1 BAB I
PENDAHULUAN
Pemanfaatan bahan alam terutama tanaman banyak dilakukan di bidang kesehatan terutama untuk mengobati penyakit. Salah satu penyakit yang sedang dicari cara pengobatannya yang efektif adalah kanker.
Kanker merupakan masalah besar dunia, setiap tahun dijumpai hampir 6 juta penderita baru yang diketahui mengidap kanker dan lebih dari 4 juta diantaranya meninggal. Kematian akibat kanker mencakup 10% dari jumlah total kematian. Separuh dari mereka yang terserang kanker berada di negara berkembang (Anonim,1993). Walaupun usaha pengobatan kanker secara intensif telah dilakukan, namun hingga saat ini belum ditemukan obat yang dapat mengatasi penyakit tersebut secara memuaskan. Hal ini disebabkan terutama karena rendahnya selektivitas obat-obat antikanker yang digunakan ataupun karena patogenesis kanker itu sendiri belum jelas benar (Meiyanto dan Sugiyanto, 1997).
dapat dijumpai di berbagai organ dan jaringan tumbuhan, meliputi biji, buah segar, akar, daun, getah dan batang (Hartley et al, 1996).
RIPs, terutama RIPs tipe I (Holo-RIPs) mempunyai aktivitas RNA N-Glikosidase, imunosupresive, sitotoksik, abortifacient, antiviral dan pemotongan DNA superkoil untai ganda. Sedangkan RIPs tipe II memiliki aktivitas biologi sebagai RNA N-Glikosidase, sitotoksik dan pemotongan DNA superkoil (Stripe et al, 1992).
Pengujian terhadap aktivitas pemotongan DNA telah dilakukan oleh Indrayudha, dkk (2007) pada ekstrak gubal tanaman Jarak Pagar (Jatropa curcas L) yang berasal dari bagian biji. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak gubal biji pada kadar 9.67 µg/µl mampu memotong DNA superkoil untai ganda.
Terdapatnya aktivitas pemotongan DNA superkoil merupakan parameter awal terkandungnya RIPs pada suatu tanaman. Selanjutnya untuk memastikan keberadaan RIPs pada bagian tanaman tersebut maka akan dilakukan pemurnian terhadap protein yang diperoleh dengan cara fraksinasi dan kemudian diujikan kembali aktivitas pemotongan DNA-nya.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1993, Pereda Nyeri Kanker, Penerbit Institut Teknologi Bandung, Bandung, hal 1.
Anonim, 1999, Farmakologi dan Terapi, Edisi IV, Bagian Farmakologi Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta
Backer, C.A., Brink, B. V. D. Jr., 1965, Flora of Java N.V.P. Noordohf Groningen, The Netherland.
Barbieri, L., Batteli, M.g., Stripe, F., 1993, Ribosome Inactivating Proteins from Plants, Biochem et Biophys Acta. Vol 10, 405-410, cit Sulistyani, N Sismindari, Sudjadi, 2002, Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil oleh Fraksi-Fraksi Protein Daun Morinda citrifolia, Majalah Farmasi Indonesia, 13 (4), 174-179
Brown, T.A., 1991, Pengantar Kloning Gen, cetakan pertama diterjemahkan oleh Muhammad, S. A, Praseno, 11-16, Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta. Dalimartha, 2002, Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Kanker, Penebar
Swadaya, Jakarta
Dalimartha, 2003, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, Jilid II, Trubus Agriwidya, Jakarta
Dallal, J.A., Irwin, J.D., 1978, Enzymatic Inactivation of Eucaryotic Ribosomes by the Pokewed Antiviral Protein, FEBS Letter 89, 257-259
Davis ,L. G. , Kuehl W. M., Battey, J. F., 1994, Basic Method in Molecular Biology, Second Edition, Appleton & Large Norwalk, Connecticut.
Endo, Y., Mitsui, K., Motizuki, M., Tsurugi, K. 1987, The Mechanism of Action of Ricin and Related Toxic Lectins on Eukaryotic Ribosomes. the Site and the Characteristics of the Modification in 28S Ribosomal RNA Caused by the Toxins. J. Biol. Chem. 262,5908-5912.
Feinbaum, R., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons inc, 1.5.1-1.5.17, cit: Dewi Ngolady, 2000, Identifikasi Ribosome-Inactivating Protein dari Ekstrak Eubal Daun Cangkringan (Erythrina fusca Lour), Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
43 Hallek, M., Bersagel, P.L., Anderson, K., 1998, Multiple Myeloma : Increasing
Evidence for Multistep Transformation Process, Blood, 91, 3-21
Hartley M. R., Chaddock J. A., Bonnes M. S., 1996, The Structure and Function of Ribosome-Inactivating Proteins,Trends Plant Sci, Agustus, vol.1, No.8, 254-260,
Haryana,S, M, 1989, Petunjuk Laboratorium Rekayasa Genetika, Pusat Antar Studi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Indrayudha, P., Damayanti, T., Iravati, S, 2007, Identifikasi Ribosom Inactivating Proteins dari biji dan getah Jarak Pagar (Jatropa curcas L) Dengan Metode Pemotongan DNA Superkoil, Makalah Seminar Hasil Penelitian Program Pemetaan Pengembangan Obat Alam Indonesia, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta
Katzung, B., G., 1997, Farmakologi Dasar dan Klinik, diterjemahkan oleh Staf Dosen Farmakologi FKU UNSRI, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, 857-858
Kumar, M. A., Timm, D. E., Neet, K. E., Owen, W. G., Peumans, W. J., Rao, A. G. (1993) Characterization of the Lectin from the Bulbs of Eranthis Hyemalis (Winter Aconite) as an Inhibitor of Protein Synthesis. J. Biol. Chem. 268, 25176-25183).
Ling, J., Liu, W., Wang , TP., 1994, Cleavage of Supercoiled Double Stranded DNA by Several Ribosome inactivating Proteins in vitro, FEBS Letters vol. 345, 143-146.
Mahardika, W, 2003, Kursus Singkat Kultur Sel, Laboratorium Ilmu Hayati UGM, Yogyakarta
Meiyanto, E., dan Sugiyanto, 1997, Uji Toksisitas Beberapa Fraksi Ekstrak Etanol Daun Gynura procumbens [Lour] Merr terhadap Larva Udang [Artemia salina Leach], Majalah Farmasi Indonesia, 8, 42-49.
Meyer, B.M., Ferrigi, N.R., Putnam, J.G., Jacobsen, L.B., Nicols, D.E., Mc. Laughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp : A Convient General Bioassay for Active Plant Constituent, Planta Medica, 45, 31-34.
Mulatno, 2002, Seputar Teknologi Rekayasa Genetika, Pustaka Wira Usaha Mandiri, Bogor, 30-31, 38-39.
Mundy, G.R., Raisz, L.G., Cooper, R.A., Schecter, G.P., Salmon, S.E, 1974, Evidence for Secretion of An Osteoclast Stimulating Factor in Myeloma, N.Engl.J.M, 291, 1041
Pitot, H.C., 1993, The Moleculer Biology of Carsinogenesis, Cancer, 72, 962-970 Pratt, G, 2002, Molecular Aspect of Multiple Myeloma, Molecular Pathology, 55 Rino Rappuoli and Cesare Montecucco, 1997, Guidebook to Protein Toxin and
Their Use in Cell Biology, a Sambrook and Tooze Publication, at Oxford University Press.
Reinbothe, S., Reinbothe, C., Lehmann, J., Becker, W., Apel, K., Parthier, B. 1994, Jip60, a Methyl Jasmonate-Induced Ribosome-Inactivating Protein Involved in Plant Stress Reactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7012-7016.
Sambrook, Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Edisi 1, 2, 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA.
Sismindari dan Lord, J.M., 2000, Ribosome Inactivating Protein: RNA N-glycosidase Activity of Mirabilis jalapa L , Morinda citrifolia L dan Carica papaya L, Indon J Biotech. 324-345.
Soedibyo, M., 1998, Alam Sumber Kesehatan: Manfaat dan Kegunaan, Balai Pustaka, Jakarta, 265-266
Soeripto, 1997, Mekanisme Molekuler Karsinogenesis, Bagian Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, 38-42
Steenis, C. G. G. J. Van., 1997, Flora Untuk Sekolah Indonesia, Cetakan ke 7, PT. Padya Paramita, Jakarta Pusat.
Stripe F, Barbieri L, Battelli M. G. Soria M, Lappi D. A, 1992, Ribosome-Inactivating Proteins from Plants Present Status and Future Prospects.Bio. Technology vol 10 April 1992.
Sulistiyani N, Sismindari, Sudjadi. 2002, Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil oleh Fraksi-Fraksi Protein Daun Morinda Citrifolia, Majalah Farmasi Indonesia. 13 (4).174-179.
45 Willy J. Peumans, Qiang Hao And Els J. M. Van Damme1, 2001,
LAPORAN PENELITIAN
DOSEN MUDA
PENGEMBANGAN RIBOSOM INACTIVATING PROTEINS :
Aktivitas Fraksi Protein Biji Jarak Pagar (Jatropa curcas L)
Terhadap Pemotongan DNA Superkoil dan
Efek Sitotoksiknya pada Sel Myeloma
Oleh :
Peni Indrayudha, S.F., Apt
Maryati, M.Si, Apt
Dibiayai oleh
Direktorat Penelitian dan Pengabdian Masyarakat
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
Departemen Pendidikan Nasional RI
FAKULTAS FARMASI
RINGKASAN
Tanaman yang mengandung RIPs (Ribosome Inactivating Proteins)
dapat dikembangkan menjadi antikanker. Ekstrak gubal biji Jatropa curcas
diketahui mempunyai aktivitas memotong DNA superkoil untai ganda yang
merupakan parameter awal keberadaan RIPs pada kadar 9,67 µg/µl. Fraksinasi
ekstrak gubal dimaksudkan untuk memperoleh protein yang lebih murni.
Penelitian ini dilakukan untuk membuktikan aktivitas pemotongan DNA dan
aktivitas sitotoksik fraksi protein biji Jatropa curcas terhadap sel Myeloma terkait
aktivitas RIPs yang toksik terhadap sel kanker.
Uji aktivitas sitotoksik terhadap sel Myeloma dengan menggunakan
fraksi protein diawali dengan preparasi ekstrak gubal biji Jatropa curcas,
selanjutnya dilakukan fraksinasi bertingkat dengan ammonium sulfat. Hasil
fraksinasi diujikan pada pemotongan DNA pUC 19 dengan elektroforeses. Uji
sitotosik terhadap sel Myeloma dilakukan dengan metode MTT Assay. Analisis
akhir dilakukan dengan perhitungan nilai IC 50.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua fraksi protein biji mampu
memotong DNA. Aktivitas tertinggi ditunjukkan oleh fraksi protein biji Jatropa
curcas FP 60 dengan kadar 13,71 µg/µl. Fraksi protein FP 60 juga terbukti lebih toksik terhadap sel Myeloma dibandingkan dengan fraksi protein yang lain
dengan nilai IC
50 sebesar 11,99 µg/ml.
iv
SUMMARY
One of the examinations to know potency a crop can developed become
anticancer is given the existence of Ribosome Inactivating Proteins (RIPs). A
method to identify existence of RIP is cleavage of DNA. Seed crude extract of
Jatropa curcas has activity cleavage DNA at 9, 67 µg/µl. In this research, seed
extract purified to get protein fraction and then tested by cleavage DNA method
and its citotoxicity effect. The aim of this research wants to know protein fraction
activity of seed Jatropa curcas to cleavage DNA and its citotoxicity effect to
Myeloma cell.
Seed extract purified by Ammonium Sulphate to get Fraction-10,
Fraction-20, Fraction-40, Fraction-60, Fraction-80 and Fraction-100 saturation.
All of protein fraction added by DNA pUC 19. Then, DNA and protein fraction
was electrophoresis. Obtained data from result of activity test cleavage of DNA
analyzed qualitative by perceiving 3 criterions, that is: DNA super coil
attenuating, thick of nick circular DNA and forming of linear DNA. Citotoxicity
test was done with MTT assay to Myeloma cell and obtained with IC50 value.
Protein fractions Jatrop curcas from seed can cleavage DNA. Result of
research indicates that Protein Fraction-60 from seed at 13, 71 µg/µl have
activity to cleavage DNA be nick circular and linier. Protein fraction of seed was
proven toxic to Myeloma cell with highest value of LC
50 was 11,99 µg/ml.
KATA PENGANTAR
Alhamdulillahi Rabbil’aalamin, puji syukur ke hadirat Allah SWT atas
segala limpahan rahmat, hidayah, karunia dan nikmat yang diberikan-Nya,
sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dengan judul
PENGEMBANGAN RIBOSOM INACTIVATING PROTEINS : Aktivitas Fraksi
Protein Biji Jatropa curcas Terhadap Pemotongan DNA Superkoil dan Efek
Sitotoksiknya pada Sel Myeloma.
Selesainya penelitian ini tentunya tidak terlepas dari bantuan banyak
pihak, maka pada kesempatan ini dengan segala ketulusan dan kerendahan hati,
penulis ingin menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada berbagai
pihak.
Pertama kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi yang telah
membiayai penelitian ini dengan Program Penelitian Dosen Muda. Kepada Ibu
Ibu Dra Nurul Mutmainah, MSi, Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Muhammadiyah Surakarta.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Maryati, M.Si, Apt,
selaku mitra peneliti yang telah bekerja sama dalam penelitian ini. Terima kasih
banyak, semoga terkabul semua doa-doanya!
Kepada Bapak-Ibu Dosen Fakultas Farmasi UMS atas dukungannya,
khususnya kepada Bapak-Ibu di Bagian Biologi Farmasi lantai 3 tercinta. Kepada
para laboran: Mbak Nur Qomariah dan Mas Awang yang telah banyak membantu
hingga penelitian ini dapat terselesaikan. Terima kasih atas lemburnya dan terus
semangat.
Terima kasih banyak kepada Puji Lestari, Anggraini Puspitasari dan Siti
Muslimah yang telah membantu penelitian ini. Semoga menjadi farmasis yang
profesional dan Islami.
Terakhir, namun yang paling berharga terima kasih untuk Tri Yulianti,
M.Si, SF, Apt, atas pengertian dan kesabarannya, juga buat dua buah hatiku: Putri
vi
dihadirkannya. Cepat besar sayang dan semoga menjadi orang yang selalu dapat
membanggakan orang tua!. Serta kepada semua pihak yang tidak dapat penulis
sebutkan satu persatu, yang telah banyak membantu hingga terselesaikannya
penelitian ini.
Penulis menyadari bahwa penelitian ini tidak lepas dari kekurangan dan
jauh dari sempurna. Untuk itu dengan segala kerendahan hati penulis
mengharapkan kritik dan saran yang bermanfaat untuk keberlanjutan penelitian
ini. Demikian semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi perkembangan dan
kemajuan ilmu farmasi, khususnya bioteknologi.
Surakarta, Oktober 2008
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN PENGESAHAN………... i
RINGKASAN………... ... ii
SUMMARY... iii
KATA PENGANTAR………... .. iv
DAFTAR ISI………... vi
DAFTAR GAMBAR………... viii
DAFTAR TABEL………... ix
DAFTAR LAMPIRAN……….. x
BAB I. PENDAHULUAN……… 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Tanaman Jarak Pagar (Jatropa curcas) ……… 4
B. Ribosom Inactivating Proteins (RIPs)……….. 6
C. Plasmid ……….... .. 14
D. Kanker...………..….….... 17
E. cell line Myeloma... 20
BAB III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN A. Tujuan Penelitian………...…………. 22
B. Manfaat Penelitian………....…… 22
BAB IV. METODE PENELITIAN A. Kategori Penelitian……….………. 23
B. Variabel Penelitian……… ………..……… 23
C. Jalannya Penelitian………... 23
D. Teknik Analisis………... 30
BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Tanaman... ……….. 32
B. Preparasi Sampel Fraksi Protein Biji Jatropa curcas... 32
viii
D. Uji Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil... 36
E. Uji Sitotoksik dengan MTT Assay ... 38
BAB VI. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan……….. 41
B. Saran………... 41
DAFTAR PUSTAKA……….………... 42
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Model konformasi DNA……….. 15
Gambar 2. Elektromokrograf DNA……… 16
Gambar 3. Peta restrikasi plasmid pUC 19……… 16
Gambar 4. Jalannya Penelitian... 30
Gambar 5. Hasil Transformasi DNA pUC 19 ke E.coli DH5α… 35 Gambar 6. Elektroforegram aktivitas fraksi protein biji Jatropa curcas... 37
x
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Ribosome Inactivating Proteins tipe 1 ... 8
Tabel 2. Ribosome Inactivating Proteins tipe 2 ... 8
Tabel 3. Hasil Perhitungan Kadar Fraksi Protein biji Jatropa
curcas ……….... ... 34
Tabel 4. Harga purata presentase kematian sel Myeloma setelah
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Foto tanaman dan biji Jatropa curcas ... 46
Lampiran 2. Perhitungan kadar protein fraksi protein ……….. 47
RINGKASAN
LAPORAN PENELITIAN
DOSEN MUDA
PENGEMBANGAN RIBOSOM INACTIVATING PROTEINS :
Aktivitas Fraksi Protein Biji Jarak Pagar (Jatropa curcas L)
Terhadap Pemotongan DNA Superkoil dan
Efek Sitotoksiknya pada Sel Myeloma
Oleh :
Peni Indrayudha, S.F., Apt
Maryati, M.Si, Apt
Dibiayai oleh
Direktorat Penelitian dan Pengabdian Masyarakat
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
Departemen Pendidikan Nasional RI
FAKULTAS FARMASI
PENGEMBANGAN RIBOSOM INACTIVATING PROTEINS :
Aktivitas Fraksi Protein Biji Jarak Pagar (Jatropa curcas L)
Terhadap Pemotongan DNA Superkoil dan
Efek Sitotoksiknya pada Sel Myeloma
Peni Indrayudha, Maryati
Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta
Jl A Yani Tromol Pos I, Pabelan Kartasura Surakarta
E-mail: peni.indrayudha@gmail.com
RINGKASAN
Tanaman yang mengandung RIPs (
Ribosome Inactivating Proteins
) dapat
dikembangkan menjadi antikanker. Ekstrak gubal biji
Jatropa curcas
diketahui
mempunyai aktivitas memotong DNA superkoil untai ganda yang merupakan parameter
awal keberadaan RIPs pada kadar 9,67 µg/µl. Fraksinasi ekstrak gubal dimaksudkan
untuk memperoleh protein yang lebih murni. Penelitian ini dilakukan untuk membuktikan
aktivitas pemotongan DNA dan aktivitas sitotoksik fraksi protein biji
Jatropa curcas
terhadap sel Myeloma terkait aktivitas RIPs yang toksik terhadap sel kanker.
Uji aktivitas sitotoksik terhadap sel Myeloma dengan menggunakan fraksi
protein diawali dengan preparasi ekstrak gubal biji
Jatropa curcas
, selanjutnya dilakukan
fraksinasi bertingkat dengan ammonium sulfat. Hasil fraksinasi diujikan pada
pemotongan DNA pUC 19 dengan elektroforeses. Uji sitotosik terhadap sel Myeloma
dilakukan dengan metode MTT
Assay
. Analisis akhir dilakukan dengan perhitungan nilai
IC
50
.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua fraksi protein biji mampu
memotong DNA. Aktivitas tertinggi ditunjukkan oleh fraksi protein biji
Jatropa curcas
FP 60
dengan kadar 13,71 µg/µl. Fraksi protein FP 60 juga terbukti lebih toksik terhadap
sel Myeloma dibandingkan dengan fraksi protein yang lain dengan nilai IC
50
sebesar
11,99 µg/ml.
Kata kunci
: RIPs,
Jatropa curcas
, Fraksi Protein, Sel Myeloma.
SUMMARY
One of the examinations to know potency a crop can developed become
anticancer is given the existence of Ribosome Inactivating Proteins (RIPs). A method to
identify existence of RIP is cleavage of DNA. Seed crude extract of
Jatropa curcas
have
activity cleavage DNA at 9, 67 µg/µl. In this research, seed extract purified to get protein
fraction and then tested by cleavage DNA method and its citotoxicity effect. The aim of
this research wants to know protein fraction activity of seed
Jatropa curcas
to cleavage
DNA and its citotoxicity effect to Myeloma cell.
Seed extract purified by Ammonium Sulphate to get Fraction-10, Fraction-20,
Fraction-40, Fraction-60, Fraction-80 and Fraction-100 saturation. All of protein fraction
added by DNA pUC 19. Then, DNA and protein fraction was electrophoresis. Obtained
data from result of activity test cleavage of DNA analyzed qualitative by perceiving 3
criterions, that is: DNA super coil attenuating, thick of nick circular DNA and forming of
linear DNA. Citotoxicity test was done with MTT assay to Myeloma cell and obtained
with IC
50value.
Protein fractions from seed can cleavage DNA. Result of research indicates that
Protein Fraction-60 from seed at 13, 71 µg/µl have activity to cleavage DNA be nick
circular and linier. Protein fraction of seed was proven toxic to Myeloma cell with highest
value of LC
50
was 11,99 µg/ml.
