BAB IV
ANALISIS KUALITATIF PROTEIN
TUJUAN :
Mengetahui prinsip dasar uji kualitatif protein
Mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing metode
A. Pre-lab
1. Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode ninhidrin?
Ninhidrin adalah pereaksi yang digunakan secara luas untuk mengukur asam amino secara kuantitatif. Pereaksi itu bereaksi dengan hampir semua asam amino, menghasilkan senyawa bewarna lembayung (prolina memberikan warna kuning) (Apriandi, 2011).
2. Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode biuret?
Pembentukan kompleks Cu2+ dengan gugus –CO dan –NH dari rantai peptida dalam suasana basa. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet (Hidayatullah, 2012). 3. Mengapa pengujian protein selalu dilakukan pada kondisi alkali/basa?
Sebenarnya protein bersifat amfoter, bisa bereaksi dengan asam atau basa. Namun lebih mudah bereaksi dengan suasana basa, selain itu agar mudah untuk diamati. Dalam uji biuret, supaya ion Cu2+ dari pereaksi biuret (dalam suasana basa) akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan- ikatan peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet (Hidayatullah, 2012).
B. Tinjauan Pustaka 1. Protein
Protein adalah nutrisi dan bagian dari kehidupan yang sangat penting. Protein merupakan komposisi terbesar pembentuk dari tubuh. Protein dibentuk dari rantai panjang asam amino yang berbeda-beda. Protein berfungsi sebagai pembentuk sel-sel di dalam tubuh, membantu pertumbuhan, memperbaharui sel-sel yang lama dan
memperbaiki sel-sel yang telah rusak (Begeman, 2007). 2. Uji Ninhidrin
Terjadinya larutan berwarna biru menunjukkan reaksi positif terhadap adanya asam amino (Apriandi, 2011).
3. Uji Biuret
Protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet. (Apriandi, 2011). 4. Fungsi Reagen
a. Reagen Ninhidrin
b. Reagen Biuret
Reagen Biuret dibuat dari KOH/NaOH dan tembaga(II) sulfat hidrat, bersama dengan kalium natrium tartrat. Kalium natrium tartrat ditambahkan untuk kompleks dan menyetabilkan ion kupri. Reagen berubah dari biru ke ungu dengan adanya protein, biru ke merah jambu (pink) ketika bergabung dengan polipeptida rantai-pendek (Rajvaidya, 2005).
5. Tinjauan Bahan a. Gelatin
Gelatin adalah polipeptida dengan berat molekul tinggi dan hidrokoloid penting yang telah terbukti secara umum dan penggunaannya dalam berbagai makanan untuk meningkatkan elastisitas, konsistensi, dan stabilitas seperti gel. Gelatin berbeda dari hidrokoloid lain karena kebanyakan dari mereka adalah polisakarida, sedangkan gelatin adalah protein yang dapat dicerna dan mengandung semua asam amino esensial kecuali triptofan. Komposisi asam amino khususnya yang berkaitan dengan prolin dan hidroksiprolin dapat bervariasi dari spesies ke spesies, sebagai akibat dari paparan berbagai kondisi lingkungan, khususnya suhu. Gelatin dapat diperoleh tidak hanya dari kulit dan tulang hewan darat, tetapi juga dari ikan dan serangga (Mariod, 2013).
b. Susu skim
Susu skim dibuat ketika semua krim (juga disebut lemak susu) dihapus dari susu. Kadang-kadang, hanya setengah krim dihapus, sehingga susu semi-skim gantinya. Susu skim lebih populer di Amerika Serikat daripada Inggris. Ini mengandung lemak kurang dari susu biasa, yang berarti bahwa banyak ahli gizi dan dokter menyarankan untuk orang-orang yang mencoba untuk menurunkan berat badan atau mempertahankan berat badan yang sehat. Susu skim cenderung memiliki rasa sedikit berair, yang beberapa konsumen tidak menikmati. Susu rendah lemak memiliki tingkat lemak antara 0,5-2% Hal ini juga harus berisi minimal 8,25% padatan-tidak-lemak. Ini harus berisi 2.000 IU vitamin A per liter. Susu skim juga disebut susu non fat (Wolke, 2005).
c. MSG
Monosodium glutamat (MSG) adalah garam natrium (sodium) dari asam glutamat, suatu asam amino yang terdapat dalam semua jenis protein. Glutamat diproduksi melalui fermentasi, suatu proses yang digunakan untuk membuat bir, cuka, kecap kedelai dan yogurt. Prosesnya dimulai dengan bahan alami seperti tetes gula (molasses) dari gula tebu atau gula bit dan pati singkong atau biji-bijian. MSG berfungsi sebagai bahan penyedap dan penambah cita rasa dalam makanan (Husarova, 2013).
d. Aspartam
Aspartam adalah pemanis nutritif yang memasok energi tubuh dalam bentuk kalori. Aspartam seratus hingga dua ratus kali lebih manis daripada sukrosa. Bahan ini terdiri atas kombinasi dua protein, asam aspartat dan fenilalanin (Wolke, 2005).
Disiapkan sejumlah tabung reaksi sesuai dengan jumlah sampel
Diberi label sesuai dengan nama sampel
Dimasukkan tabung reaksi ke dalam air mendidih selama 15-20 detik
Diamati warna larutan
Dicatat hasil pengamatan pada data hasil pengamatan
2. Uji Biuret
Disiapkan sejumlah tabung reaksi sesuai dengan jumlah sampel
Diberi label sesuai dengan nama sampel
Dikocok
Diamati timbulnya warna
Dicatat hasil pengamatan pada data hasil pengamatan
D. Data Hasil Percobaan Dan Pengamatan : 1. Uji Ninhidrin
a. Tuliskan data hasil uji Ninhidrin
No. Sampel Sebelum Pemanasan Sesudah Pemanasan Hasil uji
Tabung reaksi
2 ml larutan ninhidrin 2 ml sampel
Hasil
Tabung reaksi
1 ml NaOH 10% 3 ml sampel
3 tetes larutan CuSO4 0,1%
1 Susu Skim Putih Ungu +
2 MSG Ungu Ungu Tua +
3 Aspartam Putih, Mengendap Ungu Tua +
4 Gelatin Keruh, Bening Keruh, Bening
-b. Bahas dan bandingkan data-data hasil uji Ninhidrin dari beberapa sampel dalam percobaan ini!
Tujuan dari uji ninhidrin adalah untuk mengetahui jumlah asam bebas pada suatu sampel. Prinsipnya adalah menguji tada tidaknya protein dalam suatu senyawa dengan penambahan reagen ninhidrin untuk mengetahui jumlah kadar asam amino bebas yang terkandung didalamnya dimana asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk senyawa kompleks warna ungu. Pemanasan dalam reaksi ini bertujuan untuk mempercepat reaksi yang terjadi.
Reaksi atau mekanisme yang terjadi adalah reaksi yang memicu terjadinya warna biru pekat atau ungu adalah proses reduksi reagen ninhidrin oleh asam α-amino. Asam α-amino akan terpecah karena adanya reduksi dari asam amino dan terbentuklah ninhidrin tereduksi, aldehid dan NH3 disertai dengan terlepaskannya gas CO2. Selanjutnya terjadi reaksi antara
ninhidrin tereduksi dengan amonia sehingga akan terjadi proses kondensasi yang melepaskan molekul H2O dan menghasilkan garam diketo–hyrilhalide–diketo–hydramine
berwarna ungu.
(Petsko, 2005) Analisa prosedur
dibutuhkan adalah reagen ninhidrin, larutan susu skim (10%), monosodium glutamate (5%), gelatin (5%), dan aspartame.
Setelah semua alat dan bahan siap, kemudian melabeli alat yang digunakan seperti tabung reaksi dan pipet ukur sesuai dengan nama sampel yang diujikan supaya tidak tertukar dan/atau tercampur antara sampel yang satu dengan sampel lainnya. Setelah pelabelan, kemudian dilanjutkan dengan mengambil 2 ml sampel menggunakan masing-masing pipet ukur dan dimasukkan kedalam tabung reaksi sesuai dengan label namanya. Sebelum mengambil, sampel sebaiknya dikocok atau dihomogenkan kembali supaya larut secara merata dan tidak terdapat endapan yang dapat mempengaruhi hasil percobaan, khusus untuk susu skim diambil dengan menggunakan gelas ukur 10 ml karena apabila diambil dengan menggunakan pipet ukur dapat menyumbat saluran pipet ukur dan mengakibatkan kerusakan. Setelah sampel diambil dan dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2 ml larutan ninhidrin. Diamati perubahan warna yang terjadi sebelum pemanasan kemudian hasilnya dicatat. Setelah dicatat kemudian dimasukkan ke dalam penangas air atau gelas beker yang berisi air mendidih selama 15-20 detik. Kembali mengamati perubahan warna yang terjadi dan mencatat hasilya pada data hasil pengamatan. Sampel yang berubah warna menjadi berwarna ungu menandakan bahwa terdapat kandungan asam amino bebas didalamnya (uji positif), sementara yang tidak berubah warna atau tetap maka uji negatif dengan kata lain tidak terdapat kandungan asam amino bebas.
Ninhidrin berfungsi sebagai pereaksi yang digunakan untuk menguji kandungan asam amino bebas didalam sampel.
Analisa Hasil
Sampel pertama berupa susu skim, berwarna putih saat ditambahkan reagen ninhidrin sebelum dipanaskan. Setelah dilakukan pemanasan, warna sampel berubah menjadi berwarna ungu yang menandakan bahwa terjadi reduksi reagen ninhidrin oleh asam α-amino. Reaksi uji sampel pertama positif yang menandakan adanya kandungan asam amino bebas didalamnya.
Sampel kedua berupa MSG, langsung berwarna ungu saat ditambahkan reagen ninhidrin sebelum dipanaskan. Setelah dilakukan pemanasan, warna sampel berubah menjadi berwarna ungu tua yang menandakan bahwa terjadi reduksi reagen ninhidrin oleh asam α-amino. Reaksi uji sampel kedua positif yang menandakan adanya kandungan asam amino bebas didalamnya.
Sampel ketiga berupa aspartam, berwarna putih dan terdapat endapan dibawah tabung reaksi saat ditambahkan reagen ninhidrin sebelum dipanaskan. Setelah dilakukan pemanasan, warna sampel berubah menjadi berwarna ungu yang menandakan bahwa terjadi reduksi reagen ninhidrin oleh asam α-amino. Reaksi uji sampel ketiga positif yang menandakan adanya kandungan asam amino bebas didalamnya.
2. Uji Biuret
a. Tuliskan data hasil uji Biuret
No. Sampel Sebelum ditambah reagen (Sampel + NaOH)
Sesudah ditambah reagen
(Sampel + NaOH + CuSO4) Hasil uji
1 Susu skim Bening keruh Keruh
-2 MSG Bening Bening
-3 Gelatin Bening Kekuningan Ungu pada permukaan +
4 Aspartam Bening Bening
-b. Bahas dan bandingkan data-data hasil uji Biuret dari beberapa sampel dalam percobaan ini! Tujuan dari uji Biuret adalah untuk mengetahui ada tidaknya protein didalam senyawa berdasarkan ikatan peptida. Prinsip dari uji Biuret adalah menguji ada tidaknya protein dalam suatu senyawa dengan penambahan NaOH dan CuSO4 berdasarkan ada tidaknya
ikatan peptida dengan Cu2+ didalam suasana basa akan bereaksi dengan ikatan-ikatan
peptida yang menyusun protein dan membentuk senyawa kompleks ungu. Reaksi ini beraksi positif terhadap dua buah atau lebih ikatan peptida tetapi negati terhadap asam amino bebas.
(Petsko, 2005)
Analisa Prosedur
Pertama mempersiapkan alat dan bahan yang digunakan dalam percobaan, antara lain empat tabung reaksi, kertas label, labu penghisap atau bulb, empat pipet ukur 1 ml, pipet volume 10 ml, pipet tetes, gelas ukur 10 ml dan rak tabung reaksi, kemudian bahan yang dibutuhkan adalah reagen Biuret (CuSO4), larutan NaoH, larutan susu skim (10%),
monosodium glutamate (5%), gelatin (5%), dan aspartame.
khusus untuk susu skim diambil dengan menggunakan gelas ukur 10 ml karena apabila diambil dengan menggunakan pipet ukur dapat menyumbat saluran pipet ukur dan mengakibatkan kerusakan. Setelah sampel diambil dan dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi, kemudian ditambahkan 1 ml NaOH 10% dan dikocok. Diamati perubahan warna yang terjadi sebelum ditambahkan reagen biuret kemudian dicatat hasilnya. Selanjutnya ditambahkan 1 sampai 3 tetes larutan CuSO4 0,1% dan kembali
mengamati perubahan warna yang terjadi serta mencatatnya. Sampel yang berubah warna menjadi berwarna ungu menandakan bahwa terdapat kandungan ikatan peptida lebih dari dua didalamnya (uji positif), sementara yang tidak berubah warna atau tetap maka uji negatif dengan kata lain tidak terdapat kandungan ikatan peptida.
NaOH pada percobaan ini berfungsi untuk menciptakan suasana basa sementara CuSO4 atau reagen biuret digunakan membentuk senyawa kompleks ungu.
Analisa Hasil
Pada percobaan Uji Biuret kali ini, ternyata setiap sampel memiliki reaksi yang berbeda-beda terhadap reagen biuret (CuSO4). Pada sampel susu skim tidak menghasilkan warna ungu bening yang berarti hasil uji negatif (-), pada susu skim seharusnya mengandung ikatan peptida (Rosenberg, 2006), namun pada percobaan ini tidak menunjukan hal tersebut ditandai dengan terbentuknya cincin ungu pada permukaan, ini dapat terjadi karena kurangnya CuSO4 yang diteteskan pada sampel atau protein pada
sampel telah rusak oleh denaturasi. Pada sampel MSG menghasilkan warna biru bening yang berarti memiliki hasil uji negatif (-) yaitu MSG tidak mengandung ikatan peptida pada sampel protein. Pada sampel aspartam menghasilkan warna biru bening yang berarti memiliki hasil uji negatif (-) yaitu aspartam tidak mengandung ikatan peptida pada sampel protein. Pada sampel gelatin menghasilkan warna ungu kemerahan yang berarti memiliki hasil uji positif (+) yaitu gelatin mengandung ikatan peptida pada sampel protein (Rosenberg, 2006).
PERTANYAAN
Dengan memasukkan reagen ninhidrin pada sampel, karena asam amino akan bereaksi dengan ninhidrin dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Sehingga indikasi adanya asam amino ditunjukkan oleh perubahan warna sampel pada saat sesudah direaksikan dan dipanaskan, yakni apabila ia mengandung asam amino makan akan berwarna ungu. Namun ada juga yang tanpa dipanaskan sudah menghasilkan warna ungu, misalnya MSG (Dyah, 2011).
2. Bagaimana reaksi yang terjadi antara sampel dengan reagen pada uji Biuret?
Pada prinsip kerja biuret, yaitu menguji ada atau tidak adanya protein dalam suatu senyawa dengan penambahan reagen NaOH dan CuSO4 berdasarkan ada atau tidaknya
ikatan peptida (ikatan peptida harus 2 atau lebih). Dimana ion Cu2+ (dari pereaksi biuret)
dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida yang menyusun protein dan membentuk senyawa kompleks berwarna biru hingga ungu. Setelah direaksikan dengan sampel, warna yang terbentuk mudah pudar, hal ini dikarenakan ion Cu2+ mengikat 2 ikatan peptida dan jika lama dibiarkan ikatan tersebut semakin lemah (tidak stabil) sehingga itu yang menyebabkan warnanya jika dibiarkan lama akan memudar (Agustin, 2010).
Tujuan dari praktikum uji kualitatif protein adalah pertama untuk mengetahui prinsip dasar uji kualitatif protein dan yang ke dua untuk mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing metode.
Prinsip Uji Ninhidrin adalah menguji ada tidaknya asam α amino bebas pada sampel protein dengan mereaksikannnya dengan reagen ninhidrin sehingga membentuk senyawa kompleks bewarna ungu. Reaksi yang terjadi pada uji ninhidrin terhadap sampel adalah reagen ninhidrin dengan asam α amino bebas membentuk senyawa kompleks bewarna ungu karena asam α amino mereduksi reagen ninhidrin. Mekanisme Uji Ninhidrin adalah ninhidrin bereaksi dengan asam amino sampel dan akan tereduksi, kemudian melepas oksigen sehingga menghasilkan ninhidrin tereduksi CO2, NH3, dan aldehid. Sisa dari ninhidrin akan bereaksi
dengan amonia dan ninhidrin tereduksi membentuk senyawa kompleks bewarna ungu (garam diketohyrilhalide) dan (diketohydramine). Prinsip Uji Biuret adalah menguji ada tidaknya ikatan peptida pada suatu sampel protein. Caranya mereaksikannya dengan CuSO4 (reagen
biuret) dalam suasana basa. Reaksi yang terjadi adalah ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein bereaksi dengan CuSO4 (Cu2+) dan dibantu NaOH sebagai alkalis akan membentuk
senyawa kompleks bewarna ungu. Mekanisme Uji Biuret adalah uji ini didasarkan pada pembentukan kompleks Cu2+ yang dihasilkan dari CuSO
4 dengan gugus CO dan NH pada
ikatan peptida sampel dalam suasana basa, sehingga menghasilkan senyawa kompleks bewarna ungu.
Hasil dari percobaan uji kualitatif protein pada Uji Ninhidrin yaitu positif mengandung asam α amino bebas jika berubah warna menjadi bewarna ungu terdapat tiga sampel yaitu MSG, Susu skim dan gelatin positif mengandung asam α amino bebas pada sampel protein. Tetapi tidak dengan aspartam yag menunjukan hasil negatif atau tidak mengandung asam α amino bebas pada sampel protein. Pada Uji Biuret bereaksi positif jika terjadi perubahan warna menjadi warna ungu terdapat satu sampel yaitu gelatin positif mengandung ikatan peptida pada sampel protein. Tetapi tidak dengan MSG, susu skim dan aspartam yang menunjukan hasil negatif atau tidak mengandung ikatan peptida pada sampel protein.
Apriandi, Azmin. 2011. Aktivitas Antioksidan dan Kompone Bioaktif Keong Ipong-Ipong (Fasciolaria Salmo). Bogor: Institut Pertanian Bogor
Begeman, Gale S. 2007. Got Protein?. Arizona: The University of Arizona
Hidayatullah, Fatih. 2012. Analisa Asam Amino pada Buah Pepaya dengan Spektrofotometer.
Semarang: Universitas Diponegoro
Husarova, Veronika. 2013. Monosodium Glutamate Toxic Effects and Their
Implications for Human Intake: A Review. Bratislava: Comenius University
Mariod, Abdalbasit A., Hadia F. A. 2013. Review: gelatin, source, extraction and industrial applications. Al-Kamil: King Abdulaziz University
Rajvaidya, Neelima. 2005. Microbiology. New Delhi: APH Publishing Corporation
Wolke, Robert L. 2005. Kalo Enstein Jadi Koki Sains di Balik Urusan Dapur. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama
DAFTAR PUSTAKA TAMBAHAN
Agustini, Ni Putu. 2010. Ilmu Kimia Pangan. Denpasar: Universitas Pendidikan Nasional Dyah, Roro. 2011. Reaksi Uji Protein. Makasar : Universitas Hassanudin
