Penelitian ini menggunakan metode eksperimen. Contoh lansia dalam penelitian ini adalah lansia yang berada di Panti Werdha dan bersedia menandatangani fomulir persetujuan untuk ethic informed consent. Seleksi responden diambil dari lansia penghuni panti yang memenuhi kriteria penelitian.
Pemeriksaan responden dilakukan bertingkat dimulai dari observasi kondisi fisik seperti pengukuran berat badan dan tinggi badan serta pemeriksaan klinik oleh dokter. Jika lansia bersedia menandatangani informed consent maka responden resmi menjadi subyek penelitian.
Perhitungan jumlah sampel untuk penelitian eksperimen:
Jumlah sampel dihitung berdasarkan parameter jumlah Natural Killer Cell
dari penelitian Gill HS. et al. tahun 2001 (Am J Clin Nutr 2001; 74:833-839) dengan menggunakan a=95% dan power of study= 80%
n = [(ka + kß)SD]2 d2 = [(1.96 + 0.84)1.4]2 (0.7)2 = [(2.8).1.4]2 0.49 = 31.36
Perkiraan jumlah drop out =10% n = 1 X n
1-F
= 1 X 31.36 ~ 34.84 responden 1-0.1
Keterangan:
n = Jumlah Responden ka = Kesalahan tipe 1 kß = Kesalahan tipe 2
SD = Standar Deviasi setelah pemberian susu tanpa probiotik (Gill H.S, et al, 2001) d = Perbedaan rata-rata antara nilai setelah pemberian susu tanpa probiotik dengan
setelah pemberian susu dengan probiotik (medium treatment effect = 0,5 x SD = 0,5x1,4=0,7).
F = Perkiraan jumlah drop out (10%)
Cara memilih sukarelawan sehat :
Pemilihan subyek akan dilakukan dengan bekerjasama dengan dua Panti Werdha di Bogor, dengan kriteria inklusi :
• Lansia berumur 60 -80 tahun yang tinggal di Panti Werda • Sehat secara umum
• Bersedia mengikuti aturan dalam penelitian seperti tidak mengkonsumsi produk probiotik dan antibiotik setidaknya 1 bulan sebelum studi dimulai Kriteria eksklusi:
• Tidak mengidap penyakit akut atau kronis dan tidak memiliki masalah makan seperti lactosa intolerance.
Studi outline N = 36 End line Prosedur Penelitian:
Subyek merupakan satu grup, dengan pengambilan dan analisa darah serta saliva dilakukan sebanyak tiga kali, yaitu tahap awal sebelum dilakukan intervensi, tahap ke dua setelah intervensi 3 minggu pemberian 125 ml susu UHT rendah lemak tanpa probiotik setiap hari (run in period), dan tahap ketiga atau terakhir setelah intervensi 3 minggu pemberian susu UHT rendah lemak dengan probiotik (setiap hari). Susu diantarkan ke Panti tempat kediaman subyek.
Pengukuran yang dilakukan meliputi:
§ Wawancara dan pemeriksaan fisik (pada awal)
§ Pengukuran antropometri meliputi berat dan tinggi badan
Pengambilan dan analisa darah dan saliva(1)
Pengambilan dan analisa darah dan saliva (2)
3 minggu pemberian susu dengan probiot ik (r un i n per i od) N=36 Base line N=36 Mid line
3 minggu pemberian susu t anpa probiot ik set iap
hari (run in period)
Pengambilan dan analisa darah dan saliva(3)
§ Pengukuran asupan makanan melalui wawancara dengan metode 24h-recall
§ Pengambilan darah dan saliva untuk pengukuran status imun dengan indikator IgA serum dan sIgA (sebelum dan di tiap tahap intervensi).
Parameter yang digunakan pada penelitian ini adalah IgA, hal ini dilakukan berdasarkan hasil penelitian Surono, dkk dalam penelitian Riset Unggulan Terpadu (2004) yang menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata pada IgA anak balita yang diberikan susu probiotik BAL dadih Leuconostoc mesenteroides IS 27526 dan tidak signifikan pada IgG.
Salah satu respon imun yang banyak terjadi pada mukosa adalah respon imun humoral dan produksi sIgA (IgA sekretori) (Isolauri, 2001; Brassart dan Schiffrin, 2000 dalam Surono, 2004). sIgA ideal untuk menjaga permukaan mukosa dari antigen dengan cara mencegah pelekatan antigen pada sel epitel. sIgA paling banyak diproduksi oleh MALT dan sangat baik untuk merefleksikan respon saluran pencernaan secara spesifik.
Bahan dan Alat
Bahan dan alat yang digunakan pada penelitian tahap satu yang menggunakan metoda surve i ialah alat untuk mengukur status gizi lansia secara antropometri yaitu berupa timbangan dan alat ukuran tinggi badan.
Bahan yang akan digunakan dalam penelitian tahap eksperimen adalah bubuk probiotik yang berasal dari pembiakan bakteri asam laktat strain IS-27526 asal susu fermentasi tradisional dadih. Identifikasi mikroskopik uji biokimia menunjukkan bahwa IS -27526 adalah Leuconostoc mesenteroides, selanjutnya dengan uji
identifikasi molekuler dengan PCR (nucleotid sequence) menunjukkan strain IS-27526 adalah Enterococcus faecium (Dharmawan, dkk, 2006). Dengan demikian pada penelitian ini disebut sebagai spesies bakteri Enterococcus faecium IS-27526. Susu yang digunakan adalah susu UHT rendah lemak dari PT Ultra, mengingat konsumsi lemak pada lansia harus dibatasi. Lansia cenderung lebih mudah gemuk dibandingkan kelompok dewasa muda karena untuk berat badan yang sama komposisi lemak dalam tubuh lansia lebih banyak sehingga bila dalam dietnya lansia banyak mengonsumsi lemak sedangkan aktivitas berkurang, akan meningkatkan kasus obesitas yang akan memicu kehadiran penyakit degeneratif.
Bahan-bahan untuk analisis IgA dengan Metode sandwich ELISA: monoclonal anti human IgA, anti- human IgA, PBS (Phosphat Buffer Saline) 0,01 M, larutan substrat TMB (Tetramethyl Benzine), larutan blocking casein 0,5%, Tween 20, larutan H2SO4 1,25. Susu yang digunakan adalah susu UHT rendah lemak dari PT Ultra sebanyak 125 ml, mengingat konsumsi lemak pada lansia harus dibatasi. Alat yang digunakan adalah alat pengujian serum darah dan saliva untuk melihat kuantitatif Imunoglobulin A seperti: disposal syringe wide needle, tabung sentrifuse, sentrifuse, vial, rak vial, ependorf, micropipet single channel 10 – 100 µl, micropipet multi channel 50 – 200 µl, tip pipet 200 µl, 96 maxisorp immunoplate, ELISA reader, serta kuesioner untuk melihat kondisi lansia yang mendapatkan susu probiotik.
Jenis dan Cara Pengumpulan Data
Data IgA berasal dari serum dan saliva diambil pada awal penelitian, setelah 3 minggu minum susu tanpa probiotik dan setelah tiga minggu mengonsumsi susu dengan probiotik.
Metode Analisis Antibodi IgA
Metode yang digunakan untuk menganalisis jumlah total sekresi antibodi IgA pada serum darah dan saliva adalah Sandwich ELISA (Enzym-Linked Immunoabsorbent Assay) modifikasi dari metode Becton Dickinson. Pertama-tama dilakukan optimasi range kurva standar IgA manusia yang linier dan analisis pengenceran serum dan saliva yang optimum dari beberapa tingkat pengenceran (serum: 5x; 10x; 20x; dan 50x; sedangkan saliva: 15x, dan 30x). Adapun langkah-langkah yang dilakukan adalah sebagai berikut:
a. Dilakukan coating pada mikroplat maxisorp 96 sumur (96-well microtiter plate)
yaitu dengan penambahan 100µl/well mouse monoclonal anti human IgA 1:1000 yang diencerkan dengan buffer karbonat, diinkubasi semalam (10-12 jam) pada suhu ruang,lalu dicuci dengan larutan pencuci (0.05 tween 20-PBS) sebanyak tiga kali dengan metode botol pencuci.
b. Ditambahkan larutan blocking kasein 5% sebanyak 100 µl/well, diinkubasi selama 2 jam 15 menit pada suhu ruang (29-310C), lalu dicuci dengan larutan pencuci (PBS+0.05% tween 20).
c. Ditambahkan 100 µl/well serum sampel (standar IgA sampel) yang telah diencerkan pada sumur yang berbeda, diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang,
lalu dicuci tiga kali dengan larutan pencuci (PBS+0.05% tween 20). Pengenceran serum yang optimum adalah 10 kali dan saliva 15 kali dengan PBS. Serum dan dan standar human IgA untuk analisis serum yang ditambahkan pada plat sebanyak 100 µl, sedangkan saliva hanya 50 µl. Setiap sampel sebanyak 3 kali (triplo). Kisaran konsentrasi standar IgA manusia yang linier adalah 1 – 1000 µl/ml.
d. Setelah dicuci tiga kali, ditambahkan 100 µl/well antibodi sekunder yaitu goat anti-human IgA (a-chain specific) Peroxidase conjugate 1 :20.000 yang diencerkan dengan PBS diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar.
f. Setelah dicuci dengan larutan pencuci (PBS+0.05% tween 20), ditambahkan 100 µl/well larutan substrat TMB (Tetramethylbenzidine), diamkan selama 30 menit sehingga terbentuk warna biru. Reaksi ini dihentikan dengan menambahkan 100 µl/well larutan H2 SO4 1.25 M sebagai stopping solution sehingga terbentuk warna kuning.
g. Dibaca Optical Density (OD) dari tiap well pada Microtiter plate pada dua panjang gelombang 450 nm dan 650 nm dengan menggunakan ELISA reader
multiskan.
h. Kurva standar IgA dibuat dari nilai rata-rata OD standar IgA pada setiap konsentrasi. Rata-rata OD yang diperoleh dari setiap sampel diplot terhadap kurva standar sehingga didapat nilai konsentrasi IgA sampel (µg/ml), kemudian dikonversi dengan faktor pengenceran dan diubah satuannya ke dalam mg/ml.
Pengolahan dan Analisis Data
Data konsumsi menggunakan Paket Program Boga dan Gizi (PPBG), status gizi lansia ditentukan berdasarkan indeks massa tubuh (IMT). Perbedaan tingkat depresi , one way ANOVA untuk uji beda konsumsi pangan. Hasil uji coba dianalisis dengan menggunakan one-way ANOVA yang dilanjutkan dengan uji perbandingan berganda Tukey,s untuk melihat perbedaan total konsentrasi IgA serum dan saliva sebelum dan sesudah intervensi. Untuk menghilangkan pengaruh susu, maka dilakukan uji- t antara selisih rata-rata antara kenaikan konsentrasi total sebelum pemberian susu dan sesudah pemberian susu dengan selisih rata-rata sesudah diberikan susu dengan susu probiotik.
Definisi Operasional:
• Respons imun (konsentrasi total IgA serum dan saliva) untuk indikator keberhasilan intervensi dengan susu probiotik.
• Probiotik adalah kultur tunggal atau campuran dari mikroorganisme hidup yang bila diaplikasikan atau dikonsumsi oleh hewan atau manusia memberikan dampak positif terhadap kesehatan dengan memperbaiki keseimbangan mikroflora usus. Dalam penelitian ini digunakan bakteri probiotik yang berasal dari dadih Enterococcus faecium IS-27526, dibiakkan dalam susu skim lalu dikeringkan beku (freeze dried).
• Susu rendah lemak ialah susu UHT rendah lemak yang diproduksi oleh PT Ultra. Susu ini baik untuk diberikan pada lansia karena konsumsi lemak pada lansia harus dibatasi. Jumlah yang diberikan 125 ml/hari.
• IgA ialah antibodi Imunoglobulin A yang terdapat pada serum darah dan sIgA yang berasal dari saliva.
Hasil dan Pembahasan
Penelitian in i merupakan studi eksperimental. Dalam penelitian ini subyek dijadikan satu kelompok dengan mendapatkan perlakuan yang sama, maksudnya adalah agar mendapatkan keseragaman kondisi fisiologis antara sebelum mendapatkan perlakuan dengan sesudah mendapatkan perlakuan.
Kultur probiotik yang ditambahkan berada dalam bentuk bubuk kering beku dengan total bakteri hidup 2,31 x 1011 cfu/g (Surono, 2003). Jumlah sel mikroba hidup yang harus terdapat pada produk probiotik masih menjadi perdebatan namun umumnya adalah sebesar 106 - 108 cfu/ml (Tanock, 1999), sehingga dosis yang ditambahkan untuk mendapatkan sel-sel sebesar 0.4329 mg Dengan mempertimbangkan kemungkinan probiotik yang tercecer dan menempel pada pengemas, maka probiotik kering beku yang ditimbang ke dalam kemasan adalah sebesar 1 mg. Probiotik dikemas dalam aluminium foil (2x7 cm2 ) yang telah disterilisasi dengan sinar UV di dalam ruang laminar flow, sehingga siap dicampurkan ke dalam susu UHT untuk dikonsumsi oleh contoh.
Proses penuaan memiliki pengaruh yang besar tehadap sel B dan perubahan tidak pasti pada sel T. Mucosal-associated lymphoid tissue (Malt) merupakan sepertiga bagian dari semua jaringan limfoid tampak berubah dengan proses penuaan.
Komposisinya 75% terdiri dari sel T dan di kelenjar limfe menunjukkan turunnya kemampuan berproliferasi terhadap respon mitogen phytohemagglutinin dan oncanavalin A dengan adanya proses penuaan. Respon antibodi spesifik terhadap antigen secara bermakna menurun di kelenjar limfe dan dijumpai pula penurunan jumlah antibodi. Perubahan humoral yang ditemukan di jaringan tersebut seringkali akibat perubahan dari sel T yang diperlukan untuk memacu respon antibodi (Sigal dkk., 1994). Oleh karenanya hal ini menjadi alasan dipilihnya lansia menjadi contoh. Konsumsi probiotik pada lansia diharapkan dapat menstimulir respon imun sehingga dapat meningkatkan ketahanan tubuh.
Konsentrasi Total IgA Serum
Analisis sekresi antibody IgA dilakukan dengan menggunakan metode Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Pada penelitian ini teknik ELISA yang digunakan adalah sandwich ELISA yang menggunakan dua jenis antibodi.
Untuk analisis kadar IgA manusia dengan metode ELISA, maka IgA berperan atau diperlakukan sebagai antigen (target), dimana serum darah direaksikan dengan antibodi IgA manusia sehingga terbentuk kompleks imun antigen antibodi di dalam
microtiter plates yang memiliki permukaan padat yang dapat mengadsorp protein antibodi. Untuk mengetahui apakah sudah terbentuk kompleks, maka ditambahkan antibodi anti IgA manusia yang telah berkonjugasi dengan enzim (horse radish peroxidase atau alkalin fosfatase) , antibodi kedua ini disebut antibodiconjugated (co: horse radish conjugated antibodi). Tahap selanjutnya adalah penambahan substrat yang kompatibel dengan enzim yang terkonjugasi pada antibodiconjugated, sehingga
terjadi reaksi antara enzim dengan substrat yang menimbulkan perubahan warna. Perubahan warna ini di cek dengan alat ELISA reader sehingga diperoleh data berupa
Optical Density (OD).
Intensitas perubahan warna bersifat proporsional (berbanding lurus) terhadap jumlah enzyme conjugated antibody anti IgA manusia yang berikatan dengan IgA yang pada akhirnya berbanding lurus pula dengan jumlah IgA yang terdapat pada sampel yang diujikan (Tizard, 1988).
Hasil analisis total serum IgA lansia sebelum perlakuan, sesudah diberi susu selama tiga minggu dan sesudah diberi susu probiotik selama tiga minggu dapat dilihat pada Gambar 16.
Gambar 16. Diagram batang konsentrasi IgA serum total sebelum dan sesudah perlakuan
Data tersebut menunjukkan adanya peningkatan IgA serum, dimana sebelum diberikan perlakuan (base line) sebesar 0,226 mg/ml, sesudah diberikan susu (mid