DAN Piper aduncum
4.1 Pendahuluan 1 Latar Belakang
Tanaman adalah inang bagi serangga herbivora, interaksi keduanya telah dipelajari secara detail. Ada lima fase yang terjadi saat serangga memilih inangnya yaitu penemuan habitat inang, penemuan inang, pengenalan inang, penerimaan inang, dan kesesuaian inang (Kogan 1982, Scoonhoven 2005). Kesesuaian inang menjadi penentu bagi serangga untuk tetap berada di tanaman tersebut atau meninggalkannya. Indikator yang menentukan kesesuaian serangga dengan inangnya antaralain nutrisi dan keberadaan metabolit sekunder tanaman (Fraenkel 1969).
Nutrisi berupa protein, karbohidrat dan lemak sangat mempengaruhi kebugaran serangga dan keturunannya. Semakin baik kualitas tanaman bagi serangga serta tercukupi kuantitasnya maka serangga akan mencapai kondisi pertumbuhan optimal (Schoonhoven 2005). Sebaliknya keberadaan metabolit sekunder tanaman secara langsung dan tidak langsung menjadi pembatas bagi kehidupan serangga. Metabolit sekunder tanaman dapat menghambat makan (antifeedant), menyebabkan kematian, menghambat peneluran, mengganggu aktivitas pengaturan pertumbuhan, dan menghambat reproduksi.
Pada fase penerimaan inang oleh serangga, terjadi proses makan dan pencernaan. Makanan yang masuk dapat diidentifikasi oleh syaraf pusat sebagai nutrisi atau senyawa toksik. Nutrisi yang masuk meningkatkan asimilasi makanan oleh serangga sebaliknya senyawa toksik akan mempengaruhi asimilasi makanan yaitu laju konsumsi (LK), laju konsumsi relatif (LKR), laju pertumbuhan (LP), laju pertumbuhan relatif (LPR), daya cerna (DC), efisiensi konversi makanan dikonsumsi (EMK), dan efisiensi konversi makanan dicerna (EMC), yang dihitung berdasarkan metode gravimetri (Waldbauer 1968).
Wiyantono et al. (2001) melaporkan bahwa perlakuan fraksi diklorometana biji Aglaia harmsiana tersebut secara kontak pada LD25 menurunkan laju pertumbuhan, efisiensi konversi makanan dikonsumsi, dan efisiensi konversi makanan dicerna larva instar ke-3 Crocidolomia pavonana. Fraksi yang sama mempengaruhi berbagai sifat biologi C. pavonana termasuk menurunkan keperidian dan reproduksi telur imago betina. Lina et al.(2006) melaporkan bahwa fraksi aktif A. harmsiana yang dicampur pada pakan buatan pada LC10 dan LC25 menurunkan laju pertumbuhan (LP) sebesar 33% dan 67% meskipun laju konsumsi (LK) tidak terpengaruh pada Spodoptera litura.
Keberadaan senyawa asing pada makanan menyebabkan serangga meninggalkan tanaman tersebut atau melakukan adaptasi. Sebagian besar serangga menetralisir allelokimia tanaman melalui tiga bentuk adaptasi yaitu adaptasi perilaku, adaptasi fisiologi, dan detoksifikasi senyawa sekunder secara enzimatik (Schoonhoven 2005). Enzim yang paling sering dipelajari dan efektif memetabolisme toksikan adalah sitokrom P450-monooksigenase disebut juga polisubstrat monooksigenase (PSMOs) atau mixed-function oksidase (MFOs) (Dauterman et all 1978). Genom setiap serangga membawa kurang lebih 100 gene P450. Hal ini menjelaskan keragaman pada struktur enzim P450 yang membentuk fungsi dasarnya pada banyak jalur metabolik. Ketika serangga terpapar oleh racun, maka enzim detoksifikasi akan meningkat dalam hitungan menit. Fenomena ini disebut induksi, contohnya Peridroma saucia menunjukkan aktivitas P450 yang rendah saat di pelihara pada pakan buatan. Setelah makan
pada daun peppermint aktivitas sitokrom P450 serangga ini meningkat 45 kali lebih tinggi (Schoonhoven et al. 2005). Piperine yang berasal dari Famili Piperaceae menginduksi fase 1 (sitokrom b5, sitokrom P450) dan fase 2 (glutathione S-transferase GST, asam sulfohidril, melondialdehid MDA) enzim PSMO (Jensen et al. 2006a).
Penghambatan aktivitas enzim sitokrom P450 akan menyebabkan senyawa sekunder tanaman yang bersifat toksin, masuk ke dalam tubuh serangga melalui makanan. Fiksasi sitokrom P450 menyebabkan penumpukan senyawa toksik yang mengakibatkan gangguan fisiologis bahkan kematian serangga. Tumbuhan famili Piperaceae selain bersifat toksik diketahui memiliki sifat sinergis. Senyawa lignan yang mengandung gugus metilendioksifenil dapat menghambat aktivitas enzim sitokrom P450 (Metcalf 1967; Bernard et al. 1989). Menurut Bernard et al. (1990) dilapiol yang berasal dari P. aduncum dapat menghambat aktivitas enzim sitokrom P450 dalam sediaan mikrosom dari sel-sel saluran pencernaan larva penggerek batang jagung O. nubilalis. Sifat sinergis ini sangat menguntungkan untuk pengembangan insektisida nabati sebagai alternatif pengendalian di masa yang akan datang.
4.1.2 Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan dilapiol pada ekstrak kasar dan minyak atsiri P. aduncum, mengamati pengaruh ekstrak T. vogelii dan P. aduncum terhadap fisiologi dan biokimia C. pavonana.
4.2 Bahan dan Metode 4.2.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Toksikologi Serangga, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB), dan Laboratorium Penelitian dan Pelayanan, Kimia Universitas Padjajaran, Bandung, pada bulan Maret 2013 sampai September 2013.
4.2.2 Distilasi Buah Piper aduncum dan Identifikasi
Piper aduncum yang diperoleh dari areal kampus Institut Pertanian Bogor
(IPB) Darmaga dibersihkan dengan kertas tisu dari kotoran yang menempel. Sebanyak 500 gr bahan tanaman dipotong-potong menggunakan gunting atau pisau dan dimasukkan ke dalam labu didih bervolume 3 L. Aquades sebanyak 2,5 L ditambahkan ke dalam labu yang telah berisi bahan tanaman. Proses distilasi dilakukan selama dua jam sejak air di dalam labu mendidih. Minyak yang menetes pada kolom penampung kemudian dipindahkan secara perlahan ke dalam botol kaca. Untuk menghilangkan air yang tersisa di dalam cairan minyak atsiri yang diperoleh digunakan magnesium sulfat. Proses distilasi secara lengkap tampak pada Gambar 4.1.
Minyak atsiri hasil distilasi dan ekstrak kasar yang diperoleh melalui metode ekstraksi (Bab II) diperiksa kemurniannya dengan kromatografi gas (GC- MS) HP-5MS. Kondisi GC-MS sebagai berikut: injektor mode split 101:1, suhu
β50 ˚C, waktu alir γ7.67 menit, kolom yang digunakan adalah Agilent 19091S- 436 HP-5MS, panjang 60 m, diameter 0.25 mm, suhu maksimum kolom γ50 ˚C, aliran pertama 1 µl/menit, dan kecepatan rata-rata 27,01 cm/s. Gas pembawa
4.2.3 Uji Aktivitas Penghambat Makan (antifeedant)
Aktivitas penghambat makan ekstrak campuran diuji terhadap C. pavonana dengan metode residu pada daun dengan metode tanpa pilihan, dengan cara perlakuan sama seperti pada uji toksisitas. Dua lembar daun perlakuan dan daun kontrol dimasukkan ke dalam cawan petri (diameter 9 cm) yang dialas dengan tisu secara terpisah. Larva C. pavonana yang digunakan 15 ekor untuk setiap cawan petri. Larva tersebut dibiarkan makan daun percobaan selama 24 jam, kemudian luas daun yang dimakan langsung dipetakan di atas kertas milimeter untuk dihitung jumlah luas daun yang dimakan. Percobaan disusun dalam rancangan acak lengkap dengan lima ulangan. Pengaruh penghambatan makan tanpa pilihan (PM) dihitung dengan rumus: PM = [1-(Lp/Lk)] x 100%; Lk = luas daun kontrol yang dimakan, Lp = luas daun perlakuan yang dimakan. Perbedaan antara luas daun perlakuan dan luas daun kontrol yang dimakan dianalisis dengan sidik ragam yang dilanjutkan dengan uji selang berganda Duncan (Steel et al. 1997).
4.2.4 Pengaruh Ekstrak Campuran T. vogelii : P. aduncum (1:5) terhadap Asimilasi Makanan oleh Larva C. pavonana
Ekstrak campuran T. vogelii : P. aduncum (1:5) diuji dengan metode residu pada daun terhadap larva C. pavonana instar ke-3 pada konsentrasi LC25 dan LC50 untuk mengetahui pengaruh ekstrak campuran terhadap efisiensi asimilasi makanan. Larva instar yang digunakan dalam percobaan ditimbang satu persatu. Larva yang telah ditimbang langsung dimasukkan ke dalam cawan petri yang di dalamnya telah berisi daun ukuran 4 cm x 4 cm yang telah di beri perlakuan (LC25 dan LC50) dan telah diketahui bobotnya.
Perlakuan ini menggunakan 15 ekor larva C. pavonana instar ke-3. Pengamatan dilakukan 48 jam setelah perlakuan, kemudian larva uji, pakan yang
tersisa, dan fesesnya dikeringkan di dalam oven secara terpisah pada suhu 100˚C
sampai bobotnya konstan. Untuk memperkirakan bobot kering awal, 10 larva dan 10 daun contoh (dengan ukuran yang sama seperti yang digunakan dalam perlakuan) ditimbang secara terpisah kemudian langsung dikeringkan sampai bobotya konstan dan ditimbang lagi. Perbandingan bobot larva atau pakan
A
B C
Gambar 4.1 Proses destilasi bahan tanaman sumber ekstrak: A) buah P. aduncum, B) proses destilasi, C) minyak atsiri
sesudah dan sebelum pengeringan merupakan proporsi bobot kering terhadap bobot basah.
Data yang diperoleh digunakan untuk menentukan nilai parameter efisiensi pemanfaatan makanan. Parameter yang diukur dalam percobaan ini ialah laju konsumsi (LK), laju konsumsi relative (LKR), laju pertumbuhan (LP), laju pertumbuhan relative (LPR), daya cerna (DC), efisiensi konversi makanan dikonsumsi (EMK), dan efisiensi konversi makanan dicerna (EMC), yang dihitung berdasarkan gravimetrik (Waldbauer 1968). Data setiap parameter tersebut diolah dengan sidik ragam dan pembandingan nilai tengah antardosis dilakukan dengan uji Duncan pada taraf nyata 5% (Steel dan Torrie 1993). Parameter-parameter tersebut dihitung sebagai berikut:
Konsumsi = BK pakan awal – BK pakan akhir ……...……….……..(mg) Bobot rata-rata larva = BK larva awal + BK larva akhir ………..………..(mg)
2
Laju konsumsi relative (LKR) = Laju konsumsi ……….(mg mg-1 hari-1) Bobot rata-rata larva
Laju pertumbuhan (LP) = BK larva akhir – BK larva awal …………..(mg hari-1) Periode makan
Laju pertumbuhan relatif (LPR) = Laju pertumbuhan …...(mg mg-1 hari-1) Bobot rata-rata larva
Daya cerna (DC) = Konsumsi – BK kotoran X 100%………..…..(%) Konsumsi
Efisiensi makanan dikonsumsi (EMK) = BK larva akhir – BK larva awal X 100%.(%) Konsumsi
Efisiensi makanan dicerna (EMC) = BK larva akhir – BK larva awal X 100%.(%)
Konsumsi – BK kotoran
4.2.5 Uji Enzim Sitokrom b5 dan Sitokrom P450
Pengujian sitokrom P450 mengacu pada metode yang dikemukakan oleh Omura dan Sato (1964). Pengujian in-vivo sitokrom P450 dan b5 dilakukan dengan memberi larva C. pavonana instar 3 daun yang sudah diberi perlakuan minyak atsiri hasil distilasi P. aduncum pada konsentrasi 0.24% (LC50). Perlakuan menggunakan metode residu pada daun seperti yang dilakukan pada uji toksisitas. Larva instar tiga yang baru ganti kulit diberi pakan daun yang sudah diberi perlakuan hingga larva ganti kulit menjadi instar empat. Larva instar 4 ini digunakan dalam percobaan sebagai sumber enzim.
Enzim diperoleh dari mikrosom yang terdapat pada retikulum endoplasma dan dari mitokondria di saluran pencernaan larva C. pavonana. Larva C.
pavonana instar 4 sebanyak 20 ekor dibedah dengan jarum bedah untuk
mengambil organ pencernaan. Larva diletakkan di atas cawan petri yang berisi buffer bedah dingin. Buffer bedah adalah buffer fosfat 100 mM, pH 7 yang mengandung 1.15% KCl. Pembedahan dilakukan dengan menusuk bagian Bobot kering (BK) = bobot basah x BK contoh
BB contoh BK
posterior abdomen dan menariknya perlahan ke arah luar. Saluran pencernaan kemudian ditarik perlahan hingga terlepas dari bagian anterior larva. Sisa makanan yang ada sedapat mungkin dibuang dengan menekan perlahan. Lemak tubuh dan sisa makanan dibersihkan kemudian saluran pencernaan segera di masukkan ke dalam 2 mL bufer homogenisasi dingin dalam tabung polipropilen 50 mL. Bufer homogenasi merupakan buffer fosfat 100 mM dan 20% gliserol.
Selanjutnya tabung dimasukkan ke dalam wadah berisi es dan di pasang pada alat homogenizer. Homogenisasi dilakukan pada kecepatan 1000 rpm selama 45 detik atau lebih. Kemudian ditambahkan 5 mL buffer homogenisasi dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 Xg selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan merupakan larutan enzim dan bisa langsung digunakan untuk pengujian. Proses homogenisasi dan sentrifugasi berpotensi menghasikan panas yang mengakibatkan enzim terdenaturasi. Untuk menjaga stabilitas struktur enzim digunakan buffer dalam kondisi dingin yang diharapkan dapat meredam panas. Stabilitas struktur pun dapat dirusak oleh kehadiran enzim protease. Untuk mengatasi hal tersebut pada tahap ini ditambahkan phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) yang merupakan penghambat enzim protease. Metode analisis enzim mengacu pada (Kranthi 2005; Omura dan Sato 1964).
Uji aktivitas sitokrom b5 secara in-vivo dilakukan dengan memipet 3 mL larutan enzim kemudian dimasukkan ke dalam dua kuvet kuarsa ukuran 4 mL. Kuvet kemudian diletakkan di dalam spektrofotometer sebagai sampel dan referensi. Kemudian diukur pada panjang gelombang 350 hingga 500 nm dengan menggunakan model scan panjang gelombang. Hasil pengukuran disebut sebagai garis dasar (base line). Sodium dithionite (5 mg) ditambahkan ke dalam enzim yang ada di dalam kuvet sampel. Kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang untuk mereduksi enzim. Perubahan spektrum diukur dengan mode scan panjang gelombang dari 350-500 nm. Data yang diperoleh digunakan untuk mengukur aktivitas sitokrom b5. Perbedaan absorbansi antara panjang gelombang 424 nm dan 409 nm (ABS pada 424 nm-ABS pada 409 nm) bisa digunakan untuk menghitung jumlah sitokrom b5, menggunakan koefisien ekstingsi 184 cm-1 mM- 1
.
Pada pengujian in-vitro, sebanyak 100 µL minyak P. aduncum hasil distilasi yang telah diencerkan dengan buffer sebanyak 100 kali dimasukkan ke dalam kuvet dan ditambahkan dithionite. Prosedur lainnya tidak berbeda dengan perlakuan in-vivo. Untuk melanjutkan dengan uji sitokrom P450, larutan pada kuvet sampel dan referensi di pindahkan ke dalam tabung reaksi yang bersih. Tambahkan 5 mg sodium dithionite, di kocok rata dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Selanjutnya cairan enzim ini dimasukkan kembali ke kuvet berukuran 4 mL sebanyak 3 mL diletakkan pada slot kuvet yang disarankan dan yang lainnya pada slot sampel dan referensi pada spektrofotometer double beam UV. Dan garis dasarnya dicatat dari 400 sampai 500 nm. Selanjutnya Isi kuvet sampel dipindahkan ke dalam tabung reaksi dan direduksi dengan CO seperti metode yang dilakukan Kranthi (2005) selama 2 menit. Kemudian tabung ditutup dengan alumunium foil untuk menghindari cahaya. Isi kuvet dipindahkan kembali kedalam kuvet 4 mL dan diletakkan pada sampel kuvet di spektrofotometer. Perbedaan spectrum dari 400 sampai 500 nm dicatat. Perbedaan absorban antara 450 nm dan 490 nm (ABS pada 450 nm-ABS pada 490) bisa digunakan untuk menghitung sitokrom P450, menggunakan perbedaan ekstinsi ko-effisien 91cm-1
mM-1. Perbedaan absorbansi antara 420 nm dan 490 nm (ABS pada 420 nm-ABS pada 490 nm) bisa digunakan untuk menghitung kandungan P420, menggunakan perbedaan ko-efisien 110 cm-1mM-1.
Karbon monoksida dihasilkan dari reaksi antara asam format dan asam sulfat. Sebanyak 5 mL asam formit ditambahkan ke dalam 10 mL asam sulfat. Berikut adalah penghitungan untuk aktivitas sitokrom b5 dan sitokrom P450. Penghitungan diatas menggambarkan kandungan sitokrom b5 dan sitokrom P450 per mg protein.