BAB IV METODE PENELITIAN
4.8 Prosedur Penelitian
4.8 Prosedur Penelitian
a. Sebanyak 36 ekor tikus diadaptasi selama satu minggu di dalam kandang, dengan diberi makan dan minum ad libitum.
b. Pada awal penelitian, semua tikus dicukur bulu punggung bagian dorsum medial seukuran 2x4cm.
c. Tikus sebanyak 36 ekor dibagi rata secara acak menjadi dua kelompok yaitu kelompok kontrol yang hanya diberi krim dasar/plasebo kemudian dipapar dengan sinar UV-B, dan kelompok perlakuan yang diberi krim ekstrak biji markisa kemudian dipapar dengan sinar UV-B.
d. Prosedur pembuatan ekstrak biji markisa:
Buah markisa yang didapat dari pasar tradisional di Medan dicuci dengan bersih kemudian dibelah kulitnya. Setelah dibelah, diambil isinya kemudian dipisahkan daging buah dengan bijinya secara manual yaitu dengan penyaringan. Biji markisa tersebut kemudian dicuci bersih dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan tanpa sinar matahari langsung. Setelah kering biji markisa diblender halus menjadi serbuk. Serbuk biji markisa dimasukkan ke dalam tabung kaca dan direndam dengan pelarut etanol 70% selama 1 minggu, kemudian dipekatkan dengan rotary vacuum evaporator Danke dan Kunkel, IKA Labortechnik RV 06-ML dengan suhu 40 derajat celsius,
sehingga diperoleh ekstrak kasar (crude extract).
Ekstrak kasar yang didapatkan berbentuk pelet dan melekat pada labu kaca sehingga perlu diberi sedikit etanol 70% pada dasar labu kaca agar ekstrak sedikit mencair dan mudah dikeluarkan. Ekstrak kasar dipindahkan ke dalam wadah kaca yang lebih kecil kemudian di oven untuk menghilangkan sisa kadar air dan menguapkan sisa etanol selama 15 menit.
Dari 26,9 gram biji kering markisa didapatkan ekstrak kasar sebanyak 7,6 ml. e. Pembuatan Krim Ekstrak biji markisa
Pembuatan krim dilakukan di laboratorium PT Syifa Bioderma, Depok, Jawa Barat dengan formulasi bahan dasar krim:
Carbopol 974P NF sebanyak 0, 25 gram didispersi dalam 22 ml air suling. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 800 rpm selama 1 jam. Gliserol sebanyak 1,25 g ditambahkan kedalam campuran. Campuran dinetralkan dengan penambahan 50% triethanolamin. Pencampuran dilanjutkan sampai krim terbentuk. Krim yang dipersiapkan yaitu krim bahan dasar serta krim ekstrak biji markisa 100%.
f. Krim ekstrak biji markisa diberikan pada kelompok perlakuan secara topikal, dua kali sehari sebanyak sekitar 5-15 menit sebelum pajanan UV-B (untuk memberikan waktu absorpsi bahan topikal ke dalam kulit) dan 4 jam setelah penyinaran (terbentuknya ROS dimulai 4 jam setelah paparan) selama 4 minggu, masing-masing krim dioleskan sebanyak 0,05mg/cm2 luas permukaan kulit tikus .Sedangkan kelompok kontrol hanya mendapat plasebo berupa krim dasar/plasebo dua kali sehari. Pemberian ekstrak maupun plasebo tetap dilakukan pada hari tanpa penyinaran, pada waktu yang sama.
g. Kelompok perlakuan 1 dan kelompok perlakuan 2, diberikan paparan sinar UV-B melalui lampu UV-B buatan China merk KN-4003B, dengan frekuensi tiga kali seminggu selama 4 minggu, dengan dosis pajanan bervariasi setiap minggu yaitu minggu I sebesar 50 mJ/cm2 , minggu II 70 mJ/cm2, minggu III 80 mJ/cm2, minggu IV 80 mJ/cm2. Sehingga total pajanan sinar UV-B yang diterima adalah 840 mJ/cm2, dengan jarak penyinaran 3 cm dan lama penyinaran sekitar 45 menit. Pengukuran dosis pajanan dilakukan menggunakan alat UVmeter (Beltron, Germany).
h. Untuk menghindari efek penyinaran akut, semua tikus dari kedua kelompok didekapitasi kemudian dieksisi jaringan kulit punggung tikus dari kedua
kelompok 24 jam setelah penyinaran terakhir. Kemudian 9 spesimen kulit tersebut dilakukan pemeriksaan ELISA jaringan untuk dihitung kadar MMP-1 dan 9 jaringan kulit tikus lainnya dibuat sediaan histologis untuk pemeriksaan jumlah kolagen, sehingga terkumpul 18 sampel (masing-masing kelompok terdiri dari 9 ekor tikus ) untuk data post test.
i. Prosedur pemeriksaan ELISA jaringan untuk pengukuran kadar MMP-1 (sesuai dengan prosedur yang diberikan dari MyBiosource, USA). Mula-mula kulit dorsum medial tikus diambil sebesar 2x2 cm sampai kedalaman subkutan kemudian dilakukan proses pembuatan sediaan histologis sebagai berikut:
1. Tahap fiksasi
Jaringan kulit tikus direndam dalam larutan formalin buffer fosfat 10% selama 1 hari. Kemudian dilakukan trimming bagian jaringan yang akan diambil.
2. Tahap dehidrasi
Jaringan kulit tikus direndam dengan alkohol bertingkat berturur-turut 70%, 80%, 90%, 96%, ethanol I, etahanol II masing-masing selama 2 jam. 3. Tahap clearing
Jaringan dimasukkan ke dalam clearing agent (toluena I, toluena II) masing-masing selama 2 jam.
4. Tahap embedding
Setelah dilakukan proses infiltrasi sebanyak 2 kali dengan paraffin cair suhu 56-58C, kemudian jaringan ditanam ke dalam parafin cair, dibiarkan membentuk blok selama 1 hari, kemudian disimpan dalam lemari pendingin agar mudah diiris dengan mikrotom.
5. Tahap pemotongan
Proses pemotongan jaringan menggunakan mikrotom, tebal 6μ, secara serial, diambil irisan ke-5, 10, 15 untuk dibuat slide dengan pewarnaan
Sirius red dan imunohistokimia, ditempelkan pada gelas obyek yang sudah
diolesi pelekat, ditetesi aquadest dan dikeringkan. j. Pewarnaan dengan Sirius red.
1) Jaringan yang masih mengandung paraffin dideparafinisasi dan dehidrasi 2) Pewarnaan inti sel dengan Haematoxylin Weigert’s selama 8 menit, dan cuci
sediaan selama 10 menit dengan air mengalir.
3) Kemudian pewarnaan dengan picro-sirius red selama 1 jam untuk memberikan pewarnaan mendekati seimbang di mana penambahan waktu tidak meningkatkan hasil dan waktu yang lebih pendek tidak disarankan meskipun warna terlihat baik.
4) Cuci dengan air asam sebanyak 2 kali.
5) Hilangkan air yang berlebihan secara fisik dengan menggoyang secara perlahan.
6) Dehidrasi dalan ethanol 100% sebanyak 3 kali.
7) Bersihkan dalan cairan xylene dan mounting pada medium yang bersifat asam.
k. Pengamatan hasil.
Jumlah kolagen dihitung dengan metode analisis digital, setiap sediaan preparat difoto dengan menggunakan kamera LC Evolution dan mikroskop Olympus Bx51 dengan pembesaran objektif 40 kali,
masingmasing preparat difoto sebanyak 3 kali disimpan dalam format JPEG.
l. Prosedur penghitungan jumlah kolagen dermis.
Dengan menggunakan piranti lunak Adobe PhotoShop Cs2 versi 9.0, foto preparat tersebut dianalisis jumlah kolagennya yang merupakan persentase kolagen dari seluruh area jaringan. Jaringan kolagen yang tampak berwarna merah terang dipilih dan hasil histogram dari segmentasi gambar kolagen tersebut berupa pixel area kolagen, kemudian hasilnya dicatat. Sedangkan jaringan lain dengan warna yang berbeda kemudian dipilih dan dicatat pixel dari histogramnya. Jumlah kolagen dihitung sebagai persentase pixel area kolagen dibandingkan dengan pixel area seluruh jaringan (pixel area kolagen dijumlahkan dengan pixel area jaringan lain) (Widodo dan Dahlan, 2007).
pixel area kolagen
Jumlah kolagen = X 100%
pixel area seluruh jaringan
m. Pada akhir penelitian tikus dieuthanasia melalui cara di suntik dengan Ketamin 20mg/25g Xylazin 20mg/25g i.m., bila belum mati di tambahkan letal barbiturat (pentotal) i.m. Bila sudah mati, mencit ditempatkan dalam ruang kaca yang tertutup dan transparan. Setelah itu kadaver mencit dikubur..