BAB III. METODE PENELITIAN
3.4 Metode Pengumpulan Data
Metode pengumpulan data dalam penelitian ini adalah data primer, yaitu data yang diperoleh langsung oleh penelitinya sendiri dari hasil pengukuran berupa diameter zona hambat ekstrak kulit durian (Durio zibethinus Murray) yang diukur menggunakan jangka sorong.
3.4.1 Alat dan Bahan Penelitian 3.4.1.1 Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender, kain lap, kertas saring, cawan penguap, erlenmeyer (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), tabung reaksi (Pyrex), rak tabung reaksi, spatula, batang pengaduk, corong, cawan petri, ose, pembakar bunsen, gelas objek, deck glass, mikroskop (Olympus), pipet tetes, mikropipet, inkubator, laminar air flow, timbangan digital, autoklaf, microwave, pelubang gabus, vortex, dan jangka sorong.
3.4.1.2 Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit durian (Durio zibethinus Murray), Sabouraud’s Dextrose Agar, Sabouraud’s Dextrose Broth, ketokonazol, air, aquades, etanol 70%, Dimethyl Sulfoxide (DMSO), reagen pewarnaan Gram, standar McFarland, dan suspensi jamur Candida albicans.
3.4.2 Determinasi Tanaman
Tahap pertama penelitian adalah menggunakan determinasi tanaman durian (Durio zibethinus Murray). Determinasi tanaman dilakukan dengan menunjukkan tanaman durian beserta buah durian lalu ditetapkan kebenarannya sesuai ciri-ciri
morfologi. Determinasi dilakukan di Laboratorium Herbarium Medanese (MEDA) Universitas Sumatera Utara
3.4.3 Pembuatan Ekstrak
Ekstrak kulit durian dibuat dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70%. 1 kilogram kulit durian segar dibersihkan dari kotoran, dicuci dengan air mengalir sampai bersih dan dijemur dibawah sinar matahari selama 2 minggu.
Kemudian, kulit durian dihaluskan menjadi serbuk dengan menggunakan alu kemudian dihaluskan lagi dengan blender. Setelah itu, kulit durian yang telah halus dimaserasi dengan dicampurkan 3 L etanol 70% di dalam bejana kemudian ditutup rapat dan direndam selama 24 jam sambil sesekali diaduk. Setelah 24 jam, larutan ekstrak kulit durian disaring sehingga diperoleh filtrat dan ampas. Selanjutnya, dilakukan perendaman kembali terhadap ampas tersebut dengan menggunakan etanol 70% sebanyak 3 L selama 24 jam sambil sesekali diaduk kemudian filtrat disaring menggunakan corong dan kertas saring lalu ditampung. Selanjutnya filtrat yang tersisa diuapkan menggunakan cawan penguap di dalam waterbath sehingga diperoleh ekstrak kental.
3.4.4 Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak
Ekstrak kulit durian yang terbentuk (kadar konsentrasi 100%) akan diencerkan dengan menggunakan Dimethyl Sulfoxide (DMSO) dengan tingkat konsentrasi 6,25%, 12,5%, 25%, dan 50% menggunakan rumus pengenceran:
N1 x V1 = N2 x V2
Keterangan :
N1 = Konsentrasi 100% (%)
V1 = Volume larutan dengan konsentrasi 100% yang diperlukan (mL) N2 = Konsentrasi yang diinginkan (%)
V2 = Volume konsentrasi yang diinginkan (mL)
3.4.5 Pembuatan Suspensi Jamur
Diambil satu mata ose biakan jamur Candida albicans yang berumur 24 jam, kemudian dicampurkan ke dalam tabung reaksi yang berisi cairan NaCl 0,9%
sebanyak 10 mL. Suspensi jamur dihomogenkan dengan vortex kemudian kekeruhannya disamakan dengan standar McFarland 0,5.
3.4.6 Identifikasi Jamur
3.4.6.1 Identifikasi Makroskopis
Diambil sampel 36uspense dengan penyerapan menggunakan lidi kapas steril selama satu sampai lima menit lalu diinokulasikan pada cawan petri yang berisi Sabouraud Dextrose Agar (SDA) secara merata kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam dan koloni Candida albican akan terlihat.
3.4.6.2 Identifikasi Mikroskopis
Pertama teteskan larutan KOH 10% pada objeck glass kemudian dibasahi ujung ose dengan menggunakan larutan KOH 10% dan diambil koloni dengan menggunakan ose lalu diletakkan koloni pada tetesan KOH 10% dan ditutup dengan deck glass dan hindari terjadinya gelembung udara selanjutnya dilewatkan sediaan tersebut beberapa kali diatas nyala api terakhir diperiksa di bawah mikroskop mula-mula dengan perbesaran 10x dan perbesaran 40x. Kemudian diamati bagian-bagiannya seperti blastospora dan psudohifa.
3.4.6.3 Pewarnaan Gram
Suspensi jamur Candida albicans diambil sebanyak satu ujung mata ose dan diratakan pada gelas objek yang telah dibersihkan dan bebas dari lemak. Kemudian, fiksasi spesimen jamur dengan melayangkan gelas objek di atas nyala api bunsen hingga kering dan spesimen siap diwarnai.
Spesimen yang telah siap diwarnai digenangi dengan zat warna crystal violet selama satu menit. Setelah itu, spesimen dicuci dengan air sampai zat warna luntur.
Kemudian, spesimen digenangi dengan larutan lugol selama satu menit.
Selanjutnya, spesimen dicuci kembali dengan air. Spesimen kembali digenangi dalam alkohol 96% selama 30 detik dan dibilas dengan air. Spesimen digenangi lagi dengan safranin selama 1-2 menit dan spesimen kembali dibilas dengan air. Setelah itu, spesimen dikeringkan di udara dan spesimen siap diamati di bawah mikroskop.
Struktur yang perlu diperhatikan secara mikroskopis dengan pewarnaan Gram adalah sel-selnya berbentuk oval, lonjong atau bulat, budding sel, pseudohifa dan blastospora.
3.4.6.4 Uji Biokimia
Koloni yang tumbuh pada media Sabouraud Dextrose Agar diambil sedikit untuk diidentifikasi dengan cara tes fermentasi terhadap glukosa 1%, maltosa 1%, laktosa 1% dan sakarosa 1% diinkubasi pada suhu kamar 1-2 hari. Pertumbuhan diamati dengan adanya perubahan yang terjadi, kemampuan jamur tersebut dalam memfermentasi gula – gula menjadi asam dan gas atau tanpa gas. Fermentasi asam dilihat dari perubahan warna media dari ungu menjadi kuning dan dengan terbentuk gas atau tidak. Pembentukan gas dapat dilihat dari adanya gelembung udara pada tabung (Jawetz, 2018). Hasil Positif Candida albicans yaitu jamur Candida albicans dapat meragikan glukosa, sukrosa dan maltosa menghasilkan asam dan gas dan tidak bereaksi dengan laktosa (Jawetz, 2018).
3.4.7 Pembuatan Media Sabouraud Dextrose Agar
Serbuk Sabouraud Dextrose Agar sebanyak 65 gram dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer dan dilarutkan dengan 1000 mL aquades hingga homogen.
Suspensi yang dihasilkan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya, tabung dimasukkan ke dalam autoklaf dengan suhu 121°C selama 15 menit. Media Sabouraud Dextrose Agar yang telah mengalami perlakuan tersebut diinkubasikan selama 18-24 jam pada suhu 37°C tanpa dibalik.
3.4.8 Uji Potensi Antijamur (Difusi)
Metode yang digunakan untuk uji potensi antijamur ini adalah metode difusi dengan cara sumuran. Suspensi jamur Candida albicans diambil satu ujung ose yang telah dipanaskan, kemudian dilakukan metode streak plate atau penggoresan ke media SDA. Setelah itu dilakukan metode sumuran, metode ini menggunakan sumur sebagai tempat meletakkan zat antijamur yang akan diuji. Media Sabouraud Dextrose Agar yang telah padat dilubangi menggunakan alat pelubang gabus dengan diameter 7 mm (Balouiri et al., 2016). Kemudian ekstrak etanol kulit durian (Durio zibethinus Murray) dengan konsentrasi 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%
masing-masing sebanyak 0,2 ml dimasukkan ke dalam lubang tersebut. Media Sabouraud Dextrose Agar yang telah mengalami perlakuan tersebut diinkubasikan selama 18-24 jam pada suhu 37°C tanpa dibalik. Pada penelitian ini, kontrol positif digunakan ketokonazol, sedangkan sebagai kontrol negatif digunakan DMSO.
Hasil aktivitas antijamur ekstrak etanol kulit durian (Durio zibethinus Murray) diamati secara visual dengan mengukur diameter zona hambat di sekitar sumuran menggunakan jangka sorong.
3.4.9 Penentuan KHM (Dilusi)
Penentuan KHM dilakukan dengan metode dilusi cair. Pada pengamatan hasil, dilihat zona hambat yang terbentuk di sekitar sumuran. Setelah mendapatkan zona hambat, range konsentrasi zona hambat digunakan untuk menentukan KHM dengan metode dilusi cair. Variasi konsentrasi dilusi cair dibuat berdasarkan konsentrasi terkecil yang masih memberikan zona hambat dari uji potensi antijamur.
Uji daya hambat minimal ekstrak kulit durian dilakukan dengan metode dilusi cair. Diawali dengan memasukkan suspense jamur sebanyak 0,1 ml dan 0,9 ml larutan uji ekstrak dalam berbagai konsentrasi ke dalam tiap tiap tabung yang berisi 9 ml larutan Sabaroud Dextrose Broth (SDB) kemudian di vortex agar homogen.
Campuran suspense jamur dan larutan uji ekstrak tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Seri konsentrasi tersebut direplikasi tiga kali. Hasil dari penentuan KHM ini dibandingkan kekeruhannya dengan kontrol positif formalin
dan kontrol negatif SDB saja. Kekeruhan menunjukkan adanya pertumbuhan jamur sedangkan media yang jernih menunjukkan tidak adanya pertumbuhan jamur.
Media yang sangat keruh diberi notasi (+++), keruh (++), agak keruh (+) dan media yang jernih diberi notasi – untuk memudahkan pengamatan (Murtiwi, 2014).
3.4.10 Penentuan KBM (Uji Penegasan)
Hasil dari dilusi cair selanjutnya dilakukan uji penegasan untuk mengetahui KHM dan KBM. Tabung yang paling jernih (dipilih dua konsentrasi terkecil) dilakukan uji penegasan. Uji penegasan dilakukan tiga kali sesuai dengan replikasi yang dilakukan pada uji dilusi. Uji penegasan dilakukan dengan menggoreskan ose pada media SDA steril dengan metode streak Plate. Diinkubasi selama 24 jam dan diamati, bila masih terdapat pertumbuhan jamur disekitar goresan streak plate maka menunjukkan KHM, sedangkan bila tidak terdapat pertumbuhan jamur di sekitar goresan streak plate maka menunjukkan KBM
Penentuan KHM pada metode dilusi ditetapkan dari larutan uji dengan kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji. Penentuan KBM pada uji penegasan ditetapkan jika media tersebut tidak terdapat pertumbuhan mikroba (Pratiwi, 2008).