KARAKTERISASI BIOKIMIA DAN AMOBILISASI GLUKOSA
OKSIDASE DARI ASPERGILLUS NIGER IPBCC.08.610 PADA
ELEKTRODA PASTA KARBON TERMODIFIKASI
TITI ROHMAYANTI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Karakterisasi Biokimia dan Amobilisasi Glukosa Oksidase dari Aspergillus niger IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
RINGKASAN
TITI ROHMAYANTI. Karakterisasi Biokimia dan Amobilisasi Glukosa Oksidase dari Aspergillus niger IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan AKHIRUDDIN MADDU.
Penggunaan enzim saat ini sangat luas diberbagai bidang, seperti bidang pangan, kesehatan, pertanian, maupun energi namun, Indonesia masih menjadi pengimpor enzim terbesar. Salah satu enzim yang banyak digunakan adalah glukosa oksidase (GOD). GOD merupakan enzim yang mengatalisis oksidasi dari β -D-glukosa menjadi D-glukono- -lakton dan hidrogen peroksida menggunakan molekul oksigen sebagai penerima elektron. GOD pada penelitian ini diproduksi langsung dari isolat lokal Aspergillus niger yang diisolasi dari tanaman pagar Dryobalanops di daerah Tarakan, Kalimantan Utara. Aplikasi dari GOD ke permukaan elektroda membutuhkan sistem amobilisasi. Proses amobilisasi enzim yang tepat dianggap dapat meningkatkan kinerja elektroda. Amobilisasi GOD ke nanofiber-polianilin pada permukaan elektroda pasta karbon diduga dapat meningkatkan konduktansi elektroda.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan karakteristik kinetika aktivitas GOD hasil pemurnian (NH4)2SO4 80% jenuh dan hasil amobilisasi GOD pada elektroda pasta karbon termodifikasi (EPKT) nanofiber polianilin. Penilitian ini terdiri atas sembilan tahap yakni: (1) Produksi dan isolasi GOD dari A.niger IPBCC.08.610; (2) Pemurnian GOD dengan (NH4)2SO4 80% jenuh; (3) Uji aktivitas GOD; (4) Kinetika GOD hasil pemurnian; (5) Optimasi ukuran diameter tembaga Elektroda Pasta Karbon (EPK); (6) Pengukuran voltamogram siklik elektroda pasta karbon (EPK) dan elektroda pasta karbon termodifikasi (EPKT); (7) Amobilisasi GOD pada EPKT; (8) Pengukuran voltamogram siklik EPKT teramobilisasi dan GOD yang tidak diamobilisasi; dan (9) Kinetika GOD teramobilisasi pada EPKT.
Hasil penelitian diperoleh GOD dengan aktivitas tertinggi dihasilkan secara intraseluler oleh A.niger. Ekstrak kasar GOD intraseluler kemudian dimurnikan dengan pengendapan (NH4)2SO4 80% jenuh dan menghasilkan aktivitas spesifik sebesar 27.77 U/mg. Tingkat kemurnian yang dihasilkan mencapai 20.22 kali dari ekstrak kasarnya dengan yield sebesar 72.86%. Tembaga dengan diameter 3 mm memiliki nilai knduktansi yang lebih baik. Nanofiber polianilin meningkatkan konduktansi EPK sehingga lebih baik digunakan sebagai media amobilisasi glukosa oksidase. Metode amobilisasi dengan penambahan glutaraldehida sebagai agen pengikat silang GOD, dapat meningkatkan kinerja GODamo-IPB|EPKT. Karakteristik kinetika GOD yang teramobil pada elektroda dapat menurunkan nilai Km (3.1 mM) dan Imax yang dihasilkan besar (3.689 mA), sensitivitas yang tinggi 1.09 mA/mM dan range konsentrasi glukosa sebesar 0.2-2 mM. Range konsentrasi glukosa ini dapat digunakan dalam mendeteksi kadar glukosa dalam darah yakni sebesar 56.4 mg/dL selain itu, range ini juga dapat diaplikasikan dalam mendeteksi glukosa pada buah peach (0.9 mM). GODamo-IPB|EPKT pada penelitian ini berpotensi untuk dijadikan biosensor glukosa.
SUMMARY
TITI ROHMAYANTI.Biochemistry Characterization and Immobilization Glukosa Oxidase from Aspergillus niger IPBCC.08.610 Onto Modified Carbon Paste Electrode. Supervised by LAKSMI AMBARSARI and AKHIRUDDIN MADDU.
Enzyme production based on microorganism is one of progressive step in many fields such as food, agriculture, health and energy. One of widely used enzyme is glucose oxidase (GOx). GOx is an enzyme that catalyze the oxidation of
β-D-glucose into D-gluconolactone and hydrogen peroxide. Nowadays, GOx was generally applied to biosensor and other commercial applications. In this research, GOx was produced directly from local Aspergillus niger which was isolated from local vine Dryobalanops in Tarakan, East Borneo, Indonesia. GOx is very interesting to be utilized as an electron transfer agent in biosensor because it has specific substrate with high specificity. Glucose utilization as a substrate is very convenient because glucose is abundant and sound. GOx application onto electrode in biosensor system needs immobilization process. The immobilization process of appropriate enzyme can elevate electrode performance. GOx immobilization into polyaniline-nanofiber at carbon pasta electrode surface is presumably to rise electrode conductance in biosensor. Nanometer-sized polyaniline widens electrode surface so that its application may be more economically efficient.
The aim this research is to analyze biochemistry characteristic of GOx to apply as glucose biosensor This research has seven objectives that include the following: (1) GOx production and isolation from A.niger IPBCC.08.610; (2) GOx purification using saturated (NH4)2SO4 80%; (3) GOx activity assay; (4) Enzyme kinetics equation; (5) Optimation of diameter size carbon paste electrode (CPE); (6) Measurement of CPE and modified carbon paste electrode (MCPE) cyclic voltamogram; (7) Immobilization of GOx into MCPE; (8) Measurement of MCPE-immobalization GOx and MCPE-unimmobalized GOx cyclic voltamogram performance; and (9) Immobilized GOx kinetics in MCPE.
GOx had purity level of 20.22 times of crude extract. Polyaniline-nanofiber evolved CPE conductance, affectes itself as a better glucose oxidase immobilization media. Enzyme immobilization was done by adding glutaraldehyde as the cross-linker agent of GOD, increased IPB|MCPE performance. GODimmo-IPB|MCPE is potential to be developed as glucosa biosensor because it possessed enough high Km, Imax, sensitivity, and glucose concentration range, those were respectively 2.86 mM, 3.8 mA, 1.09 mA/mM and 0.2-4 mM.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
KARAKTERISASI BIOKIMIA DAN AMOBILISASI GLUKOSA
OKSIDASE DARI ASPERGILLUS NIGER IPBCC.08.610 PADA
ELEKTRODA PASTA KARBON TERMODIFIKASI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2016
Judul Tesis : Karakterisasi Biokimia dan Amobilisasi Glukosa Oksidase dari Aspergillus niger IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon Termodiikasi
Nama NIM
: Titi Rohmayanti : 0851140111
Disetu
j
ui olehKomisi Pembimbing
� ·
Dr Laksmi Ambarsari, MS Ketua
Ketua Program Studi Biokimia
Tanggal U
j
ian: 19 Agustus 2016Diketahui oleh
Dr Akh
�
din Maddu, MSi AnggotaTanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillah, puji syukur penulis ucapakan ke hadirat Allah SWT yang selalu melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis bisa menyelesaikan tesis yang berjudul “Karakterisasi Biokimia dan Amoblisasi Glukosa Oksidase dari Aspergillus niger IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi”.
Penelitian ini dilakukan semata-mata berdasarkan pada firman Allah, yang artinya: “Katakanlah: “Perhatikanlah apa yang ada di langit dan di bumi. Tidaklah bermanfaat tanda-tanda kekuasaan Allah dan Rasul-rasul yang memberi peringatan bagi orang-orang yang tidak beriman” (QS. 10:101). Kata ‘Perhatikanlah’ dapat ditafsirkan sebagai ‘Lakukanlah Penelitian’. Ini merupakan suatu kalimat perintah dari Allah untuk melakukan penelitian di berbagai disiplin ilmu pengetahuan, terhadap apa yang ada dan terjadi dari alam raya sampai pada dasar bumi. Jika hal ini tidak dilakukan, maka tanda-tanda kebesaran Allah Rabbul ‘Alamin dan Rasul-Rasul-Nya yang memberi peringatan tidak akan bermanfaat bagi manusia, yaitu bagi orang-orang yang tidak mempergunakan akal dan pikirannya dan keyakinan akan kebesaran agama Islam.
Atas selesainya penlitian dan penyusunan tesis ini, Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Laksmi Ambarsari, MS dan Dr Akhiruddin Maddu, MSi yang telah memberikan bimbingan, arahan, kritik, dan sarannya selama penelitian dan penulisan tesis ini. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada orang tua tercinta dan keluarga atas doa-doa yang telah terlantunkan. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada seluruh dosen dan staf Program Studi Biokimia, staf laboratorium cendawan departemen Proteksi Tanaman, staf Bengkel Biofisika, dan staf Laboratorium Bersama departemen Kimia yang telah membantu dalam hal berdiskusi dan pengarahan selama penelitian serta teman-teman yang turut memberikan bantuan, dukungan, motivasi, dan semangat selama penelitian dan penulisan tesis.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan laporan penelitian ini, maka diharapkan kritik dan saran yang membangun untuk perbaikan dalam penulisan selanjutnya. Akhir kata penulis berharap tulisan ini dapat bermanfaat dan menjadi sumbangan pemikiran bagi pihak yang membutuhkan.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL xii
DAFTAR GAMBAR xii
DAFTAR LAMPIRAN xii
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
Hipotesis Penelitian 3
2 METODE 3
Waktu dan Tempat Penelitian 3
Alat dan Bahan 4
Prosedur Penelitian 4
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 8
Hasil 8
Pembahasan 14
5 SIMPULAN DAN SARAN 25
Simpulan 25
Saran 24
DAFTAR PUSTAKA 25
LAMPIRAN 29
DAFTAR TABEL
1 Jumlah Protein dan Aktivitas GOD 8
2 Parameter Kinetika GOD 9
3 Arus Oksidasi Puncak EPK Variasi Diameter Tembaga 10
4 Arus Oksidasi Puncak EPK dan EPKT 11
5 Arus Oksidasi Puncak Anoda GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT 12
6 Parameter Kinetika GODamo-IPB|EPKT 14
DAFTAR GAMBAR
1 Penentuan Kecepatan Awal Reaksi 8
2 Kurva Lineweaver-Burk 9
3 Voltamogram Siklik Kinerja EPK Variasi Diameter Tembaga 10
4 Voltamogram Siklik Kinerja EPK dan EPKT 11
5 Voltamogram Siklik Kinerja GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT 12 6 Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Arus GODIPB|EPKT dan
GODamo-IPB|EPKT 13
7 Kurva Lineweaver-Burk GODamo-IPB|EPKT 14
8 Stabilitas GODamo-IPB|EPKT 14
9 Pembentukan Kompleks Polianilin-Glutaraldehid-GOD secara
Kovalen 21
DAFTAR LAMPIRAN
1 Bagan Alir Penelitian 29
2 Kurva Standar Glukosa dan Contoh Perhitungan kadar protein 30 3 Contoh perhitungan aktivitas GOD pengendapan amonium sulat 80% 31
4 Kinetika GOD raksi am sulat 32
5 Voltamogram siklik pengulangan EPK dan EPKT 33 6 Voltamogram siklik pengulangan GODIPB|EPKT 34
7 Kinetika GODamo-IPB|EPKT 35
8 Miselium A.niger, GOD ekstrak kasar, dan GOD 35
9 Elektroda pasta karbon 35
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam Indonesia masih perlu dioptimalisasi agar dapat dijadikan objek penelitian yang sangat potensial. Produksi berbagai macam enzim menggunakan mikroorganisme merupakan salah satu hal yang dapat dikembangkan. Penggunaan enzim saat ini sangat luas diberbagai bidang, seperti bidang pangan, kesehatan, pertanian, maupun energi. Ironisnya, sampai saat ini Indonesia belum dapat memproduksi sendiri dan sepenuhnya masih bergantung pada produk impor (Saryono 2008). Salah satu enzim yang banyak digunakan dan dijual secara komersil adalah glukosa oksidase (GOD).
GOD merupakan enzim yang mengatalisis oksidasi dari β-D-glukosa menjadi D-glukono- -lakton dan hidrogen peroksida menggunakan molekul oksigen sebagai penerima elektron. D-glukono- -lakton lalu terhidrolisis secara non-enzimatis menjadi asam glukonat dan FADH2-enzim yang tereduksi dioksidasi kembali oleh molekul oksigen (Sabir et al. 2007). Enzim ini banyak digunakan dalam industri untuk produksi asam glukonat dan sumber hidrogen peroksida dalam pengawetan makanan (Ahmad et al. 2007). Selain itu, enzim ini juga digunakan dalam biomedis untuk penentuan kadar glukosa darah. Penetapan kadar glukosa darah menggunakan GOD baik secara kolorimetri maupun amperometri lebih unggul dibandingkan dengan metode non-enzimatik lainnya karena GOD memiliki spesifitas substrat yang tinggi terhadap β-D-glukosa (Ahmad et al. 2007). GOD juga memiliki bilangan putaran dan kestabilan yang tinggi (Sherbenny et al. 2005). Penggunaan GOD saat ini dikembangkan juga dalam aplikasi enzymatic fuel cell (EFC) (Sabir et al. 2007). EFC merupakan salah satu jenis dari sel biofuel yang menggunakan enzim sebagai biokatalis yang dapat mengubah energi biokimia menjadi energi listrik secara langsung.
Nithiyaa et al. (2012) menemukan bahwa Aspergillus niger merupakan sumber GOD yang paling baik karena enzim yang dihasilkan bersifat sangat stabil. Penelitian Putri (2011) melaporkan bahwa isolat lokal A. niger IPBCC.08.610 berpotensi menghasilkan GOD. Berdasarkan Triana (2012) GOD yang dihasilkan dari A. niger IPBCC.08.610 memiliki aktivitas total sebesar 92.87 U yang terendapkan dengan baik pada (NH4)2SO4 80% jenuh dan konsentrasi substrat untuk mencapai kecepatan maksimum (Km) sebesar 46 mM dengan laju maksimum (vmaks) 11 U/mg. Selain itu, pada penelitian Selena (2014) aktivitas total GOD yang diproduksi dari isolat lokal A. niger setelah dilakukan pemurnian dengan kromatografi kolom filtrasi gel sebesar 126.41 U dengan nilai Km sebesar 39 mM.
GOD yang diproduksi langsung dari isolat lokal A.niger IPBCC.08.610 koleksi Departemen Biologi IPB yang diisolasi dari serasah tanaman pagar Dryobalanops di daerah Tarakan, Kalimantan Utara ini belum dikarakterisasi dan diaplikasikan lebih lanjut pada elektroda.
2
penggunaan GOD sering dikombinasikan dengan senyawa mediator pada elektroda. Pasta karbon yang dimodifikasi oleh nanofiber-polianilin digunakan dalam penelitian ini sebagai mediator. Karbon dianggap memiliki biokompatibilitas, stabilitas, dan konduktifitas (tidak korosif) yang baik sehingga tidak mempengaruhi kinerja biologis (Surianty 2014). Polianilin merupakan bahan umum yang digunakan dalam pembuatan elektroda pada biosensor, biofuel sel, dan aplikasi super kapasitor dalam bentuk nano komposit. Berdasarkan Maddu et al. (2008), nanofiber-polianilin disintesis dalam bentuk garam emeraldin dengan metode interfasial polimerisasi. Penambahan polianilin ke dalam pasta karbon bertujuan untuk menangkal ruang kosong antara partikel grafit sehingga dapat meningkatkan konduktifitas listrik pada elektroda karena elektron akan ditransfer secara terus menerus. Amobilisasi GOD ke nanofiber-polianilin pada permukaan elektroda pasta karbon dapat digunakan sebagai bioanoda dalam aplikasi biofuel sel. GOD akan bergerak ke permukaan elektroda menggunakan glutaraldehid sebagai penghubung (Ambarsari et al. 2016).
Perumusan Masalah
Saat ini kebutuhan GOD semakin meningkat sehubungan dengan pemanfaatannya sebagai biosensor glukosa dan bioanoda dalam biofuel sel. Ironisnya Indonesia masih mengimpor enzim tersebut. Padahal iklim tropis dengan tingkat kelembaban tinggi sangat mendukung pertumbuhan A. niger yang merupakan sumber yang paling baik dalam menghasilkan GOD. Selain itu, karakteristik biokimia GOD dari A. niger IPBCC.08.610 dan amobilisasinya pada elektroda pasta karbon termodifikasi belum diketahui dan dianalisis untuk dapat diaplikasikan lebih lanjut.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian adalah untuk mendapatkan karakteristik biokimia GOD hasil pengendapan (NH4)2SO4 80% jenuh yang dibandingkan dengan GOD hasil amobilisasi menggunakan glutaraldehida pada elektroda pasta karbon termodifikasi nanoserat polianilin.
Manfaat Penelitian
Melalui penelitian ini, diharapkan dapat memberikan informasi mengenai karakteristik biokimia glukosa oksidase dari A. niger IPBCC.08.610 dan amobilisasinya pada elektroda pasta karbon termodifikasi sehingga dapat dijadikan panduan dalam aplikasi GOD pada biosensor glukosa.
Hipotesis
3
2
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini berlangsung selama 9 bulan (September 2015 - Juni 2016). Adapun tempat penelitian dilaksanakan di Laboratorium Penelitian Biokimia FMIPA, Laboratorium Cendawan Departemen Proteksi Tanaman FAPERTA, Laboratorium bersama Departemen Kimia FMIPA, dan Bengkel Departemen Fisika FMIPA.
Alat dan Bahan
Alat
Pengukuran voltamogram siklik menggunakan potensiostat eDAQ EA163 yang dilengkapi program EChem v2.1.0, elektroda Ag|AgCl, dan elektroda Pt|Ti. Peralatan lainnya antara lain alat-alat gelas, laminar air flow, neraca analatik, tabung sentrifus, sentrifus (Beckman USA Mode J2-21), pipa kapiler, kawat tembaga, pipet mikro, pipet volumetrik, mortar, pH meter (HANNA pH 21 pH/Mv meter), penangas dan stirrer, autoklaf TOMY High Pressure Steam Sterilizer ES-315, microplate COSTAR 96 , serta SPEKTROstar®Nano BMG LABTECH.
Bahan
Biakan isolat Aspergillus niger (IPBCC 08.610) koleksi Departemen Biologi IPB yang diisolasi dari tanaman pagar di daerah Tarakan, Kalimantan Utara, nanofiber-polianilin, glutaraldehida 2.5%, karbon grafit, orto-dianisidin dan hidrogen peroksida (H2O2). Bahan-bahan lainnya terdiri atas media Potato Dextrose Agar (PDA), sukrosa, pepton, (NH4)2HPO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, CaCO3, (NH4)2SO4 (ammonium sulfat), glukosa, pasir kuarsa, akuades steril, bufer (natrium fosfat 0.1 M pH 6.0; fosfat sitrat 0.1 M pH 5.6; kalium fosfat 0.1 M pH 7.0, asetat 0.1 M pH 4.5), reagen Bradford, standar Bovine Serum Albumin (BSA), akuabides, parafin, serbuk grafit, KCl 0.1 M, dan kalium ferisianida (Fe(CN)6), pipa kapiler dan tembaga elektroda berdiameter 1 mm dan 3 mm.
Prosedur Penelitian
Produksi GOD (Modifikasi Singh dan Verma 2010)
4
Erlenmeyer 1 L disiapkan dan masing-masing diisi dengan 180 mL media produksi. Setiap media disterilisasi dalam autoklaf 1210C selama 15 menit.
Sebanyak satu ose spora A. niger dipindahkan ke dalam agar-agar miring PDA dengan metode cawan gores. Kemudian, agar-agar miring diinkubasi dalam suhu ruang selama 3 hari. Spora dari stok media agar-agar miring isolat A. niger sebanyak satu ose ditumbuhkan dalam media starter lalu diinkubasi pada suhu 300C dengan kecepatan 120 rpm selama 24 jam. Selanjutnya subkultur tersebut dimasukkan sebanyak 10% dari volume media produksi. Kemudian diinkubasi pada suhu 300C kecepatan 120 rpm selama 40 jam. Setelah inkubasi, biakan berupa miselium dipisahkan dari media pertumbuhan dengan cara disaring menggunakan kain kasa. Hasil saringan berupa supernatan merupakan GOD ekstrak kasar ekstraseluler. Berat miselium yang dihasilkan ditimbang dan digunakan untuk tahap isolasi.
Isolasi GOD dari A. niger (Modifikasi Firman dan Aryantha 2003)
Enzim dalam sel diisolasi dengan cara penggerusan menggunakan mortar steril dalam suhu 40C. Miselium hasil penyaringan digerus sampai halus menggunakan pasir kuarsa dengan perbandingan 1:1. Sel yang telah lisis ditambahkan dengan bufer natrium fosfat 0.1 M pH 6.0, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 g suhu 40C selama 20 menit. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar GOD intraseluler. Ekstrak kasar diukur kadar protein dan aktivitasnya lalu dilakukan tahap pemurnian dengan amonium sulfat.
Pemurnian GOD (Modifikasi Sherbeny et al. 2005)
Pemurnian GOD dilakukan melalui pengendapan dengan (NH4)2SO4 80% jenuh. Larutan dihomogenisasi kemudian didiamkan selama semalam pada suhu 4oC, kemudian disentrifus pada kecepatan 12000 g dengan suhu 4oC selama 20 menit. Fraksi yang terendapkan dilarutkan dalam 1 mL bufer fosfat sitrat 0.1 M pH 5.6. Setiap fraksi yang diperoleh diukur kadar protein dan aktivitasnya.
Uji Aktivitas Glukosa Oksidase (Modifikasi Bergmeyer 1988)
Pereaksi pada pengujian aktivitas enzim terdiri atas 33.3 µL larutan glukosa 10% (b/v) yang didiamkan selama 1 jam setelah pembuatan agar terjadi mutarotasi, 160 µL o-dianisidin (6.6 mg o-dianisidin dalam 100 mL bufer kalium fosfat 0.1 M pH 7), dan 20 µL hidrogen peroksidase 1 mg/mL dicampurkan dalam microplate. Larutan diaduk selama 10 detik kemudian dibiarkan setimbang pada suhu ruang. Nilai absorbannya diukur pada panjang gelombang 436 nm sebagai A0 hingga stabil. Setelah itu, ditambahkan 20 µL GOD pada campuran dan diukur peningkatan nilai absorbannya setiap 30 detik selama 5 menit pertama pada panjang gelombang 436 nm sebagai At. Laju awal ditentukan saat laju linear maksimum tercapai. Waktu tercapainya laju awal digunakan sebagai waktu pengukuran untuk fraksi enzim lainnya. Aktivitas enzim ditentukan melalui persamaan berikut.
5 Unit didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menggunakan satu mikromol substrat per menit pada kondisi optimum.
Keterangan:
At = absorbansi pada menit ke-t A0 = absorbansi pada menit ke-0
= koefisien ekstingsi o-dianisidin (8.3 mM-1 cm-1) d = tebal larutan
t = waktu inkubasi (menit)
Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976)
Sebanyak 100 δ sampel ditambahkan 100 δ reagen Bradford, diaduk, lalu diinkubasi selama 10 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 595 nm. Kurva standar dibuat dari larutan Bovine Serum Albumin (BSA). Konsentrasi BSA yang digunakan adalah 0.0025-0.2 mg/mL. Persamaan garis kurva standar digunakan untuk menentukan kadar protein sampel.
Penentuan Kinetika GOD (Modifikasi Odenbunmi dan Owalude 2007)
Penentuan kinetika enzim dilakukan dengan mengukur aktivitas enzim pada variasi konsentrasi substrat. Substrat yang digunakan adalah glukosa dengan konsentrasi 8-100 mM. Hasil yang diperoleh dimasukkan ke dalam kurva Michaelis-Menten dengan sumbu x sebagai konsentrasi substrat (S) dan sumbu y sebagai aktivitas enzim (V). Melalui kurva Michaelis-Menten, dipilih variasi konsentrasi substrat dengan aktivitas yang meningkat secara signifikan untuk membuat kurva Lineweaver-Burk. Kurva Lineweaver-Burk dibuat dari setengah kecepatan maksimum dengan menghubungkan satu per konsentrasi substrat (1/S) sebagai sumbu x dan satu per aktivitas enzim (1/V) sebagai sumbu y. Persamaan yang diperoleh dari kurva tersebut digunakan untuk menentukan Km dan vmaks.
Pengukuran Voltamogram Siklik Elektroda Pasta Karbon (EPK) dan Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi (EPKT) (Colak et al. 2012)
Preparasi EPK dan EPKT. EPK disiapkan dengan mencampurkan 100 µL parafin dan 0.15 gram serbuk grafit di dalam mortar hingga menjadi pasta. Selanjutnya, pasta karbon tersebut dimasukkan ke dalam tabung elektroda yang disiapkan dari kaca kapiler dengan variasi ukuran diameter tembaga 1 mm dan 3 mm (Tang et al. 2014). Kemudian nilai arus terbaik EPK dari ukuran diameter tembaga dimodifikasi dengan penambahan nanofiber polianilin (EPKT) sebanyak 2 mg polianilin yang dicampur ke dalam mortar dengan 100 µL parafin dan 0.15 g serbuk grafit. Selanjutnya, masing-masing pasta karbon tersebut dimasukkan ke dalam tabung elektroda dengan ukuran dimeter terbaik dan panjang karbon pasta masing-masing 10 mm (Saglam et al. 2015).
6
elektroda kemudian disambungkan dengan tiga kabel berbeda yang telah terhubung dengan potensiostat. Setelah itu, voltamogram siklik yang terbentuk diamati dan dianalisis nilai arus serta potensial maksimumnya menggunakan menu “Data pad”.
Amobilisasi Glukosa Oksidase pada EPKT (Modifikasi Colak et al. 2012)
Sebanyak 50 µL GOD hasil pengendapan amonium sulfat 80% ditambahkan dengan 1 mg BSA, 50 µL bufer asetat 0.1 M pH 4.5, dan 30 µL glutaraldehid 2.5%. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikro dan dikocok perlahan. Kemudian diteteskan di atas permukaan EPKT sebanyak 5 µL. Elektroda yang menggunakan GOD teramobil dari isolat lokal disimbolkan dengan GODamo-IPB|EPKT. Selanjutnya, GODamo-IPB|EPKT tersebut dikeringkan pada suhu 4oC. Setelah kering, lalu dicuci beberapa kali dengan bufer asetat pH 4.5 untuk menghilangkan enzim yang tidak teramobil. Elektroda disimpan dalam lemari pendingin refrigerator pada suhu 4oC.
Pengukuran Voltamogram Siklik Kinerja EPKT dengan GOD Teramobil dan GOD Tidak Teramobil (Modifikasi Colak et al. 2012)
Elektroda kerja yang akan diukur terdiri atas dua jenis yaitu GODamo-IPB|EPKT dan GODGODamo-IPB|EPKT (GOD dari isolat lokal IPB yang tidak diamobilisasi) untuk melihat perbedaan nilai arus yang dihasilkan dari GOD yang teramobil dan GOD yang tidak teramobil. Kedua elektroda kerja tersebut secara bergantian dimasukkan ke dalam gelas kaca 10 mL yang berisi 3 mL larutan uji (1 mL larutan bufer asetat 0.1 M pH 4.5 yang ditambah 1 mL kalium ferisianida 0.1 M dan 180 µL larutan glukosa 1 mM) bersama elektroda Ag|AgCl (elektroda pembanding) dan elektroda platina (elektroda pelengkap). Ketiga elektroda (kerja, pembanding, dan pelengkap) kemudian disambungkan dengan tiga kabel berbeda yang telah terhubung dengan potensiostat. Setelah itu, voltamogram siklik yang terbentuk diamati dan dianalisis nilai arus serta potensial maksimumnya menggunakan menu
“Data pad”.
Kinetika Glukosa Oksidase Teramobil pada EPKT (modifikasi Ambarsari 2016)
7
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
GOD Intraseluler, Ekstraseluler, dan Laju Reaksi Awal
GOD yang dihasilkan oleh isolat lokal A.niger IPBCC.08.610 merupakan enzim intraseluler. Hal ini dibuktikan dari hasil uji aktivitas enzim intraseluler melalui proses lisis miseliumnya lebih tinggi dibandingkan aktivitas enzim ekstraseluler. Aktivitas ekstrak kasar GOD intraseluler sebesar 1.31 U/mL sedangkan aktivitas ekstrak kasar GOD ektraseluler hanya 0.17 U/mL. Biomassa yang dihasilkan oleh A.niger berupa sel bulat berukuran cukup besar dan berwarna putih (Lampiran 8). Biomassa berupa miselium ini kemudian dilisis menggunakan pasir kuarsa untuk mengeluarkan enzim yang terdapat di dalam sel.
Pengukuran aktivitas GOD dilakukan dengan menentukan kecepatan reaksi awal (Vo) terlebih dahulu. Kecepatan awal reaksi ditentukan berdasarkan laju linear maksimum pada kurva yang menghubungkan antara waktu dan absorbansi pengujian enzim (Gambar 1). Kecepatan awal reaksi GOD diperoleh sebesar 0.95/menit dengan nilai absorbansi setimbang yaitu 0.95. Setelah laju awal reaksi enzim diketahui, aktivitas sampel diukur dengan waktu pengukuran 1 menit.
Gambar 1 Penentuan kecepatan awal reaksi (V0)
Fraksi GOD Ekstrak Kasar dan Pengendapan (NH4)2SO4 80% Jenuh
Produksi GOD dilakukan pada 3 liter media dengan waktu fermentasi selama 40 jam. Ekstrak kasar GOD yang diperoleh lalu digunakan untuk tahap pemurnian dengan (NH4)2SO4 80% jenuh. Tabel 1 menunjukkan jumlah protein dan aktivitas yang dimiliki GOD ekstrak kasar dan fraksi pengendapan amonuium sulfat. Dari 3 liter volume media, dihasilkan 200 mL ekstrak kasar GOD dan dari volume ekstrak kasar tersebut dihasilkan 15 mL GOD fraksi pengendapan dengan amonium sulfat 80%. Protein yang dihasilkan pada GOD ekstrak kasar sebesar 193.92 mg dan menurun hingga 6.99 mg saat diendapkan oleh (NH4)2SO4 80% jenuh. Kurva standar glukosa untuk menghitung protein ditunjukkan pada Lampiran 2. Ekstrak
0 0.5 1 1.5 2
0 60 120 180 240 300 360
Absor
ba
n
436
8
kasar GOD dari isolat lokal A. niger (IPBCC.08.610) diketahui memiliki aktivitas spesifik sebesar 1.349 U/mg dengan yield sebesar 100%. GOD ekstrak kasar diendapkan dengan fraksi amonium sulfat yang memiliki tingkat kejenuhan 60%-80%. Fraksi pemurnian dengan (NH4)2SO4 80% jenuh memiliki aktivitas spesifik yang lebih tinggi yaitu sebesar 27.77 U/mg dan yield 72.86% dengan tingkat kemurnian hingga 20.22 kali dari ekstrak kasarnya. Perhitungan aktivitas GOD dapat dilihat pada Lampiran 3.
Tabel 1 Jumlah protein dan aktivitas GOD intraseluler dari A.niger IPBCC.08.610
Fraksi Aktivitas (U/mL)
[Protein] (mg/mL)
Volume (mL)
Aktivitas Total (U)
Protein Total (mg)
Aktivitas spesifik (U/mg)
Yield (%)
Kemurnian (kali)
1 1.31 0.97 200 261.68 193.92 1.34 100 1.00 2 12.71 0.46 15 190.66 6.99 27.77 72,86 20.22 Fraksi 1 : Ekstrak kasar GOD intraseluler
Fraksi 2 : GOD pengendapan (NH4)2SO4 80% jenuh
Kinetika Glukosa Oksidase
Kinetika aktivitas enzim yang melebihi nilai konsentrasi substrat akan membentuk kurva hiperbola rektangular atau kurva dari Michaelis-Menten (Gambar 2). Pada kurva ini terjadi peningkatan aktivitas enzim seiring dengan peningkatan konsentrasi glukosa yang digunakan. Konsentrasi glukosa yang digunakan yaitu 8-100 mM. Aktivitas enzim pada konsentrasi glukosa yang rendah meningkat secara linier terhadap konsentrasi. Akan tetapi, pada konsentrasi glukosa melebihi 0.06 M, laju peningkatan aktivitas enzim mengalami penurunan terhadap konsentrasi. Kurva tersebut kemudian di plot ke dalam kurva Lineweaver-Burk yang merupakan metode umum untuk menghitung nilai Km. Persamaan Lineweaver-Burk digunakan untuk menentukan kinetika GOD dari A.niger (IPBCC.08.610).
9 Persamaan linier Lineweaver-Burk (Gambar 3) digunakan untuk menentukan nilai Km dan Vmaks. Dari kurva tersebut diperoleh persamaan garis y= 0.0027x+0.0482 dengan regresi linier sebesar 99.23%. Persamaan tersebut menunjukkan hubungan antara 1/konsentrasi glukosa terhadap 1/aktivitas enzim. Berdasarkan tabel 2 nilai vmaks dan Km GOD isolat A. niger (IPBCC.08.610) hasil pengendapan amonium sulfat 80% yang diperoleh sebesar 20.747 U/mg dan 56 mM. Konsentrasi glukosa sebesar 56 mM merupakan jumlah glukosa yang dibutuhkan untuk mencapai setengah kecepatan maksimum GOD. Parameter lain yang digunakan untuk mempelajari kinetika dari suatu enzim adalah kcat atau bilangan putaran. Nilai kcat GOD dari fraksi amonium sulfat 80% diperkirakan sekitar 53 s-1. Efisiensi fraksi enzim yang dihasilkan yaitu 0.95 s-1 mM-1. Perhitungan kinetika kimia GOD hasil pengendapan amonium sulfat ditunjukkan pada Lampiran 4.
Gambar 3 Kurva Lineweaver-Burk linieritas antara konsentrasi substrat glukosa dan aktivitas GOD
Tabel 2 Parameter kinetika GOD
Fraksi GOD Vmax (U mg-1) Km (mM) Kcat (s-1) Efisiensi (s-1 mM-1) Am. Sulfat 80% 20.747 56 53 0.95
Voltamogram Siklik EPK dan EPKT
10
voltamogram siklik EPK dengan variasi ukuran diameter tembaga sebesar 1 mm dan 3 mm. EPK dengan diameter tembaga 3 mm memiliki nilai arus yang lebih besar dibandingkan 1 mm yaitu 0.362 mA dan tegangan potensial sebesar 0.695 V (Tabel 3). EPK berdiameter tembaga 3 mm selanjutnya dimodifikasi dengan penambahan nanofiber polianilin (EPKT). Masing-masing elektroda dilakukan sebanyak tiga kali ulangan (Lampiran 5).
Tabel 3 Arus oksidasi puncak anoda EPK ukuran diameter 1 mm, panjang 10 mm dan EPK ukuran diameter 3 mm, panjang 10 mm
Ukuran Elektroda (mm)
Potensial maksimum (V) Arus maksimum (A)
EPK1mm 0.435 0.228 x 10-3
EPK3mm 0.695 0.362 x 10-3
Gambar 4 Voltamogram siklik kinerja EPK dengan variasi ukuran diameter tembaga pada laju pemayaran 100 mVs-1, potensial 2 V, Initial E -1000 mV, final E -1000 mV, upper E 2000 mV, dan lower E -2000 mV. E = tegangan, I = arus, EPK1mm, --- EPK3mm
11 dikarenakan pada EPKT terdapat penambahan modifikasi polianilin yang berbentuk nanofiber. Nanofiber polianilin yang digunakan pada penelitian ini adalah hasil sintesis dari penelitian Ambarsari et al. (2016) dan tidak dilakukan karakterisasi ulang. Ambarsari et al. (2016) menyebutkan ukuran nanofiber polianilin ini sekitaar 110-120 nm, berbentuk butiran kasar, dan berwarna hijau tua kecokelatan. Morfologi polianilin yang disintesis secara polimerisasi interfasial tersebut diamati menggunakan mikroskop elektron (SEM).
Selain luas daerah voltamogram siklik, nilai arus oksidasi maksimum yang dihasilkan juga menjadi parameter lain untuk menunjukkan kualitas elektroda dalam menghantarkan elektron. Pemilihannya didasarkan reaksi dominan yang terjadi pada reaksi katalitik oleh GOD, yakni reaksi oksidasi. Peningkatan nilai arus oksidasi pada EPKT dibandingkan EPK diikuti dengan peningkatan potensial. Pada pengujian voltametri siklik dengan EPK, larutan KCl 3 M teroksidasi sempurna pada potensial 0.69 V dan menghasilkan arus 0.36 mA. Sementara itu, larutan KCl 3 M dengan menggunakan EPKT sebagai elektroda kerja, baru teroksidasi sempurna pada potensial 0.99 V dan menghasilkan arus 1.10 mA (Tabel 4).
Gambar 5 Voltamogram siklik kinerja EPK dan EPKT pada laju pemayaran 100 mVs-1, potensial 2 V, Initial E -1000 mV, final E -1000 mV, upper E 2000 mV, dan lower E -2000 mV. E = tegangan, I = arus, EPK, --- EPKT
Tabel 4 Arus oksidasi puncak anoda EPK dan EPKT
Sampel Potensial maksimum (V) Arus maksimum (A)
EPK 0.69 0.36 x 10-3
12
GOD Teramobilisasi pada Elektroda
EPKT kemudian digunakan sebagai media amobilisasi enzim. Teknik amobilisasi enzim dalam matriks polimer (polianilin) dengan polimerisasi pada elektrokimia hanya melibatkan penerapan potensial yang sesuai pada elektroda dalam pelarut yang cocok terhadap monomer dan enzim. Polimer konduktif memiliki kemampuan untuk mentransfer elektron yang dihasilkan oleh reaksi redoks dari analat sehingga dapat terbaca pada potensiostat. Gambar 6 menunjukkan voltamogram siklik dari dua elektroda kerja yakni EPKT dengan GOD teramobil menggunakan glutaraldehida 2.5% (GODamo-IPB|EPKT) dan tanpa glutaraldehida (GODIPB|EPKT) dengan scan rate 100 mV/s. Masing-masing elektroda dilakukan tiga kali ulangan (Lampiran 6). Perbandingan voltamogram siklik GODamo-IPB|EPKT dengan GODIPB|EPKT memiliki nilai puncak arus oksidasi dan rentang potensial yang berbeda. Luas voltamogram siklik GODamo-IPB|EPKT lebih besar dibandingkan GODIPB|EPKT. Hal ini menunjukkan EPKT dengan penambahan GOD teramobil menggunakan glutaraldehida bersifat lebih konduktif. Puncak arus okidasi GODamo-IPB|EPKT yang ditunjukkan pada tabel 5 berada pada 3.92 mA dengan potensial maksimum sebesar 1.5 V sementara GODIPB|EPKT pada 1.93 mA dengan potensial maksimum sebesar 1.7 V. GODamo-IPB|EPKT dipilih sebagai elektroda dengan respon terbaik berdasarkan nilai puncak arus oksidasi dan rentang potensial yang lebih besar pada voltamogram sikliknya. Larutan elektrolit yang digunakan yaitu Kalium Ferisianida (K3Fe(CN)6).
Gambar 6 Voltamogram siklik kinerja GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT pada
13 Tabel 5 Arus oksidasi puncak anoda GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT
Sampel Potensial maksimum (V) Arus maksimum (A)
GODIPB|EPKT 1.7 1.93 x 10-3
GODamo-IPB|EPKT 1.5 3.92 x 10-3
Parameter Kinetika Enzim teramobil pada EPKT
Penentuan parameter kinetika GOD diperlukan untuk mengetahui karakteristik dari aktivitas GOD tersebut sebagai elektroda enzim, yang dapat digunakan sebagai informasi dasar untuk pengembangan selanjutnya. Parameter kinetika GOD yaitu nilai Km dan Imaks ditentukan berdasarkan hasil dari uji kinerja
GODamo-IPB|EPKT terhadap konsentrasi substrat glukosa yang divariasikan pada
rentang konsentrasi 0.2 – 8.0 mM secara siklik voltametri. Voltamogram siklik yang dihasilkan dari kinerja GODamo-IPB|EPKT terhadap variasi konsentrasi glukosa
yang diuji dapat dilihat pada Gambar 7. Voltamogram siklik tersebut menunjukkan terbentuknya puncak oksidasi dari elektroda tersebut.
Parameter kinetika, terlebih dahulu ditentukan dengan kurva Michaelis-Menten dan kurva linieritas hubungan antara konsentrasi glukosa dan nilai arus oksidasi elektroda GODamo-IPB|EPKT. Kurva Michaelis-Menten diperoleh dengan
menghubungkan nilai arus yang dihasilkan pada puncak oksidasi dalam voltamogram siklik elektroda GODamo-IPB|EPKT terhadap konsentrasi substrat
glukosa yang diuji. Berdasarkan kurva Michaelis-Menten yang dapat dilihat pada Gambar 6, ketika konsentrasi glukosa di bawah 2 mM, kinerja elektroda GOD amo-IPB|EPKT terhadap substrat terus mengalami peningkatan seiring dengan
peningkatan konsentrasi glukosa namun, ketika konsentrasi glukosa mencapai 2 mM aktivitas GOD mulai mencapai maksimum, sehingga peningkatan konsentrasi glukosa yang lebih tinggi dari 2 mM tidak memberi pengaruh yang signifikan terhadap nilai arus oksidasi yang dihasilkan oleh elektroda GODamo-IPB|EPKT.
Konsentrasi glukosa pada konsentrasi terendah yakni 0.2 mM menghasilkan nilai arus sebesar 0.413 mA dan konsentrasi 2 mM menghasilkan nilai arus sebesar 3.869 mA.
Kurva linieritas antara konsentrasi substrat glukosa terhadap nilai arus elektroda GODamo-IPB|EPKT ditentukan berdasarkan kurva Michaelis-Menten
(Gambar 8). Daerah linier dari kinerja elektroda GODamo-IPB|EPKT yakni setengah
14
Gambar 7 Pengaruh konsentrasi substrat glukosa terhadap nilai arus elektroda
GODamo-IPB|EPKT
Gambar 8 Kurva Lineweaver-Burk dalam penentuan parameter kinetika Tabel 6 Parameter kinetika elektroda GODamo-IPB|EPKT
Elektroda Kcat (s-1) Range [glukosa] (mM)
Sensitivitas (mA mM-1)
15 Kemudian konsentrasi substrat 2 mM diuji stabilitas elektrodanya. Hasil ini ditunjukkan pada Gambar 9. Elektroda setelah disimpan selama satu bulan lalu dilakukan pengukuran, nilai arus menurun menjadi 3.22 mA. Dua bulan berikutnya nilai arus juga menurun menjadi 1.1 mA, dan pada bulan ketiga nilai arus semakin menurun menjadi 0.2 mA.
Gambar 9 Stabilitas GODamo-IPB|EPKT selama tiga bulan
Pembahasan
GOD Intraseluler, Ekstraseluler, dan Laju Awalnya
16
Sumber nutrisi bagi A. niger yaitu sumber C. Sukrosa salah satu sumber C, bertindak sebagai induser. Lampiran 8 menunjukkan bahwa sukrosa yang berada di luar sel memberikan sinyal kepada Aspergillus niger. Sukrosa terlebih dahulu dipecah menjadi senyawa yang lebih sederhana untuk dapat masuk kedalam membran sel, yaitu dengan bantuan GOD. Dalam membran sel, DNA memberikan sinyal kepada mRNA untuk mengkode terbentunya asam-asam amino penyusun GOD. Ribosom merupakan tempat penyusunan terbentuknya GOD. Setelah GOD terbentuk, GOD disekresikan keluar membran sel untuk membantu pemecahan sukrosa. Proses pembentukan GOD akan terus berjalan, apabila masih terdapat nutrisi terutama sumber karbon (Indriani et al. 2015).
Produksi GOD dilakukan pada dua media yang berbeda. Media pertama merupakan media starter yang mengandung pepton, glukosa, (NH4)2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O. Media kedua merupakan media produksi yang terdiri atas sukrosa, glukosa, CaCO3, (NH4)2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O. Sumber karbon yang digunakan dalam media produksi berupa sukrosa dan glukosa. Sukrosa yang digunakan untuk media lebih banyak dibandingkan glukosa. Hal ini dikarenakan menurut Bankar et al. (2009) sukrosa merupakan substrat yang dapat merangsang produksi GOD dengan lebih optimal. Konsentrasi glukosa yang tinggi mengakibatkan penurunan massa miselia, pH kultur, dan konsentrasi GOD (Simpson 2005). Konsentrasi glukosa optimal untuk produksi GOD pada A. niger mutant G-13 yaitu 8% sedangkan konsentrasi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 0.35%. Berdasarkan penelitian Sabir et al. (2007) yang menggunakan berbagai macam sumber karbon dalam produksi enzim GOD dari Penicillium notatum didapat bahwa penggunaan sukrosa dalam media menunjukkan aktivitas GOD yang dihasilkan paling tinggi dibandingkan penggunaan maltosa, glukosa, fruktosa, dan pati.
Media yang digunakan pada penelitian ini memiliki konsentrasi CaCO3 4% dan pH 5.5. Konsentrasi CaCO3 yang optimum untuk produksi GOD menurut Hatzinikolaou et al. (1996) adalah 4%. Simpson (2005) melaporkan bahwa CaCO3 merupakan penginduksi yang kuat dalam pembentukan GOD pada A. niger. Berdasarkan penelitian Hatzinikolaou et al. (1996) didapat bahwa aktivitas enzim glukosa-6-fosfat isomerase sebagai enzim glikolisis lebih tinggi pada media tanpa CaCO3 sedangkan aktivitas GOD dan katalase cukup rendah. Penambahan CaCO3 mengakibatkan peningkatan aktivitas GOD dan katalase seiring dengan penurunan aktivitas glukosa-6-fosfat isomerase. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa adanya CaCO3 mengubah jalur metabolik A. niger dari glikolisis menjadi jalur pentosa fosfat, yang dapat meningkatkan jumlah glukosa oksidase (Simpson 2005). Berdasarkan penelitian Khurshid et al. (2011), pH optimum untuk produksi GOD pada A. niger adalah 5.5. Produksi glukosa oksidase selama fermentasi dapat berlangsung pada pH minimal 4 (Simpson 2005).
17 (NH4)2HPO4 dengan kadar 0.2 % merupakan sumber fosfor yang baik bagi pertumbuhan A. niger karena dapat meningkatkan aktivitas glukosa oksidase.
Pengukuran aktivitas GOD dilakukan dengan menentukan kecepatan reaksi awal (Vo) terlebih dahulu. Pada tahap awal reaksi, tidak dihasilkan produk, tetapi pada tahap reaksi berikutnya, reaksi balik menjadi lebih penting pada saat mendekati kesetimbangan. Konsentrasi substrat linear seiring dengan pertambahan waktu, kemudian aktivitas enzim juga menurun karena enzim menjadi jenuh terhadap substrat. Akhirnya enzim dihambat oleh produk yang terbentuk atau menjadi lambat aktivitasnya. Pengukuran aktivitas biasanya dilakukan segera setelah reaksi dimulai untuk menghindari terjadinya pengurangan laju akibat pengurangan substrat dan penumpukan produk (Metzler 2003). Oleh karena itu aktivitas enzim (V) ditentukan oleh vo ketika pengaruh tersebut sangat kecil. Kecepatan awal reaksi (Vo) ditentukan berdasarkan laju linear maksimum pada kurva yang menghubungkan antara waktu dan absorbansi pengujian enzim. Kecepatan awal reaksi GOD diperoleh sebesar 0.95/menit. Setelah laju awal reaksi enzim diketahui, aktivitas masing-masing sampel diukur dengan waktu pengukuran 1 menit. Waktu ini ditentukan berdasarkan waktu yang menunjukkan terjadinya laju linear tertinggi pada reaksi enzim (to).
Prinsip pengujian enzim GOD berdasarkan oksidasi β-D-glukosa oleh GOD
dengan bantuan oksigen menjadi β-D-glukono- -lakton dan hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida yang terbentuk digunakan untuk mengoksidasi substrat kromogen pada reaksi kedua dengan GOD menghasilkan perubahan warna. Perubahan warna kemudian diamati secara spektrofotometri (Sukhacheva et al. 2004). Pada penelitian ini menggunakan orto-dianisidin sebagai substrat kromogen. Perubahan warna yang terjadi diukur pada panjang gelombang 436 nm. Warna yang dihasilkan yakni merah muda. Larutan glukosa yang digunakan didiamkan terlebih
dahulu selama 1 jam agar terjadi mutarotasi menjadi β-D-glukosa (Simpson 2005).
GOD Fraksi Ekstrak Kasar dan Pengendapan Amonium Sulfat
Produksi GOD dilakukan pada 3 liter media dengan waktu fermentasi selama 40 jam. Ekstrak kasar diperoleh dari hasil isolasi A. niger (IPBCC 08.610) yang ditumbuhkan dalam media produksi setelah melalui tahap inkubasi selama 40 jam. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Khursid et al. (2011) menyebutkan bahwa waktu produksi GOD paling maksimal dilakukan dalam waktu 48 jam. Optimasi waktu produksi A. niger (IPBCC 08.610) juga dilakukan oleh Triana (2012), aktivitas total GOD yang dihasilkan pada 48 jam lebih tinggi daripada waktu produksi selama 72 jam, nilai yang diperoleh yaitu sebesar 134.21 U dan 103.72 U. Pada penelitian ini, aktivitas total ekstrak kasar yang diperoleh lebih tinggi daripada yang diperoleh oleh Triana (2012) yaitu sebesar 261.68 U. Unit merupakan satuan dari aktivitas enzim. Unit didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menggunakan satu mikromol substrat per menit pada suhu dan temperatur tertentu. Perbedaan waktu optimum inkubasi ini dikarenakan suhu yang digunakan pada penelitian ini lebih tinggi yaitu 370C dengan kecepatan agitasi 120 rpm. Suhu yang lebih tinggi dianggap mampu mempercepat pertumbuhan A.niger yang optimum pada suhu 25-370C (Decamps et al. 2012).
18
pH produksi. Pada penelitian ini aerasi dan agitasi pada saat produksi sangat penting diperhatikan karena fungsi aerasi dan agitasi adalah untuk mensuplai kebutuhan oksigen yang dibutuhkan untuk kapang sebagai mikroorganisme aerobik obligat (Simpson 2005). Pada produksi GOD dari A. niger isolat lokal (IPBCC 08.610) yang dilakukan pada penelitian ini, kecepatan agitasi yang digunakan adalah 120 rpm dengan perbandingan aerasi sebesar 1 : 5, penentuan aerasi dan agitasi tersebut merujuk pada penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh Singh dan Verma (2010) dan Khurshid e al. (2011). Tingkat aerasi dan agitasi mempengaruhi kecepatan konsumsi oksigen dan ketersediannya selama proses kultivasi berlangsung. Laju konsumsi O2 oleh A.niger ketika masa produksi cukup tinggi. Oksigen yang tidak mencukupi menyebabkan berkurangnya hasil dari produk mikroorganisme seperti enzim (Jafari et al. 2007). Enzim dapat mempercepat reaksi kimiawi dengan sempurna bila berada dalam suhu optimumnya, namun bila suhu operasi menyimpang dari suhu optimum maka aktivitas enzim akan menurun. Penyimpangan pH medium juga dapat menimbulkan pertumbuhan dan metabolisme mikroba terhenti dikarenakan protein dalam struktur enzim dan sistem transport yang terdapat pada membran sel berubah. (Bankar et al. 2009).
Ekstrak kasar enzim yang diperoleh lalu digunakan untuk tahap pemurnian dengan amonium sulfat. Tahap ini merupakan langkah awal pemurnian enzim yang berfungsi meningkatkan konsentrasi protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan memisahkan protein target dari sebagian kontaminan yang tidak diinginkan. Peningkatan kemurnian yang cukup signifikan menunjukkan bahwa tingkat kejenuhan 80% amonium sulfat optimum untuk mengendapkan protein GOD. Sherbeny et al. (2005), Triana (2012), dan Selena (2014) menyatakan hal yang sama, yaitu amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 80% optimum dalam meningkatkan kemurnian GOD.
Perbedaan tingkat kejenuhan amonium sulfat berhubungan dengan jumlah asam amino hidrofilik dan hidrofobik yang terdapat pada permukaan protein enzim. Protein enzim yang memiliki lebih banyak asam amino hidrofilik membutuhkan konsentrasi garam yang lebih tinggi untuk mengendapkannya karena permukaan protein yang hidrofilik berinteraksi kuat dengan air sehingga diperlukan ion-ion dari garam dalam jumlah yang lebih banyak untuk mengganggu interaksi tersebut. Sebaliknya, jika protein enzim mengandung lebih banyak asam amino hidrofobik, jumlah amonium sulfat yang diperlukan lebih sedikit (Anwar 2006). Amonium sulfat yang sudah dihaluskan ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam enzim sambil diaduk agar konsentrasi amonium sulfat dapat merata saat berinteraksi dengan enzim. Aktivitas enzim dan konsentrasi protein tertinggi pada fraksi amonium sulfat 80% menunjukkan bahwa GOD yang dihasilkan memiliki sifat hidrofilik yang tinggi sehingga diperlukan kejenuhan amonium sulfat yang tinggi untuk membuatnya mengendap.
19 histidin, asam glutamat, asam aspartat, dan arginin merupakan asam amino yang bersifat polar atau hidrofilik (Nelson dan Cox 2008).
Kinetika Glukosa Oksidase
Persamaan linier Lineweaver-Burk digunakan untuk menentukan konstanta kinetika GOD dari A. niger (IPBCC.08.610). Gambar 7 menunjukkan pengaruh GOD terhadap aktivitas spesifik GOD. Berdasarkan hasil tersebut terlihat bahwa terjadi peningkatan aktivitas enzim seiring dengan peningkatan konsentrasi glukosa yang digunakan. Aktivitas enzim pada konsentrasi glukosa yang rendah meningkat secara linear terhadap konsentrasi. Akan tetapi pada konsentrasi glukosa melebihi 0.06 M, laju peningkatan aktivitas enzim mengalami penurunan secara progresif terhadap konsentrasi. Mekanisme reaksi enzimatis secara umum ditunjukkan sebagai berikut:
Laju pembentukan kompleks enzim-substrat (EA) lebih cepat dibandingkan reaksi penguraiannya menjadi enzim bebas (E) dan produk (P) (Rogers dan Gibon 2009). Pada saat konsentrasi substrat (A) rendah maka enzim akan banyak dalam kondisi bebas sehingga dengan peningkatan substrat akan menyebabkan kesetimbangan bergeser ke arah EA yang mengakibatkan terjadi peningkatan pembentukan EA. Saat semua enzim telah membentuk kompleks dengan substrat akibat konsentrasi substrat yang tinggi, penambahan substrat tidak lagi memberikan pengaruh pada peningkatan aktivitas enzim akibat terjadinya kondisi enzim yang jenuh oleh substrat (Nelson dan Cox 2008).
GOD yang dihasilkan dari pengendapan amonium sulfat 80% memiliki nilai Km dan vmaks yang diperoleh berturut-turut adalah 56 mM dan 20.747 U/mg. Konsentrasi glukosa sebesar 56 mM merupakan jumlah glukosa yang dibutuhkan untuk mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Nilai Km GOD dari A. niger (Sigma Type VIII) hasil fraksi pemurnian kromatografi kolom yaitu sebesar 30 mM (Kalisz et al. 1991). Nilai Km yang diperoleh masih relatif lebih tinggi. Semakin tinggi nilai Km maka semakin rendah afinitasnya terhadap substrat, dalam hal ini
yaitu β-D-glukosa. Nilai vmaks yang diperoleh relatif masih sangat rendah dibandingkan nilai vmaks GOD dari A. niger (Sigma Type VIII), yaitu 458 U/mg (Kalisz et al. 1991). Semakin tinggi vmaks suatu enzim maka semakin tinggi kecepatan yang bisa dicapai oleh enzim tersebut. Hal ini dikarenakan pemurnian yang dilakukan pada penelitian ini masih parsial baru sampai tahap pengendapan amonium sulfat sehingga diduga masih terdapat protein-protein lain selain protein target.
20
VII) yaitu 157 kDa (Kalisz et al. 1991), maka nilai kcat GOD fraksi hasil pengendapan amonium sulfat ini diperkirakan sekitar 53 s-1. Nilai ini masih sangat rendah dibandingkan kcat GOD fraksi kromatografi kolom dari A. niger (Sigma Type VII), yaitu 920 s-1 (Kalisz et al. 1991). Semakin besar nilai kcat maka semakin cepat proses katalisis terjadi (Rogers & Gibon 2009). Efisiensi fraksi enzim yang dihasilkan masih sangat kecil yaitu 0.95 s-1 mM-1 jika dibandingkan dengan efisiensi GOD fraksi kromatografi kolom dari A. niger (Sigma Type VII) yaitu 31 s-1 mM-1. Hal ini dikarenakan GOD yang dihasilkan pada penelitian ini belum murni karena hanya melalui tahap pemurnian sampai pengendapan amonium sulfat sehingga perlu dilakukan pemurnian lebih lanjut untuk meningkatkan bilangan putaran tersebut, seperti pemurnian dengan menggunakan kromatografi kolom. Semakin murni enzim tersebut maka aktivitas spesifiknya semakin tinggi sehingga vmaks semakin tinggi yang berdampak pada semakin tinggi pula kcat. Efisiensi enzim merupakan perbandingan dari kcat/Km dan dapat diartikan sebagai nilai dari spesifisitas substrat. Saat kcat lebih besar dari k-1, proses katalisis berlangsung dengan sangat cepat dan efisiensi enzim bergantung pada kemampuannya untuk mengikat substrat (Rogers & Gibon 2009). Semakin tinggi efisiensinya maka enzim tersebut semakin tinggi spesifisitasnya terhadap substrat tersebut.
Voltamogram Siklik EPK dan EPKT
Perubahan konduktansi EPK dievaluasi dengan mengukur voltamogram sikliknya menggunakan metode voltametri siklik. Metode ini dapat mengevaluasi reaksi elektrokimia yang terjadi di permukaan antarmuka larutan elektrolit dengan elektroda (Zhu et al. 2012). Pengukuran didasarkan pergerakan elektron antara elektroda kerja dan elektroda pelengkap. Pada elektroda kerja yang berperan sebagai anoda, komponen larutan elektrolit dioksidasi sempurna menjadi bentuk tereduksi pada potensial tertentu sehingga elektron yang dilepaskan terbaca sebagai puncak arus oksidasi. Selanjutnya, elektron yang dilepaskan tersebut ditransfer menuju elektroda pelengkap (Pt|Ti) dengan bantuan larutan elektrolit dan direduksi menjadi bentuk teroksidasi kembali (Wang 2006). Ukuran tembaga mempengaruhi proses transfer elektron. Selain elektroda kerja dan elektroda pelengkap, elektroda pembanding juga diperlukan dalam teknik ini. Elektroda jenis ini nilai potensialnya telah diketahui dan bersifat stabil yakni tidak dipengaruhi oleh komposisi sampel. Elektroda ini berfungsi mengontrol potensial elektroda kerja dalam pengukuran voltametri siklik. Elektroda Ag|AgCl digunakan sebagai elektroda pembanding karena konstruksinya yang sangat sederhana dan bebas dari merkuri. Ketiga elektroda dalam sel elektrokimia berada pada posisi berurutan yakni elekroda Ag|AgCl (R), elektroda kerja (W), dan elektroda Pt|Ti (C) agar antara elektroda kerja dengan elektroda pelengkap dapat membentuk sirkuit elektron dan meminimalkan hambatan serta ketidakstabilan potensial (Lampiran 10).
21 Selain itu penggunaan tembaga lebih murah dibandingkan logam lain yang dapat menghantarkan elektron seperti emas dan perak. Tembaga dengan ukuran 3 mm memiliki nilai arus yang lebih tinggi dibandingkan 1 mm hal ini dikarenakan daya hantar yang dihasilkan lebih besar sehingga nilai arus yang didapat juga besar.
EPK dengan ukuran diameter tembaga 3 mm selanjutnya dimodifikasi dengan nanoserat polianilin. Modifikasi EPK dengan penambahan nanoserat polianilin bertujuan meningkatkan daya hantar listriknya (konduktansi) (Dhand et al. 2008). Perbandingan nilai arus oksidasi maksimum antara EPK dengan EPKT pada penelitian ini sebesar 2:3 berbeda dengan penelitian Ambarsari (2016) dengan yang memiliki perbandingan 1:6. Perbedaan ini dipengaruhi jarak antara elektroda kerja dengan elektroda pelengkap. Jarak keduanya perlu dijaga sedekat mungkin agar meminimalkan hambatan dan ketidakstabilan dalam sel elektrokimia (Scholz et al. 2010). Selain itu perbedaan ini juga dipengaruhi oleh ukuran elektroda. Pada penelitian ini digunakan elektroda dengan ukuran diameter 3 mm dan panjang pasta karbon 10 mm. sementra pada penelitian Ambarsari (2016) digunakan ukuran diameter 8 mm dan panjang pasta karbon 3 mm. Perbedaan ukuran ini akan menyebabkan perbedaan transfer elektron sehingga berpengaruh pada nilai arus dan potensial.
Peningkatan nilai arus oksidasi maksimum EPKT disebabkan nanofiber polianilin yang digunakan sebagai polimer pemodifikasi EPK. Polianilin sebagai polimer konduktif juga meningkatkan luas permukaan dan kepadatan pasta karbon dalam menerima serta mentransfer elektron (Gospodinova dan Terlemezyan 1998). Konduktivitas polianilin dapat ditentukan dengan mengukur tahanan listrik bahan (R) yang dinyatakan sebagai beda potensial setiap satuan arus listrik sementara konduktivitas dapat dinyatakan dengan hubungan R terhadap luas penampang setiap satuan jarak elektroda (Indayaningsih et al. 1997).
Kombinasi polianilin dengan bahan organik atau anorganik lain dapat menghasilkan material baru yang tidak hanya meningkatkan sifat mekanik tetapi juga sifat lain tergantung material yang ditambahkan. Penambahan polianilin pada karbon dilakukan agar tidak ada ruang kosong antara partikel grafit yang satu dengan yang lainnya, sehingga polinilin yang ditambahkan masuk dalam rongga kosong antara partikel grafit, hal ini meningkatkan konduktivitas listrik pada elektroda yang dibuat karena jalannya elektron tidak terputus. Grafit pada komposit berfungsi sebagai penguat dan memperkecil gesekan serta meningkatkan ketahanan arus (Gradiniar 2013). Komposit elektroda pasta karbon telah banyak digunakan untuk aplikasi elektroanalitik sejak diperkenalkan oleh Adams pada tahun 1958, karena sifat konduktif, terbarukan dan untuk fabrikasi secara elektrokimia sangat sederhana dan murah (Colak 2012).
22
berasal dari larutan KCl 1 M. hasil yang didapat ini sesuai dengan penelitian Ambarsari (2016) yang menyatakan polianilin pada EPKT dapat meningkatkan kinerja EPK.
GOD Teramobilisasi pada Elektroda
Teknik amobilisasi enzim adalah teknik yang digunakan agar enzim tidak bergerak. Tujuan amobilisasi adalah untuk mengendalikan pergerakan enzim secara total atau sebagian pada bagian pasta karbon elektroda dan meningkatkan aktivitas enzim. Metode ikatan silang didasarkan pada pembentukan ikatan kimia, seperti pada metode ikatan kovalen, tetapi tidak menggunakan matriks yang tidak larut. Enzim yang diamobilisasi dengan metode ini sering bersifat gel sehingga sukar ditangani. Pada penelitian agen pengamobil menggunakan glutaraldehid. Proses ini didasarkan pembentukan kompleks secara kovalen antara polianilin-glutaraldehid-enzim. Gugus amina pada enzim berikatan dengan glutaraldehid sebagai agen pengikat silang sedangkan gugus amina pada rantai polianilin terikat dengan gugus C=O pada glutaraldehid melalui reaksi kondensasi yang melepaskan molekul air (Gambar 8). Pengikatan gugus amina oleh glutarahdehida terjadi terhadap asam amino lisin atau hidroksilisin (Singh et al. 2005).
Selain glutaraldehida, komponen lain dalam amobilisasi enzim pada penelitian ini yakni bufer asetat dengan pH 4.5 dan Bovine Serum Albumine (BSA) (Adeloju dan Lawal 2011). pH dalam amobilisasi bertujuan mengondisikan pH lingkungan enzim yang sesuai dengan pH optimum elektroda. Hal ini didasarkan proses amobilisasi yang dapat mengubah nilai pH optimum enzim karena perubahan daya terionisasi asam amino pada sisi aktif enzim (Colak et al. 2012). Sementara itu, fungsi penambahan BSA adalah sebagai agen penstabil. Campuran larutan teramobil dalam permukaan pasta karbon melalui peristiwa adsorbsi fisik. Hasilnya, permukaan pasta karbon elektroda tampak sebagian terlapisi komponen amobil yang telah kering.
Sifat dari enzim amobil berbeda dengan enzim yang terdapat bebas dalam larutan dan tergantung dari metode amobilisasi. Proses amobilisasi pada GOD dapat meningkatkan kestabilan aktivitas GOD, yang ditunjukkan dengan aktivitas GOD menjadi lebih stabil pada suhu tinggi dengan aktivitas yang optimum dibandingkan dalam kondisi bebas yang optimum pada suhu sekitar 25-370C (Simpson et al. 2007). Karakteristik enzim dapat berubah jika sisi aktif mengalami perubahan konformasi sebagai hasil interaksi elektrostatik dengan molekul substrata tau produk. Selain itu, enzim yang diamobilkan akan mengalami perubahan komposisi yang dimungkinkan akibat dari sisi aktif enzim yang berikatan dengan matriks sehingga mengakibatkan berkurangnya katalitik enim tersebut.
Puncak arus oksidasi pada voltamogram siklik GODamo-IPB|EPKT
menggambarkan reaksi pembentukan asam glukonat telah berlangsung sempurna pada elektroda kerja. Sementara itu, puncak arus reduksi menggambarkan pemecahan hidrogen peroksida menjadi oksigen pada elektroda pelengkap. Jumlah puncak maksimum pada voltamogram siklik GODamo-IPB|EPKT terdapat satu reaksi
23 Konsentrasi enzim berbanding lurus dengan aktivitas enzim. Hal ini menguatkan hipotesis pengikatan gugus amina GOD pada polianilin memerlukan glutaraldehida.
Gambar 10 Pembentukan kompleks polianilin-glutaraldehid-GOD secara kovalen (Singh et al. 2005)
Enzim yang diamobilisasi dapat kehilangan aktivitasnya karena beberapa hal yaitu beberapa enzim mungkin diamobilisasi pada matriks dengan konfigurasi sedemikian rupa sehingga menghambat kontak antara substrat dengan sisi aktif enzim. Gugus reaktif pada sisi aktif enzim mungkin ikut terikat pada matriks. Molekul enzim selama pengikatan mungkin berubah menjadi konfigurasi inaktif. Kondisi reaksi selama pengikatan mungkin menyebabkan denaturasi atau inaktivasi enzim. Stabilitas enzim teramobil tergantung dari lingkungan mikro yang dapat menyebabkan protein dasar dari enzim terdenaturasi atau tetap stabil. Pada penelitian ini amobilisasi enzim mampu meningkatkan aktivitas GOD yang ditunjukkan pada tingginya nilai arus. Hal ini mengindikasikan teknik amobilisasi yang digunakan tepat seingga pengikatan sisi aktif GOD dan substrat dapat optimal.
Parameter Kinetika Enzim teramobil pada EPKT
Karakteristik aktivitas GOD dapat diketahui melalui penentuan parameter kinetikanya, yaitu nilai Km dan Imaks. Parameter kinetika tersebut ditentukan melalui pengujian pengaruh konsentrasi substrat terhadap kinerja elektroda GODamo-IPB|EPKT yang diamati secara elektrokimia siklik voltametri. Aktivitas GOD sangat memungkinkan untuk diamati secara elektrokimia karena terdapat reaksi reduksi oksidasi yang dikatalisis oleh GOD tersebut. Sinyal berupa elektron tersebut terdeteksi secara elektrokimia dalam bentuk arus yang tercatat dalam bentuk voltamogram siklik. Nilai arus menggambarkan laju reaksi katalis enzim terhadap glukosa. Laju reaksi sebenarnya bergantung pada jumlah total enzim yang berada dalam bentuk kompleks enzim-substrat (ES). Terdapat tiga keadaan pengaruh konsentrasi substrat terhadap kinerja elektroda GODamo-IPB|EPKT. Pertama, Pada konsentrasi substrat yang rendah ([S] < Km), jumlah enzim dalam bentuk kompleks ES sedikit dan sebagian besar enzim dalam kondisi bebas. Hal ini menyebabkan laju reaksi pembentukan produk berlangsung lambat, yang ditunjukkan dengan nilai arus yang diperoleh kecil (Fadhilah 2013).
24
peningkatan konsentrasi substrat yang lebih tinggi lagi tidak akan menghasilkan peningkatan nilai arus yang signifikan. Dalam kondisi tersebut enzim telah mencapai kondisi jenuh (Fadhilah 2013).
Kurva Michaelis-Menten pada Gambar 8 menggambarkan ketiga keadaan tersebut sebagai pengaruh dari konsentrasi substrat terhadap kinerja elektroda GODamo-IPB|EPKT, yang menunjukkan bahwa terjadi peningkatan nilai arus yang dihasilkan seiring dengan peningkatan konsentrasi substrat. Hal ini berarti terjadi peningkatan kompleks ES, sehingga laju reaksi enzim masih meningkat. Namun, pada konsentrasi glukosa diatas 2 mM tidak terjadi peningkatan arus yang signifikan, yang berarti laju reaksi telah mencapai maksimum. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas GOD sebagai elektroda enzim mencapai keadaan jenuh saat konsentrasi glukosa lebih besar dari 2 mM.
Berdasarkan kurva Michaelis-Menten tersebut dapat ditentukan nilai Km dari kinerja elektroda GOD/EPKT. Penentuan nilai Km dan Imaks berdasarkan daerah linier pada kurva Michaelis-Menten. Sehingga dapat diperoleh nilai Km dan Imaks yang lebih akurat. Daerah linier tersebut berada pada rentang 0.2 – 1.6 mM dengan nilai regresi (r2) sebesar 0.986. Daerah linier tersebut kemudian dikonversi ke dalam kurva Lineweaver-Burk (
[S]vsI). Nilai Km dan Imaks yang diperoleh
berdasarkan analisis persamaan Lineweaver-Burk, masing-masing sebesar 2 mM dan 3.869 mA. Nilai Km dari elektroda GOD pada penelitian ini yakni 2.88 mM jauh lebih besar dengan nilai Km dari elektroda GOD pada penelitian Colak et al. (2012) yaitu sebesar 0.61 mM. Nilai Imaks yang diperoleh pada penelitian ini juga lebih besar yaitu 3.86 mA dibandingkan nilai Imaks yang diperoleh Colak et al.
(2012) yang sebesar 1.22 A/min. Begitupun dengan penelitian Ambarsari (2016) yang memiliki nilai Km lebih rendah yaitu sebesar 0.70 mM dan Imaks lebih besar yaitu 4.24 mA. Hal ini menunjukkan bahwa kinerja elektroda GODamo-IPB|EPKT pada penelitian ini lebih baik, karena walaupun nilai Km yang tinggi, tetapi dapat menghasilkan nilai arus atau laju reaksi maksimum yang besar. Namun Km yang dihasilkan pada penelitian ini lebih besar dari Ambarsari et al. (2016). Berdasarkan
Brown et al. 2010 jika nilai Km suatu enzim tinggi, maka diperlukan konsentrasi substrat yang tinggi untuk mencapai setengah laju reaksi maksimum. Hal ini berarti bahwa enzim tersebut memiliki afinitas atau kemampuan untuk terikat substrat yang rendah, sehingga efisien jika diaplikasikan dalam teknologi fuel cell karena enzim fuel cell membutuhkan Km yang tinggi agar diperoleh kerapatan daya yang tinggi.
Nilai Km pada penelitian ini dikonversi ke dalam satuan mg/dL dan diperoleh
nilai Km sebesar 56.4 mg/dL. Jika elektroda GODamo-IPB|EPKT tersebut akan
diaplikasikan sebagai biosensor glukosa dalam bidang medis seperti pengukuran kadar glukosa darah, maka elektroda ini cukup berpotensi. Berdasarkan nilai Km tersebut,
25 Uji stabilitas elektroda menunjukan daya tahan penggunaan elektroda selama jangka waktu tertentu yang dilihat dari nilai arus yang dihasilkan. Pada Gambar 9 menunjukkan nilai arus elektroda menurun pada bulan pertama hingga bulan ketiga. Penurunan terjadi secara signifikan. Berdasarkan Tang et al. 2015 ikatan silang glutaraldehida dengan GOD dan polianilin dapat meningkatkan stabilitas elektroda yang memliki stabilitas hingga 70 hari. Namun, pada penelitian ini stabilitas elektroda tidak mencapai jangka waktu satu bulan. Hal ini dikarenakan proses penyimpanan elektroda pada larutan buffer asetat pH 4.5 mempengaruhi penurunan nilai arus. Diduga penyimpanan elektroda di dalam buffer asetat mengalami proses transfer elektron antara GOD dan ion-ion yang terdapat pada larutan buffer asetat sehingga pada saat pengukuran terjadi kejenuhan pentransferan elektron dari GOD.
4
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Karakteristik biokimia GOD dari A. niger (IPBCC.08.610) meliputi aktivitas enzim, kinetika GOD hasil pengendapan (NH4)2SO4 80% dan kinetika GOD teramobil pada elektroda pasta karbon. Aktivitas GOD lebih tinggi dihasilkan secara intraseluler (1.31 U/mL) dengan laju reaksi awal satu menit. GOD terendapkan dengan baik pada pengendapan 80% (NH4)2SO4 jenuh dengan aktivitas spesifik sebesar 27.77 U/mg dan kemurniannya mencapai 20.22 kali dari ekstrak kasarnya. Nanofiber polianilin dapat meningkatkan konduktansi EPK. Metode amobilisasi dapat meningkatkan arus GODamo-IPB|EPKT (3.869 mA). Amobilisasi GOD pada EPKT dapat meningkatkan afinitas enzim-substrat (Km=2.88 mM) dibandingkan hasil pengendapan (NH4)2SO4 80% (Km=56 mM). Bilangan putaran atau turnover GOD yang diamobilisasi pada EPKT juga meningkat dari 53 s-1 menjadi 13 s-1. Amobilisasi GOD pada EPKT dapat memperkecil konsentrasi substrat namun meningkatkan kecepatan maksimum reaksi yang terlihat dari nilai Km dan Vmax sehingga EPKT lebih ekonomis dan efisien. GODamo-IPB|EPKT memiliki sensitivitas sebesar 1.09 mA mM-1 dengan range konsentrasi substrat
0.2-2 mM. GODamo-IPB|EPKT berpotensi untuk dijadikan biosensor glukosa darah dengan konsentrasi pendeteksi sebesar 54.6 mg/dL. Range konsentrasi substrat GODamo-IPB|EPKT juga berpotensi untuk dijadikan biosensor glukosa dalam mendeteksi tingkat kematangan pada buah. Dalam aplikasi sebagai bioanoda fuel cell dibutuhkan optimasi dan karakterisasi performance elektroda.
Saran
26
DAFTAR PUSTAKA
Adeloju SB, Lawal AT. 2011. Fabrication of a bilayer potentiometric phosphate biosensor by cross-link immobilization with bovine serum albumin and glutaraldehyde. Analytica Chimica Acta. 691:89-94.
Ahmad A, Syaiful A, Firman Ap, Patong AR. 2007. Imobilisasi enzim glukosa oksidase dari Penicillium sp-3 galur lokal. Indo J Chem. 7:97-104. Ambarsari L, Setyawati I, Kurniasih R, Kurniatin PA, Maddu A. Immobiliation
of glucose oxidase on modified-carbon-paste-electrodes or microfuel cell. Indones J Chem. 1:1-16.
Anwar YAS. 2006. Produksi dan karakterisasi enzim tanin asil hidrolase dari Aspergillus niger [tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana, IPB.
Bankar SB, Bule MV, Singhal RS, Ananthanarayan L. 2009. Optimization of Aspergillus niger fermentation for the production of glucose oxidase. Food Biopro Technol 2:344-352.
Bergmeyer HU. 1988. Methods of enzymatic analysis. Edisi ke-3. Vol. II: Samples, reagents, assesment of result.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal biochem. 72(1): 248-254.
Brown S, Muhamad N, Simcock DC. 2010. Estimating enzyme kinetic parameters from apperent Km and Vmax. Int J Chem Bio Eng. 3(4):195-200.
Colak O, Arslan H, Zengin H, Zengin G. 2012. Amperometric detection of glucose by polyaniline-activated carbon composite carbon paste electrode. Int J Electrochem Sci. 7:6988-6997.
Dhand C, Arya SK, Datta M, Malhotra BD. 2008. Polyaniline-carbon nanotube composite film for cholesterol biosensor. Anal Biochem. 83: 194-199. Decamps K, Joye I, Haltrich D, Nicolas J, Courtin C, Declour J. 2012.
Biochemical characteristics of Trametes multicolor pyranose oxidase and Aspergillus niger glucose oxidase and impications or their unctionality in wheat lour dough. Food Chemistry. 131:1485-1492.
Fadhilah R. 2013. Biosensor glukosa menggunakan gdh-fad yang diimobilisasi pada nanopartikel zeolit secara elektrokimia [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Fiedurek J, Rogalski J, Lklezuk Z, Leonwicz A. 1986. Screening and mutagenesis of moulds for improvement of glucose oxidase production. Enzyme Microb Technol. 8: 734 – 736.
Firman P, Aryantha INP. 2003. Eksplorasi dan isolasi enzim gluksoa oksidase dari fungi imperfeksti (genus Penicilium dan Aspergillus) indigenus. Pertemuan Imnial Tahunan (PIT) Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia; Bandung 29-30 Agustus 2003.
Gradiniar RA. 2013. Pengaruh penambahan karbon terhadap sifat mekanik dan konduktivitas listrik komposit karbon/epoksi sebagai pelat bipolar polimer elektrolitmembran sel bahan bakar Polymer Exchange
