Sawar Darah Otak Tikus pascacedera Kepala ABSTRAK
METODE PENELITIAN
3) Pewarnaan Imunohistokimia VEGF
Pewarnaan Imunohistokimia VEGF dilakukan dengan cara: jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada object glass dan kemudian dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Adapun caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan tersebut secara berturut-turut ke dalam xylol sebanyak tiga kali (@ dua menit). Setelah itu, dimasukkan secara berturut-turut ke dalam etanol dengan konsentrasi bertahap menurun, yaitu mulai dari etanol 100% tiga kali (@ satu menit), 95% dua kali (@ satu menit), selanjutnya 90%, 80%, dan 70% masing-masing satu menit, setelah itu dilakukan pencucian dengan air kran sekitar 5 menit dan dimasukkan pada peroksida 3% (30 menit) untuk menghilangkan peroksidase endogenus. Kemudian, dilakukan pencucian dengan air, dibilas dengan aquadestilat, dan PBS masing-masing dua menit. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam larutan trypsin 0,025% dalam PBS (pH.7,4) selama enam menit pada 37oC. Setelah dicuci dengan PBS tiga kali (@ dua menit), jaringan dimasukkan ke dalam antibodi primer (anti VEGF mouse anti Rat) selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali (@ dua menit), selanjutnya dimasukkan ke dalam antibodi sekunder yaitu
Rabbit anti mousebiotinilated label selama 30 menit. Selanjutnya, dicuci dengan PBS dua kali (@ dua menit), dan berturut-turut dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali (@ dua menit), dimasukkan ke dalam substrat kromogen (DAB solution) selama lima menit, dicuci dengan PBS tiga kali (@ dua menit), dibilas dengan aquadestilata, dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin selama enam menit, dicuci dengan air mengalir, dan akhirnya dilakukan
mounting dan dapat diamati pada mikroskop cahaya. 4) Pewarnaan Imunohistokimia AQP-4
Pewarnaan Imunohistokimia AQP-4 dilakukan dengan cara: jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada object glass dan dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Adapun caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan tersebut secara berturut-turut ke dalam xylol sebanyak tiga kali (@ dua menit), dimasukkan secara berturut-turut ke dalam etanol dengan konsentrasi bertahap menurun, yaitu mulai dari etanol 100% (tiga kali) @ satu menit, 95% (dua kali) @ satu menit, serta 90%, 80%, dan 70% masing-masing satu menit dan kemudian dilakukan pencucian dengan air kran sekitar 5 menit. Setelah itu, jaringan dimasukkan pada peroksida 3% (30 menit) untuk menghilangkan peroksidase endogenus. Kemudian, dilakukan pencucian dengan air, dibilas dengan aquadestilat, dan PBS masing-masing dua menit. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam larutan trypsin 0,025% dalam PBS (pH.7,4) selama enam menit pada
37oC, dicuci dengan PBS tiga kali (@ dua menit), dimasukkan ke dalam primer antibodi (anti AQP-4 mouse anti Rat) selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali (@ dua menit). Selanjutnya, dimasukkan ke dalam antibodi sekunder yaitu Rabbit antimousebiotinilated label selama 30 menit. Selanjutnya dicuci dengan PBS dua kali (@ dua menit), dan secara berturut-turut dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali (@ dua menit), dimasukkan ke dalam substrat kromogen (DAB solution) selama lima menit, dicuci dengan PBS tiga kali (@ dua menit), dibilas dengan aquadestilata, dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin selama enam menit, dicuci dengan air mengalir, dan akhirnya dilakukan mounting dan dapat diamati pada mikroskop cahaya.
3.2.5 Kerangka Operasional
3.2.6 Identifikasi Variabel Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah Kondisi edema serebri pada hewan coba, hasil penelitian pendahuluan atau penelitian oleh peneliti terdahulu. AKLIMASI HEWAN COBA RANDOMISASI ANALISIS STATISTIK EVALUASI: 1. MDA 2. MPO 3. VEGF 4. AQP-4 KELOMPOK-2 CEDERA KEPALA DIBERI MELATONIN KELOMPOK-0 TIDAK CEDERA KEPALA Normal EVALUASI: 1. MDA 2. MPO 3. VEGF 4. AQP-4 KELOMPOK-1 CEDERA KEPALA KONTROL (-) EVALUASI: 1. MDA 2. MPO 3. VEGF 4. AQP-4
Variabel Kendali
Variabel kendali dalam penelitian ini adalah jenis hewan coba, jenis kelamin, umur, berat badan, model cedera otak, macam obat perlakuan, dosis obat perlakuan, teknik pengambilan dan pemeriksaan sampel.
Variabel Tergantung
Hasil ekspresi MDA, MPO,VEGF dan AQP-4.
3.2.7 Definisi Operasional Penelitian
Cedera kepala adalah jejas atau perlukaan jaringan otak bukan karena proses degeneratif atau bawaan lahir, melainkan akibat dorongan dari luar yang dapat mengakibatkan penurunan ataupun perubahan status kesadaran.
Malondialdehyde adalah molekul oksigen tunggal dan diproduksi berkesinambungan pada keadaan aerobik, diukur dengan Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang pandang, dengan pembesaran 400x, diukur dalam satuan pg/dl dinyatakan dalam skala ratio.
Myeloperoxidase adalah enzim pada jaringan otak memberikan reaksi positif terhadap antimyeloperoxidase, dengan pewarnaan Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang pandang, dengan pembesaran 400x, diukur dalam satuan pg/dl dinyatakan dalam skala ratio.
Vascular Enddothelial Growth Factor adalah jumlah endotel pada jaringan otak yang memberikan reaksi positif terhadap anti VEGF, diukur
dengan cara Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang pandang, dengan pembesaran 400x, dinyatakan dalam skala ordinal berupa skor intensitas warna coklat berupa 0 (negatif), +1 lemah, +2 (sedang dan +3 (kuat). Skor 0 (negatif) dan =1 (lemah) pada penelitian ini menjadi – (negatif), skor +2 (sedang) dan +3 kuat menjadi nilai + (positif).
Aquaporin-4 adalah kadar protein membran integral kecil dengan berat molekul kurang dari 30.000 kDa memiliki permeabilitas tinggi, berperan dalam transportasi cairan di membran plasma sel, dan ditemukan terutama di ventrikel serebral dan ruang subarachnoid, cara ukur dengan Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang pandang, dengan pembesaran 400x, dinyatakan dalam skala ordinal berupa skor intensitas warna coklat berupa 0 (negatif), +1 lemah, +2 (sedang dan +3 (kuat). Skor 0 (negatif) dan =1 (lemah) pada penelitian ini menjadi – (negatif), skor +2 (sedang) dan +3 kuat menjadi nilai + (positif).
Melatonin adalah bahan yang diperoleh dari Sigma Life science Product of China M5250-β50 MG powder,≥ 98% (TLC) Lot # SLBC 75γ9 V P Code : 1001352563 CAS : 73-31-4 C13H16N2O2 MW 232-28, form : powder store at : -20ºC, Solubility : H2O : Soluble 0,1 mg/ml, color : of white, Exp date 2015-05, Address SIGMA-ALDRICH, CO.,3090 Spruce Street, St. Louis. MO 63103 USA 314-771-5765.
3.3 Etika Penelitian
Penelitian ini diajukan untuk mendapat izin dari Komite Etika Penelitian Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
3.4 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di bagian Animal Laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya dari bulan Mei sampai dengan November tahun 2014.
BAB IV