas ekstrak tanaman hingga tiga kali perendaman. Ekstrak yang diperoleh disimpan di dalam lemari es pada suhu ± 4 oC sampai digunakan untuk pengujian dan analisis senyawa aktif.
3.2.4 Partisi
Partisi dilakukan dengan metode solvent-solvent extraction, ekstrak dipartisi dalam campuran heksana dan metanol 95% menggunakan corong pemisah. Fase heksana dibilas dengan metanol sebanyak tiga kali kemudian kedua fase hasil partisi ditampung dalam labu didih terpisah yang bobotnya telah ditimbang, dan setiap pelarut diuapkan menggunakan rotary evaporator seperti pada proses ekstraksi. Ekstrak yang diperoleh disimpan di dalam lemari es pada suhu ± 4 oC sampai digunakan untuk pengujian.
3.2.5 Perbanyakan Tanaman Brokoli
Serangga uji diberi pakan daun brokoli (Brassica oleracea L. var. Merk SAKATA, Green magic-Broccoli F1 Hybrid)) yang ditanam pada kantung plastik hitam (polybag). Benih brokoli disemai pada nampan semai 50 lubang yang diisi
media semai “media tanam organik”. Bersamaan dengan penyemaian dilakukan pemupukan dengan pupuk majemuk pelepasan perlahan “Dekastar” (NPK ββ-8- 4). Setelah berumur kurang lebih 4 minggu, bibit brokoli dipindahkan ke polybag (5 l) yang berisi media tanam tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 3:1 sebanyak satu bibit per polybag. Pemeliharaan dilakukan setiap hari, meliputi penyiraman, penyiangan gulma, dan pengendalian hama secara mekanis jika ditemukan hama pada tanaman. Daun brokoli dari tanaman yang berumur ≥ β bulan digunakan sebagai pakan larva C. pavonana pada perlakuan dan pemeliharaan.
3.2.6 Pembiakan Serangga Uji
Serangga uji C. pavonana berasal dari biakan yang diperbanyak di laboratorium. Pembiakan serangga dilakukan mengikuti prosedur yang digunakan oleh Basana dan Prijono (1994). Imago C. pavonana dipelihara dalam kurungan plastik-kasa berbingkai kayu (50 cm x 50 cm x 50 cm) dan diberi makan cairan madu 10% yang diserapkan pada segumpal kapas. Sebagai tempat bertelur digunakan daun brokoli yang tangkainya dimasukkan dalam tabung film berisi air. Kelompok telur pada daun brokoli dikumpulkan setiap hari. Menjelang menetas, kelompok telur dipindahkan ke dalam wadah plastik (28 cm x 20 cm x 5 cm) berjendela kasa yang dialasi dengan kertas stensil, lalu di dalamnya diletakkan daun brokoli bebas pestisida sebagai makanan larva. Setelah menetas larva dipelihara dengan pakan daun brokoli bebas pestisida, setelah menetas menjadi instar II larva digunakan untuk pengujian. Bila tidak digunakan untuk pengujian, larva dipelihara lebih lanjut dalam wadah plastik (35 cm x 25 cm x 6 cm) dengan pakan daun brokoli bebas pestisida. Menjelang berpupa, larva dipindahkan ke dalam wadah plastik lain yang berisi serbuk gergaji sebagai medium berpupa. Pupa yang terbentuk bersama kokonnya diletakkan dalam kurungan kasa-plastik seperti di atas hingga imago muncul untuk pemeliharaan selanjutnya.
3.2.7 Uji Toksisitas Ekstrak dan Fraksi
Ekstrak kasar dari masing-masing tanaman diuji pendahuluan pada konsentrasi 0.5% dan 0.1 % terhadap C. pavonana. Setiap komponen aktif dicampur dengan pelarut metanol dan perekat Tween 80 kemudian diencerkan dengan air sesuai konsentrasi yang telah ditentukan. Konsentrasi akhir metanol dan Tween 80 dalam sediaan uji masing-masing-masing 1% dan 0.2%. Uji
YZ XYZ XZ
XY
lanjutan dilakukan pada kisaran konsentrasi yang mematikan serangga uji 10- 95%, yang ditentukan berdasarkan uji pendahuluan. Fraksi yang diperoleh diuji pada konsentrasi setara LC95 ekstrak kasar.
Potongan daun brokoli (4 cm x 4 cm) dicelup satu per satu dalam suspensi ekstrak pada konsentrasi tertentu hingga basah merata, kemudian dikeringudarakan. Daun kontrol dicelup dalam larutan kontrol yang sesuai. Satu potong daun perlakuan dan daun kontrol diletakkan secara terpisah dalam cawan petri (diameter 9 cm) beralaskan tisu yang ukurannya melebihi diameter cawan. Cawan petri diletakkan pada posisi terbalik. Alas tisu diletakkan pada bagian tutup cawan dan bagian dasar cawan ditutupkan di atas tisu. Dengan demikian, bagian tutup dan dasar cawan tersekat tisu sehingga larva uji tidak dapat keluar dari dalam cawan.
Sebanyak 15 ekor larva C. pavonana instar II yang baru ganti kulit dimasukkan ke dalam setiap cawan petri yang telah berisi daun perlakuan atau daun kontrol, lalu larva tersebut dibiarkan makan selama 24 jam. Masing-masing perlakuan dan kontrol diulang 5 kali. Setelah 24 jam ditambahkan daun perlakuan dan daun kontrol seperlunya. Dua puluh empat jam berikutnya, daun perlakuan diganti dengan daun tanpa perlakuan, larva yang mati dihitung dan dibuang dari cawan sedangkan yang hidup dibiarkan dan dipelihara dengan tetap diberi makan daun tanpa perlakuan sampai larva tersebut mencapai instar 4. Jumlah larva yang mati dan lama perkembangan larva yang bertahan hidup dicatat. Data mortalitas larva diolah dengan analisis probit menggunakan program POLO-PC (LeOra Software 1987). Data lama perkembangan larva dinyatakan sebagai nilai rata-rata
simpangan baku.
3.2.8 Analisis Sifat Aktivitas Campuran
Untuk campuran ekstrak yang komponennya berasal dari jenis tumbuhan yang berbeda, sifat aktivitas campuran dianalisis berdasarkan model kerja bersama berbeda dengan menghitung indeks kombinasi pada taraf LC50 dan LC95. Indeks kombinasi (IK) pada taraf LCx tersebut dihitung dengan rumus berikut (Chou dan Talalay 1984):
Campuran tiga jenis tanaman dihitung dengan rumus berikut: IK=
Campuran dua jenis tanaman dihitung dengan rumus berikut: IK=
LCx1, LCx2, dan LCx3 masing-masing LCx komponen ekstrak 1, 2, dan 3 pada pengujian terpisah; LCx1(cm), LCx2(cm), dan LCx3(cm), masing-masing LC komponen 1, 2, dan 3 dalam campuran yang mengakibatkan mortalitas x (misal 50% dan 95%). Nilai LC tersebut diperoleh dengan cara mengalikan LCx campuran dengan proporsi konsentrasi komponen 1 dan 2 dalam campuran. Kategori sifat interaksi
LCx1 (cm) X LCx1 LCx2 (cm) Y LCx2 LCx3 (cm) LCx3 Z + + + + + + LCx1 (cm) LCx1 LCx2 (cm) LCx2 LCx1 (cm) LCx1 LCx2 (cm) LCx2 K + + x IK=
campuran diadaptasi dari Kosman dan Cohen (1996) dan Gisi (1996) berdasarkan kebalikan nilai nisbah ko-toksisitas:
(1) bila IK < 0.5, komponen campuran bersifat sinergistik kuat; (2) bila IK 0.5–0.77, komponen campuran bersifat sinergistik lemah; (3) bila IK > 0.77–1.43, komponen campuran bersifat aditif;
(4) bila IK > 1.43, komponen campuran bersifat antagonistik. 3.2.9 Uji Fitotoksisitas Ekstrak Campuran
Uji fitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui respons tanaman terhadap beberapa kombinasi ekstrak campuran terhadap daun brokoli yang diaplikasi. Beberapa kombinasi tersebut adalah perbandingan T. vogelii, B.javanica, dan P.aduncum yaitu: A) 1:3:2.5; B) 1:2:2.5; C) 1:1:2.5; D) 1:0.5:2.5; E) 2:1:2.5; F) 2:1:3; G) 2:1:4; H) 3:1:2.5; I) 2:1*:4. Pada perlakuan I digunakan fraksi heksana B. javanica dalam campuran. Selain itu, uji ini juga untuk memastikan bahwa bahan pengemulsi, bahan tambahan, dan proses dalam pembuatan ektrak tidak menyebabkan fitotoksik pada daun tanaman.
Pengujian mengikuti metode yang dikemukakan oleh Dono (2006). Seluruh kombinasi campuran dan formulasi campuran terbaik diuji pada konsentrasi 2 kali LC95 (diketahui dari uji lanjut hubungan konsentrasi dengan mortalitas). Percobaan ini menggunakan brokoli yang ditanam pada plastik polibag. Aplikasi ekstrak dilakukan pada saat tanaman berumur satu setengah bulan menggunakan hand sprayer. Setelah penyemprotan, tanaman brokoli ditempatkan pada tempat terbuka yang terpapar sinar matahari tetapi terlindung dari air hujan.
Pengamatan dilakukan lima hari setelah perlakuan ekstrak meliputi pengukuran luasan bercak nekrosis pada permukaan daun menggunakan kertas kalkir transparan. Selanjutnya luas bercak nekrosis dinyatakan dalam persen (%).
3.3 Hasil dan Pembahasan