Isolasi Dan Analisis Komponen Kimia Dari Minyak Atsiri Daun Ruku-Ruku (Ocimum sanctum L.) Dengan Metode GC-MS

(1)

ISOLASI DAN ANALISIS KOMPONEN KIMIA DARI MINYAK ATSIRI DAUN RUKU-RUKU (Ocimum sanctum L.) DENGAN METODE GC-MS

SKRIPSI

LAPENRIS EDISON HUTAGALUNG 090822037

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

(2)

ISOLASI DAN ANALISIS KOMPONEN KIMIA DARI MINYAK ATSIRI DAUN RUKU-RUKU (Ocimum sanctum L.) DENGAN METODE GC-MS

SKRIPSI

Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains

LAPENRIS EDISON HUTAGALUNG 090822037

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

(3)

PERSETUJUAN

JUDUL : ISOLASI DAN ANALISIS KOMPONEN KIMIA DARI MINYAK ATSIRI DAUN RUKU-RUKU (Ocimum sanctum L.) DENGAN METODE GC-MS

Kategori : SKRIPSI

Nama : LAPENRIS EDISON HUTAGALUNG

Nomor Induk Mahasiswa : 090822037

Program : SARJANA (S1) KIMIA EKSTENSI

Departemen : KIMIA

Fakultas: : MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM (FMIPA) UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

Disetujui di

Medan, Agustus 2011

Komisi Pembimbing

Pembimbing I Pembimbing II

Lamek Marpaung,M.Phil.,Ph.D. Juliati Tarigan, S.Si, M.Si NIP : 195208281982031001 NIP : 197205031999032001

Diketahui/ Disetujui oleh

Departemen Kimia FMIPA USU Ketua,

(4)

PERNYATAAN

ISOLASI DAN ANALISIS KOMPONEN KIMIA KANDUNGAN MINYAK ATSIRI DARI DAUN RUKU-RUKU (Ocimun sanctum L.)

DENGAN CARA GC-MS

SKRIPSI

Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil kerja saya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.

Medan, Juli 2011

(5)

PENGHARGAAN

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, yang telah melimpahkan rahmat dan karunianya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan Sarjana Sains di Fakultas MIPA USU. Adapun judul skripsi ini adalah “ISOLASI DAN ANALISIS KOMPONEN

KIMIA KANDUNGAN MINYAK ATSIRI DARI DAUN RUKU-RUKU (Ocimun sanctum L.)

DENGAN CARA GC-MS. Pada kesempatan ini, perkenankanlah penulis untuk

menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Ibu Dr. Rumondang Bulan Nst, MS, selaku Ketua Departemen Kimia FMIPA USU

2. Bapak Lamek Marpaung,M.Phil.,Ph.D. dan Ibu Juliati Tarigan, S.Si, M.Si, selaku pembimbing penulis yang telah banyak meluangkan dan memberikan panduan serta pemikiran dan saran selama penulis melakukan penelitian dan penyusunan skripsi ini sehingga dapat selesai

3. Ketua dan sekretaris jurusan departemen kimia FMIPA USU Ibu Dr. Rumondang Bulan, MS dan Bapak Dr. Albert Pasaribu, M.Sc

4. Dekan FMIPA USU Bapak Dr. Sutarman

5. Bapak dan Ibu staf pengajar FMIPA USU serta staf pegawai di Jurusan kimia. 6. Sahabat-sahabat penulis :B’ Daniel, Dominka, dan Titis, yang telah

memberikan dukungan kepada penulis

7. Asisten Laboratorium Organik Robi dan Aspriadi, serta rekan-rekan Mahasiswa khususnya Kimia Ekstensi angkatan 2009.

Secara khusus penulis ingin menyampaikan terima kasih sebesar-besarnya kepada Ayahanda M. Hutagalung dan Ibunda R. Sipahutar yang senatiasa memberikan doa serta dukungan moril dan materil hingga akhirnya penulis menyelesaikan studi. Penulis juga mengucapkan banyak terima kasih kepada kakak saya Ledys, abang saya Harmoko, dan Alm. Bang Agus dan juga adek saya Marsal serta istimewa kepada adek Lusia Samosir yang selalu memberi dukungan kepada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.

Mengingat keterbatasan kemampuan dan waktu yang ada, penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, untuk itu segala saran dan kritik yang bersifat membangun demi perbaikan skripsi ini sangat diharapkan.

Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi pembaca sekalian.

Medan, Agustus 2011

(6)

Abstrak

(7)

ISOLATION AND CHEMICAL ANALYSIS OF COMPONENTS OF THE LEAF

ESSENTIAL OIL CONTENT RUKU-RUKU (Ocimun sanctum L.) WITH GC-MS

Abstract

Have done the isolation of essential oils from the leaves of sweet basil (Acimun

sanctum L.) through the distillation process Stahl. Sweet basil leaves distilled Stahl for

(8)

DAFTAR ISI

1.3 Tujuan Penelitian 2

1.4 Manfaat Penelitian 2

1.5 Metodologi Penelitian 2

1.6 Lokasi Penelitian 3

Bab 2. Tinjauan Pustaka

2.1 Minyak Atsiri 4

2.1.1 Sumber Minyak Atsiri 5

2.1.2 Penggunaan Minyak Atsiri 5

2.1.3 Isolasi Minyak Atsiri 5

2.1.4 Penyimpanan Minyak Atsiri 7

2.2 Daun Ruku-ruku 7

2.3 Analisis Komponen Kimia Minyak Atsiri dengan GC-MS 9

2.3.1 Kromatografi Gas 9

2.3.1.1 Gas Pembawa 9

2.3.1.2 Sistem Injeksi 10

2.3.1.3 Kolom 10

2.3.1.4 Fase Diam 10

2.3.1.5 Suhu 11

2.3.1.6 Detektor 11

2.3.2 Spektrofotometri Massa 11

2.3.2.1 Spektrum Massa 13

2.3.2.2 Penentuan Rumus Molekul 13

2.3.2.3 Penegenalan Ion Puncak Molekul 13 2.3.2.4 Kaidah Umum Untuk Mengenali Puncak-puncak 14 Dalam Spektra

Bab 3. Metodologi Penelitian

3.1 Alat-alat 16

3.2 Bahan-bahan 16

3.3 Prosedur Penelitian 17

(9)

3.3.2 Isolasi Minyak Atsiri Daun Ruku-ruku dengan Alat 17 Destilasi Stahl

3.4 Bagan Penelitian 18

Bab 4. Hasil dan Pembahasan

4.1 Hasil Penelitian 19

4.1.1 Penentuan Kadar Minyak Atsiri 19

4.1.2 Hasil Analisis dengan GC-MS 19

4.1.3 Hasil Analisis dengan FT-IR 21

4.2 Pembahasan 22

4.2.1 Penentuan Kadar Minyak Atsiri 22

4.2.2 Analisis Minyak Atsiri Daun Ruku-ruku 23 Bab 5. Kesimpulan dan Saran

5.1 Kesimpulan 33

5.2 Saran 33

Daftar Pustaka

(10)

DAFTAR TABEL

Halaman

(11)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1. Daun Ruku-ruku 8

Gambar 4.1. Kromatogram Minyak Atsiri Daun Ruku-ruku 20 Gambar 4.2. Spektrum FT-IR Minyak Atsiri Daun Ruku-ruku 22 Gambar 4.3. Spektrum Massa Minyak Atsiri Daun Ruku-ruku

Dengan RT. 6,542 24

Gambar 4.4. Spektrum Massa Minyak Atsiri Daun Ruku-ruku

Dengan RT. 6,933 25

Dengan RT. 7,642 25

Dengan RT. 8,992 26

Dengan RT. 15,475 28

Dengan RT.15,725 31

(12)

Abstrak

(13)

ISOLATION AND CHEMICAL ANALYSIS OF COMPONENTS OF THE LEAF

ESSENTIAL OIL CONTENT RUKU-RUKU (Ocimun sanctum L.) WITH GC-MS

Abstract

Have done the isolation of essential oils from the leaves of sweet basil (Acimun

sanctum L.) through the distillation process Stahl. Sweet basil leaves distilled Stahl for

(14)

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Indonesia merupakan negara yang cukup berpotensi dalam produksi minyak atsiri. Penggunaan minyak atsiri dari bahan alam sebagai obat semakin diminati masyarakat, seiring dengan gerakan “kembali ke alam”(back to nature) yang dilakukan masyarakat. Tanaman obat makin penting peranannya dalam pola konsumsi makanan, minuman, dan obat-obatan. Menurut Tim Penulis Martha Tilaar Center (2002) dengan meningkatnya kesadaran manusia terhadap pemanfaatan sumber daya alam tersebut, maka pemanfaatan produk herbal semakin berkembang tidak hanya di

negara-negara Timur saja, melainkan sudah merambah ke negara-negara Barat. Hal ini tampak dari data WHO yang menunjukkan bahwa permintaan roduk herbal di negara-negara Eropa dalam kurun waktu 1999 – 2004 diperkirakan mencapai 66% dari permintaan dunia. Minyak atsiri dikenal dengan nama minyak eteris atau minyak terbang (essential oil, volatile) yang merupakan salah satu hasil metabolisme tanaman. Bersifat mudah menguap pada suhu kamar, mempunyai rasa getir, serta berbau wangi sesuai dengan bau tanaman penghasilnya. Minyak atsiri larut dalam pelarut organik dan tidak larut dalam air (Sudaryani dan sugiharti, 1990).

Minyak atsiri pada industri banyak digunakan sebagai bahan pembuat kosmetik, parfum, antiseptik dan lain-lain. Beberapa jenis minyak atsiri mampu bertindak sebagai bahan terapi (aromaterapi) atau bahan obat suatu jenis penyakit. Fungsi minyak atsiri sebagai bahan obat tersebut disebabkan adanya bahan aktif, sebagai contoh bahan antiradang, hepatoprotektor, analgetik, anestetik, antiseptik, psikoaktif dan anti bakteri (Agusta, 2000).

(15)

Tumbuhan ruku-ruku (Ocimun Sanctum L.) secara tradisional banyak digunakan sebagai obat kencing manis, sariawan, kurang darah, malaria dan beri-beri, batuk, perut nyerih dan bumbu masak (Anonim, 1986). Di Indonesia air rebusan ruku-ruku

digunakan sebagai obat kolera, diare, sistem pencernaan, demam dan sakit kepala (Perry, 1980). Salah satu zat aktif yang dikandung oleh daun ruku-ruku adalah minyak atsiri disebut juga dengan minyak eteris (Chaudhri, 1996).

Minyak atsiri dari daun ruku-ruku sudah pernah didestilasi secara

hidrodestilasi dengan menggunakan alat stahl oleh Marianne dan Kasmirul Ramlan Sinaga, dimana daun ruku-ruku yang digunakan dalam keadaan kering dan telah dilakukan uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus.

Berdasarkan hal diatas, peneliti tertarik untuk mengisolasi dan mengetahui komponen senyawa-senyawa kimia apa yang terdapat pada minyak atsiri daun ruku-ruku yang masih basah

1.2. Permasalahan

Komponen senyawa-senyawa kimia apa sajakah yang terkandung pada minyak atsiri daun ruku-ruku

1.3. Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui komponen senyawa-senyawa kimia yang terkandung pada minyak atsiri daun ruku-ruku.

1.4. Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumber informasi ilmiah pada bidang kimia bahan alam hayati dan farmasi dalam pengembangan senyawa kimia bahan alam khususnya minyak atsiri yang terkandung dalam daun ruku-ruku.

1.5. Metodologi Penelitian

(16)

1.6. Lokasi Penelitian

1.Tempat Pengambilan Sampel

Sampel yang digunakan diperoleh dari daerah Tapanuli Tengah Provinsi

Sumatera Utara.

2.Tempat Melakukan Penelitian

Penelitian dilakukan di laboratorium Kimia Organik FMIPA USU-MEDAN Dan FMIPA UGM YOGYAKARTA.

(17)

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Minyak Atsiri

Minyak atsiri sangat penting sebagai sumber rasa dan obat. Minyak atsiri digunakan untuk memberi rasa dan aroma makanan, minuman, parfum dan kosmetik.

Sifat toksik alami minyak atsiri berguna dalam pengobatan dan minyak atsiri telah lama dikenal sebagai sumber terapi yang penting, misalnya sebagai senyawa anti mikroba (Setyawan, 2002)

Pada dasarnya semua minyak atsiri mengandung campuran senyawa kimia dan biasanya campuran tersebut sangat kompleks. Beberapa tipe senyawa organik mungkin terkandung dalam minyak atsiri, seperti hidrokarbon, alkohol, oksida, ester, aldehida, dan eter. Sangat sedikit sekali yang mengandung satu jenis komponen kimia yang persentasenya sangat tinggi. Yang menentukan aroma minyak atsiri biasanya komponen yang persentasenya tinggi. Walaupun begitu, kehilangan satu komponen yang persentasenya kecil pun dapat memungkinkan terjadinya perubahan aroma minyak atsiri tersebut (Agusta, 2000).

Minyak atsiri dapat dibagi menjadi dua kelompok. Pertama, minyak atsiri yang dengan mudah dapat dipisahkan menjadi komponen-komponen atau penyusun murninya. Komponen-komponen ini dapat menjadi bahan dasar untuk diproses menjadi produk-produk lain. Contoh kelompok pertama ini adalah : minyak sereh minyak daun cengkeh, minyak permen, dan minyak terpentin. Biasanya komponen

utama yang terdapat dalam minyak atsiri tersebut dipisahkan atau diisolasi dengan penyulingan bertingkat atau dengan proses kimia yang sederhana. Pada saat isolasi dengan penyulingan bertingkat selalu dilakukan dalam keadaan vakum. Hal ini dikerjakan untuk menghindari terjadinya isomerisasi,, polimerisasi atau peruraian.

(18)

2.1.1. Sumber Minyak Atsiri

Minyak atsiri merupakan salah satu hasil akhir proses metabolisme sekunder dalam tumbuhan. Tumbuhan penghasil minyak atsiri antara lain termasuk famili

Pinaceae, Labiatae, Compositae, Myrtaceae, Rutaceae, Piperaceae, Zingiberaceae.

Umbilliferae dan Gramineae. Minyak atsiri terdapat pada setiap bagian tumbuhan

yaitu di daun, bunga, biji, batang, kulit, dan akar. (Ketaren, 1985).

2.1.2. Penggunaan Minyak Atsiri

Minyak atsiri digunakan sebagai bahan baku dalam berbagai industri, misalnya industri farfum, kosmetik, “essence”, industri farmasi dan “flavorong agent”. Dalam pembuangan parfum dan wangi-wangian minyak atsiri tersebut berfugsi sebagai zat pewangi. Beberapa jenis minyak atsiri dapat digunakan sebagai zat pengikat bau

(fixative) dalam farfum, misalnya minyak nilam, minyak akar wangi dan minyak

cendana. Minyak atsiri yang berasal dari rempah-rempah, misalnya minyak lada, minyak kayu manis, minyak jahe, minyak cengkeh, minyak ketumbar, umumnya digunakan sebagai bahan penyedap (flavoring agent) dalam bahan pangan dan minuman (Ketaren, 1985).

Minyak atsiri ini selain memberikan aroma wangi yang menyenangkan juga dapat membantu pencernaan dengan merangsang sistem saraf sekresi, sehingga akan meningkatkan sekresi getah lambung yang mengandung enzim hanya oleh stimulus aroma dan rasa bahan pangan. Selain itu juga dapat merangsang keluar cairan getah sehingga ronga mulut dan lambung menjadi basah.

Beberapa jenis minyak atsiri digunakan sebagai bahan antiseptik internal atau

eksternal, bahan anal gesik, naeolitik atau sebagai antizimatik, sebagai sedative dan stimulan untuk obat sakit perut. Minyak atsiri mempunyai sifat membius, merangsang atau memuaskan (Guenther, 1987).

2.1.3. Isolasi Minyak Atsiri

(19)

Destilasi melepaskan uap air pada sebuah zat yang tercampur yang kaya dengan komponen yang mudah menguap daripada zat tersebut ( Pasto, 1992).

Proses penyulingan sangat penting diketahui oleh para penghasil minyak

atsiri. Pada dasarnya terdapat dua jenis penyulingan.

1. Penyulingan suatu campuran yang berujud cairan yang tidak saling bercampur, hingga membentuk dua fasa atau dua lapisan. Keadaan ini terjadi pada pemisahan minyak atsiri dengan uap air. Penyulingan dengan uap air sering disebut juga

hidrodestilasi. Pengertian umum ini memberikan gambaran bahwa penyulingan dapat dilakukan dengan cara mendidihkan bahan tanaman atau minyak atsiri dengan air. Pada proses ini akan dihasilkan uap air yang dibutuhkan oleh alat penyuling. Uap air tersebut dapat juga dihasilkan dari alat pembangkit uap air yang terpisah.

2. Penyulingan suatu cairan yang tercampur sempurna hingga hanya membentuk satu fasa. Pada keadaan ini pemisahan minyak atsiri menjadi beberapa komponennya, sering disebut fraksinasi, tanpa menggunakan uap air.

Minyak atsiri, minyak mudah menguap, atau minyak terbang merupakan campuran dari senyawa yang berwujud cairan atau padatan yang memiliki komposisi maupun titik didih yang beragam, penyulingan dapat didefenisikan sebagai proses pemisahan komponen-komponen suatu campuran yang terdiri atas dua cairan atau lebih berdasarkan perbedaan titik didih komponen-komponen senyawa tersebut. Proses penyulingan sangat penting diketahui oleh para penghasil minyak atsiri. Penyulingan suatu campuran yang berwujud cairan yang tidak saling bercampur, hingga membentuk dua fase atau dua lapisan. Keadaan ini terjadi pada pemisahan minyak atsiri dengan uap air. Penyulingan dengan uap air sering disebut

hidrodestilasi. Pengertian umum ini memberikan gambaran bahwa penyulingan dapat

dilakukan dengan cara mendidihkan bahan tanaman atau minyak atsiri dengan air. Pada proses ini akan dihasilkan uap air yang dibutuhkan oleh alat penyuling.

Dalam pengertian industri minyak atsiri dibedakan tiga tipe hidrodestilasi, yaitu:

1.Penyulingan Air

(20)

2.Penyulingan uap dan air

Bahan tanaman yang akan diperoses secara penyulingan uap dan air ditempatkan dalam suatu tempat yang bagian bawah dan tengah berlobang-lobang

yang ditopang di atas dasar alat penyulingan. Bagian bawah alat penyulingan diisi air sedikit di bawah dimana bahan ditempatkan. Bahan tanaman yang akan disuling hanya terkena uap, dan tidak terkena air yang mendidih.

3.Penyulingan uap

Uap yang digunakan lazim memilliki tekanan yang lebih besar daripada tekanan atmosfer dan dihasilkan dari hasil penguapan air yang berasal dari suatu pembangkit uap air. Uap air yang dihasilkan kemudian dimasukkan ke dalam alat penyulingan. Pada dasarnya tidak ada perbedaan yang menyolok pada ketiga alat penyulingan tersebut. Namun demikian pemilihan tergantung pada cara yang digunakan, karena reaksi tertentu dapat terjadi selama penyulingan (Sastrohamidjojo, 2004).

2.1.4. Penyimpanan Minyak Atsiri

Pada proses penyimpanan minyak atsiri dapat mengalami kerusakan yang diakibatkan oleh berbagai proses, baik secara kimia maupun secara fisika. Biasanya kerusakan disebabkan oleh reaksi-reaksi yang umum seperti oksidasi, resinifikasi, polimerisasi, hidrolisis ester dan intraksi gugus fungsional. Proses tersebut dipercepat (diaktivasi) oleh panas, adanya udara (oksigen), kelembaban, serta dikatalisis oleh cahaya dan pada beberapa kasus kemungkinan dikatalis oleh logam (Guenther, 1987).

2.2. Daun Ruku-ruku

Tumbuhan ruku-ruku (Ocimum Sanctum L.) family Labiatea termasuk perdu, biasanya bercabang banyak dan mempunyai bau khas yang aromatis, rasa agak pedas. Warnanya hijau hingga hijau kecoklatan (Dirtjen POM, 2000).

Tanaman Ruku-Ruku (Ocimum sanctum L.) termasuk tanaman perdu yang

(21)

Gambar 2.1. Daun Ruku-ruku

Aroma segar yang ditimbulkan dari daun ruku-ruku dapat mengurangi aroma amis pada olahan ikan, udang, daging maupun ayam. Biasanya digunakan dalam bentuk segar, pilih daun mudanya, cuci bersih. Masukkan ke dalam masakan beberapa saat sebelum hidangan diangkat. Teks & Foto: Budi Sutomo.

budiboga.blogspot.com/.../mengenal-bumbu-masakan-nusantara

berkuah, terutama masakan dengan bahan ikan. Penggunaannya cukup dengan memasukkan beberapa helai daun ruku-ruku segar ke dalam masakan. Makanan yang menggunakan bumbu ini kebanyakan masakan yang berasal dari daerah Sumatera, seperti masakan Padang atau Minang. Daun ini termasuk varietas namun ukurannya lebih kecil. Sedangkan warnanya ada yang hijau dan ungu.

Di Sumatera, tanaman ini banyak ditanam sebagai tanaman pagar di halaman rumah. Di daerah lain tanaman ini jarang ditemukan karena tidak populer untuk

dibudidayakan meski sebenarnya ia cukup mudah untuk hidup di Indonesia.

(22)

2.3. Analisa Komponen Kimia Minyak atsiri dengan GC - MS

2.3.1. Kromatografi Gas

Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase bergerak (Yazid, 2005). Dalam kromatografi gas, fase bergeraknya adalah gas dan zat terlarut terpisah sebagai uap. Pemisahan tercapai

dengan partisi sampel antara fase gas bergerak dan fase diam berupa cairan dengan titik didih tinggi (tidak mudah menguap) yang terikat pada zat padat penunjangnya (Khopkar, 2003).

Dalam teknik kromatografi, semua pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari masing-masing komponen di antara kedua fase tesebut. Senyawa atau komponen yang tertahan (terhambat) lebih lemah oleh fase diam akan bergerak lebih cepat daripada komponen yang tertahan lebih kuat. Perbedaan gerakan antara komponen yang satu dengan yang lainnya disebabkan oleh perbedaan dalam adsorbs, partisi, kelarutan atau penguapan diantara kedua fase. Jika perbedaan-perbedaaan ini cukup besar, maka akan terjadi pemisahan secara sempurna (Yazid, 2005).

Sekarang ini sistem GC-MS sebagian digunakan sebagai peran utama untuk analisa makanan dan aroma, petroleum, petrokimia dan zat-zat kimia di laboratorium. Kromatografi gas merupakan kunci dari suatu teknik anlitik dalam pemisahan komponen mudah menguap, yaitu dengan mengkombinasikan secara cepat analisa sehingga pemecahan yang tinggi mengurangi pengoperasian. Keuntungan dari kromatografi gas adalah hasil kuantitatif yang bagus dan harganya lebih murah.

Sedangkan kerugiannya tidak dapat memberikan indentitas atau struktur untuk setiap puncak yang dihasilkan dan pada saat proses karakteristik yang didefenisikan sistem tidak bagus (Mcnair, 2009).

2.3.1.1. Gas Pembawa

Gas pembawa yang paling sering dipakai adalah helium (He), argon (Ar), nitrogen (N2), hidrogen (H2), dan karbondioksida (CO2). Keuntungannya adalah

(23)

lain, harus inert (tidak bereaksi dengan sampel, pelarut sampel, material dalam kolom), murni, dan mudah diperoleh (Agusta, 2000).

2.3.1.2. Sistem Injeksi

Lubang injeksi didesain untuk memasukkan sampel secara cepat dan efesien. Pada dasarnya, ada 4 jenis injector pada kromatografi gas, yaitu :

a. Injeksi langsung (direct injection), yang mana sampel yang diinjeksikan akan

diuapkan dalam injector yang panas dan 100% masuk menju kolom.

b. Injeksi terpecah (split injection), yang mana sampel yang diinjeksikan diuapkan dalam injector yang panas dan selanjutnya dilakukan pemecahan. c. Injeksi tanpa pemecahan (splitness injection), yang mana hampir semua

sampel diuapkan dalam injector yang panas dan dibawa ke dalam kolom karena katup pemecah ditutup; dan

d. Injeksi langsung ke kolom (on colum injection), yang mana ujung semprit dimasukkan langsung ke dalam kolom.

Teknik injeksi langsung ke dalam kolom digunakan untuk senyawa-senyawa yang mudah menguap, karena kalau penyuntikkannya melalui lubang suntik, dikawatirkan akan terjadi peruraian senyawa tersebut karena suhu yang tinggi (Rohman, 2009)

2.3.1.3. Kolom

Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen sentral pada

kromatografi gas (Rohman, 2009). Keberhasilan suatu proses pemisahan terutama ditentukan oleh pemilihan kolom. Kolom dapat terbuat dari tembaga, baja tahan karet, aluminium, atau gelas. Kolom dapat berbentuk lurus,melengkung,atau gulungan spiral sehingga lebih menghemat ruang (Agusta, 2000).

2.3.1.4. Fase Diam

(24)

sedikit polar, setengah polar (semi polar), dan sangat polar. Berdasarkan sifat minyak atsiri yang non polar sampai sedikit polar, untuk keperluan analisis sebaiknya digunakan kolom dalam fase diam yang bersifat sedikit polar. Jika dalam analisis

minyak atsiri digunakan kolom yang lebih polar, sejumlah puncak yang dihasilkan menjadi lebar (lebih tajam) dan sebagai puncak tersebut juga membentuk ekor. Begitu juga dengan garis dasarnya tidak rata dan terlihat bergelombang. Bahkan kemungkinan besar komponen yang bersifat nonpolar tidak akan terdeteksi sama

sekali (Agusta, 2000).

2.3.1.5. Suhu

Suhu merupakan salah satu faktor utama yang menentukan hasil analisis kromatografi gas dan spektrometri massa. Umumnya yang sangat menentukan adalah pengaturan suhu injektor dan kolom. Kondisi analisis yang cocok sangat bergantung pada komponen minyak atsiri yang akan dianalisis. (Agusta, 2000).

2.3.1.6. Detektor

Detektor merupakan perangkat yang diletakkan pada ujung kolom tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang membawa komponen hasil pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di dalamnya menjadi sinyal elektronik. Sinyal elektronik detektor akan sangat berguna untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif terhadap komponen-komponen yang terpisah di antara fase diam dan fase gerak (Rohman, 2009).

2.3.2. Spektrofotometri Massa

Pemboman molekul oleh sebuah arus elektron pada energi mendekati 70 elektron volt dapat menghasilkan banyak perubahan pada struktur molekul. Salah satu

(25)

Pada sistem GC-MS ini, yang berfungsi sebagai detektor adalah spektrometer massa itu sendiri yang terdiri dari sistem analisis dan sistem ionisasi, dimana Electron

Impact ionization (EI) adalah metode ionisasi yang umum digunakan (Agusta, 2000).

Spektrometer massa pada umumnya digunakan untuk : 1. Menentukan massa suatu molekul

2. Menentukan rumus molekul dengan menggunakan Spektrum Massa Beresolusi Tinggi (High Resolution Mass Spectra)

3. Mengetahui informasi dari struktur dengan melihat pola frakmentasinya

Ketika uap suatu senyawa dilewatkan dalam ruang ionisasi spektrometer massa, maka zat ini dibombardir atau ditembak dengan elektron. Elektron ini mempunyai energi yang cukup untuk melemparkan elektron dalam senyawa sehingga akan memberikan ion positif, ion ini disebut dengan ion molekul (M+). Ion molekul cenderung tidak stabil dan terpecah menjadi frakmen-frakmen yang lebih kecil. Frakmen-frakmen ini yang akan menghasilkan diagram batang (Dachriyanus,2004).

Spektrometer mampu menganalisis cuplikan yang jumlahnya sangat kecil dan menghasilkan data yang berguna mengenai struktur dan indentitas senyawa organik. Jika efluen dari kromatofrafi gas diarahkan ke spektrometer massa, maka informasi mengenai struktur untuk masing-masing puncak pada kromatogram dapat diperoleh. Karena laju aliran yang rendah dan ukuran cuplikan yang kecil, cara ini paling mudah diterapkan pada kolom kromatografi gas kapiler. Cuplikan disuntikkan ke dalam kromatografi gas dan terkromatografi sehingga semua komponenya terpisah. Spektrum massa diukur secara otomatis pada selang waktu tertentu atau pada maksimum atau tengah-tengah puncak ketika keluar dari kolom. Kemudian data

disimpan di dalam komputer, dan daripadanya dapat diperoleh hasil kromatogram disertai integrasi semua puncak. Disamping itu, kita dapat memperoleh spektrum massa masing-masing komponen. Spektrum ini dapat dipakai pada indentifikasi senyawa yang pernah diketahui dan sebagai sumber informasi struktur dan bobot

molekul senyawa baru (Gritter, 1991).

(26)

2.3.2.1. Spektrum Massa

Spektrum massa biasa diambil pada energi berkas elektron sebesar 70 elektron volt. Kejadian tersederhana ialah tercampaknya satu elektron dari molekul dalam fasa

gas oleh sebuah elektron dalam berkas elektron dan membentuk suatu ion molekul yang merupakan suatu kation radikal (M+).

Suatu spektrum massa menyatakan massa sibir bermuatan positif terhadap kepekaan (konsentrasi) nisbinya. Puncak paling kuat (tinggi) pada spektrum disebut

puncak dasar (base peak), dinyatakan dengan nilai 100% dan kekuatan (tinggi x faktor kepekaan) puncak-puncak lain, termasuk puncakion molekulnya, dinyatakan sebagai persentasi puncak dasar tersebut.

Puncak ion molekul biasanya merupakan puncak-puncak dengan bilangan massa tertinggi, kecuali jika terdapat puncak-puncak isotop. Puncak-puncak isotop ada karena sejumlah molekul tertentu mengandung isotop lebih berat dari isotopnya yang biasa.

2.3.2.2. Penentuan Rumus Molekul

Penentuan rumus molekul yang mungkin dari kekuatan puncak isotop hanya dapat dilakukan jika puncak ion molekul termaksut cukup kuat hingga puncak tersebut dapat diukur dengan cermat sekali.

Misalnya suatu senyawa mengandung 1 atom karbon. Maka untuk tiap 100 molekul yang mengandung satu atom C, sekitar 1,08% molekul mengandung satu atom C. karenanya molekul-molekul ini akan menghasilkan sebuah puncak M + 1 yang besarnya 1,08% kuat puncak ion molekulnya; sedangkan atom-atom H yang ada

akan memberikan sumbangan tambahan yang amat lemah pada puncak M + 1 itu. Jika suatu senyawa mengandung sebuah atom sulfur, puncak M + 2 akan menjadi 4,4% puncak induk.

2.3.2.3. Pengenalan Puncak Ion Molekul

Ada dua yang menyulitkan pengidentifikasian puncak ion molekul yaitu :

(27)

2. Ion molekul nampak tetapi cukup membingungkan karena terdapatnya beberapa puncak yang sama atau lebih menonjol. Dalam keadaan demikian, pertama-tama soal kemurnian harus dipertanyakan. Jika senyawa memang sudah murni, masalah

yang lazim ialah membedakan puncak ion molekul dari puncak M-1 yang lebih menonjol. Satu cara yang bagus ialah dengan mengurangi energi erkas elektron penembak medekati puncak penampilan.

Kuat puncak ion molekul pada kemantapan ion molekul. Ion-ion molekul paling

mantap adalah dari sistem aromatik murni. Secara umum golongan senyawa-senyawa berikut ini akan memberikan puncak-puncak ion menonjol : senyawa aromatik (alkana terkonyugasi), senyawa lingkar sulfida organik (alkana normal, pendek), merkaptan. Ion molekul biasanya tidak nampak pada alkohol alifatik, nitrid, nitrat, senyawa nitro, nitril dan pada senyawa-senyawa bercabang. Puncak-puncak dalam arah M-3 sampai M-14 menunjukkan kemungkinan adanya kontaminsi.

2.3.2.4. Kaidah Umum Untuk Mengenali Puncak-Puncak Dalam Spektra

Sejumlah kaidah umum mengenali puncak-puncak menonjol dalam spektra dampak elektron dapat ditulis dan dipahami dengan memakai konsep-konsep baku kimia organik fisik :

1. Tinggi nisbi puncak ion molekulterbesar bagi senyawa rantai lurus dan akan menurun jika derajat percabangannya bertambah.

2. Tinggi nisbi puncak ion molekul biasanya makin kecil dengan bertambahnya bobot molekul deret homolog; kecuali untuk ester lemak.

3. Pemecahan/pemutusan cendrung terjadi pada karbon tergantu gugus alkil : makin terganti gugus, makin mudah terputus. Hal ini merupakan akibat lebih mantapnya

karboksasi tersier daripada sekunder yang lebih mantap daripada yang primer. 4. Adanya ikatan rangkap, struktur lingkar dan terlebih-lebih cincin aromatik (atau

heteroatom) memantapkan ion molekul hingga meningkatkan pembentukannya. 5. Ikatan rangkap mendukung pemecahan adil dan menghasilkan ion karbonium alil.

6. Cincin jenuh cendrung melepas rantai, samping pada ikatan-α. Hal ini tidak lain daripada kejadian khusus percabangan. Muatan positif cendrung menyertai sibir cincin. Cincin tak jenuh dapat mengalami reaksi retro Diels-Alder.

(28)

8. Ikatan C-C yang bersebelahan dengan netroatom cenderung terpecah, meninggalkan muatan pada sibiran yang mengandung heteroatom yang elektron tak-ikatannya menciptakan kemantapan talunan.

(29)

BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat-alat

Alat stahl

GC-MS Shimadzu

Spektrofotometri Inframerah (FT-IR) Shimadzu Belender

Gelas ukur 100 ml Pyrex

Gelas erlenmeyer 250 ml Pyrex

Gelas ukur 100 ml Pyrex

Labu destilasi 1000 ml Pyrex

Pipet tetes Hot plate stirer Aluminium foil Neraca analitis Spatula

Syrings

3.2 Bahan-bahan

Daun Ruku-ruku

Na2SO4 anhidrat p.a. Merck

Alkohol 70%

(30)

3.3Prosedur Penelitian 3.3.1 Persiapan Sampel

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah daun ruku segar. Daun

ruku-ruku segar diperoleh dari kabupaten Tapanuli Tengah dengan Kriteria warna hijau tua

Sebanyak 200 gram daun ruku-ruku segar yang telah di sortir dan dipotong dengan

ukuran yang cukup kecil dan diblender hingga halus dengan penambahan aquades 200

ml dan kemudian dimasukkan ke dalam labu alas ukuran 1000 ml.

3.3.2 Isolasi Minyak Atsiri Daun Ruku-ruku Dengan Alat Destilasi Stahl

Dirangkai alat destilasi stahl dan labu alas yang didalamnya sudah terdapat 200 gram

daun ruku-ruku halus. Kemudian proses destilasi dilakukan pada suhu 110 – 115 C

selama 4-5 jam . Dengan cara yang sama dilakukan perlakuan untuk daun ruku-ruku

yang lain. Minyak atsiri yang masih bercampur dengan air, dipisahkan dengan cara

sirkulasi kembali ke labu alas. Minyak atsiri yang diperoleh ditambahkan dengan

Na2SO4 anhidrat, kemudian dipisahkan dengan menggunakan Siryng 1 ml dan minyak

yang diperoleh detentukan persentasinya. Untuk selanjutnya dianalisis komponen

senyawa kimia yang terkandung di dalamnya dengan menggunakan GC-MS dan

(31)

3.4 Bagan Penelitian

← Dipotong potong dengan ukuran yang cukup kecil ← Dihaluskan dengan Blender dengan penambahan 200 ml

air

← Dimasukkan kedalam labu alas 1000 ml ← Dirangkai alat destilasi stahl

←Dipanaskan pada suhu 110 - 115 0 C selama 4-5 jam

← Air destilat dialirkan secara kontiniu ke labu alas

←Ditampung di botol vial ←Ditambahkan Na2SO4 anhidrat

←Didiamkan ←Dipisahkan

200 gram daun ruku-ruku segar

Lapisan Atas _{Lapisan Bawah}

Lapisan minyak atsiri dan air

Na2SO4 hidrat

Minyak atsiri

(32)

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian

4.1.1. Penentuan Kadar Minyak Atsiri

Sampel daun Ruku-ruku basah yang digunakan sebanyak 1000 gram. Setelah didestilasi dengan alat stahl diperoleh minyak atsiri sebesar 2,5 ml. kadar minyak

atsiri daun ruku-ruku (Acimun sanctum L. ) yang diperoleh 0,25 %.

4.1.2. Hasil GC – MS

Minyak atsiri yang dihasilkan secara hidrodestilasi menggunakan alat sthal dari daun ruku-ruku dianalisis dengan Gas Chromatography – Mass Spectroscopy ( GC – MS). Data hasil analisis, didapat data kromatogram GC dari minyak atsiri dari daun ruku-ruku hasil destilasi uap adalah sebanyak 17 puncak ( gambar 4.1) dimana hanya 9 puncak yang dicetak dan disesuaikan dengan data library Wiley 229 karena memiliki persentase terbesar, sedangkan 8 puncak lain tidak dicetak karena persentasinya sangat kecil. Adapun kromatogram GC-MS adalah seperti di bawah ini :

(33)

(34)

4.2. Hasil Analisis dengan FT-IR

(35)

Hasil analisis gugus fungsi dengan spektrofotometer inframerah (FT-IR) dari minyak atsiri daun ruku-ruku menghasilkan pita-pita serapan pada bilangan gelombang (cm-1) sebagai berikut :

1. Pada bilangan gelombang 3070,68 cm-1 puncak lemah menunjukkan adanya vibrasi streching C-H sp2

2. Pada bilangan gelombang 2931,80 cm-1 dan 2831,50 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi streching C-H sp3

3. Pada bilangan gelombang 1635,64 cm-1, 1589,34 cm-1 dan 1512,19 cm-1 puncak aromatik dan senyawa rantai terbuka menunjukkan adanya vibrasi streching rangkap C=C

4. Pada bilangan gelombang 1458,18 cm-1 dan 1327,03 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi bending C-H sp3

5. Pada bilangan gelombang 1257,59 – 1033,85 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi strechig C-O dari –C-O-C-

6. Pada bilangan gelombang 748,38 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi bending C-H aromatik

7. Pada bilangan gelombang 648,08 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi bending C-C

4.2. Pembahasan

4.2.1 Penentuan Kadar Minyak Atsiri

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan diperoleh minyak atsiri daun

ruku-ruku (Acimun sanctum L.) sebanyak 2,5 ml. Jadi kadar minyak atsiri adalah sebesar 0,25% v/b yang diperoleh dari perhitungan berikut ini :

% Kadar Minyak Atsiri = Volume Minyak Atsiri x 100 %

(36)

4.2.2 Analisis Minyak Atsiri Daun Ruku-ruku dengan GC-MS

Data kromatogram GC dari minyak atsiri daun ruku-ruku hasil destilasi uap adalah sebanyak 17 puncak (gambar 4.1.) d imana kromatogram GC-MS

menunjukkan hanya 9 puncak yang dicetak dan disesuaikan dengan library Wiley 229 karena memiliki persentase paling besar,. seadangkan 8 Puncak yang lain tidak dicetak karena memiliki persentase yang sangat kecil. Dan ke 9 puncak yang dicetak dan disesuaikan dengan library Wiley 229 adalah sebagai berikut :

Dengan waktu retensi (Rt) 6,452 yang kadarnya 0,93 % dengan puncak ion molekul 136 merupakan senyawa Alpha pinene dengan dibandingkan dengan library wiley 229. Rumus molekulnya adalah C10H16 dengan pola fragmentasi seperti berikut

136,121,105,93, 77, 67, 53, dan 41.

..

Gambar 4.3. : Spektrum massa minyak atsiri dengan Rt 6.542

Puncak dengan waktu retensi (Rt) 6,933 yang kadarnya 0,81 % dengan puncak ion molekul 136 merupakan senyawa Camphene dengan dibandingkan dengan library wiley 229. Rumus molekulnya adalah C10H16 dengan pola fragmentasi seperti berikut :

(37)

Puncak dengan waktu retensi (Rt) 7,642 yang kadarnya 0,47 % dengan puncak ion molekul 136 merupakan senyawa Beta pinene dengan dibandingkan dengan library wiley 229. Rumus molekulnya adalah C10H16 dengan pola fragmentasi seperti

berikut : 136, 121, 107, 93, 79, 69, 53, 41.

(38)

wiley 229. Rumus molekulnya adalah C10H18O dengan pola fragmentasi seperti

berikut : 154, 139, 125, 108, 81, 69, 43, 41

Dimana spectrum massa memberikan puncak ion molekul pada m/z 154 (M+) diikuti

puncak-puncak fragmentasi m/z = 139 (M-CH3)+, 84 (139-C4H7)+, 43 (84-C3H5)+.

O CH₃

(39)

(40)

Puncak dengan waktu retensi (Rt) 15.475 yang kadarnya 3,07 % dengan puncak ion molekul 204 merupakan senyawa Copaene dengan dibandingkan dengan library wiley 229. Rumus molekulnya adalah C15H24 dengan pola fragmentasi seperti

berikut : 204, 189, 161, 147, 133, 119, 105, 93, 81, 69, 55, 41.

Gambar 4.7 : Spektrum massa minyak atsiri dengan Rt 15.475

(41)

Diduga berdasarkan spektrum MS pola fragmentasi puncak adalah sebagai berikut :

Puncak dengan waktu retensi (Rt) 15.725 yang kadarnya 7,84 % dengan puncak ion molekul 204 merupakan senyawa Beta elemene dengan dibandingkan dengan library wiley 229. Rumus molekulnya adalah C15H24 dengan pola fragmentasi

seperti berikut : 204, 189, 175, 161, 147, 133, 121, 107, 93, 81, 67, 55, 41.

(42)

Puncak dengan waktu retensi (Rt) 16,067 yang kadarnya 33,41 % dengan puncak ion molekul 178 merupakan senyawa Metil eugenol dengan dibandingkan dengan library wiley 229. Rumus molekulnya adalah C13H22 dengan pola fragmentasi

seperti berikut : 178, 163, 147, 135, 115, 91, 77, 65, 51, 41

puncak-puncak fragmentasi m/z = 163 (M-CH3)+, 135 (163-CO)+, 95 (135-CH2O dan

– CH2C=C=CH2)+.

CH3O

(43)

(44)

Puncak dengan waktu retensi (Rt) 16,292 yang kadarnya 40,89 % dengan puncak ion molekul 204 merupakan senyawa Caryophyllene dengan dibandingkan dengan library wiley 229. Rumus molekulnya adalah C15H24 dengan pola fragmentasi

seperti berikut : 204, 189, 178, 163, 147, 133, 120, 105, 93, 79, 69, 55, 41.

puncak-puncak fragmentasi m/z = 178 (M-C2H2)+, 163 (178-CH3)+, 120 (163-C3H7)+,

93 (120-C2H3).

(45)

Diduga berdasarkan spektrum MS pola fragmentasi puncak adalah sebagai berikut :

Puncak dengan waktu retensi (Rt) 17,142 yang kadarnya 4,67 % dengan puncak ion molekul 204 merupakan senyawa Germacrene dengan dibandingkan dengan library wiley 229. Rumus molekulnya adalah C15H24 dengan pola fragmentasi

seperti berikut : 204, 161, 147, 133, 119, 105, 91, 81, 67, 55, 41

(46)

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Dari hasil destilasi uap minyak atsiri dari daun ruku-ruku (Acimum sanctum L.) diperoleh sebanyak 2,5 ml lalu dianalisa dengan GC – MS. Dari Analisa GC didapat 17 buah bentuk kromatogram, sedangkan spektra yang dihasilkan dengan data MS yang dianalisis adalah 9 buah. Persentase senyawa yang paling tinggi dari data yang ditunjukkan GC adalah : Caryophyllene (40,89%), Methyl eugenol (33,41%).

5.2. Saran

- Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap senyawa-senyawa yang dikandung oleh minyak atsiri daun ruku-ruku (Acimum sanctum L.) yang memiliki banyak manfaat dengan metode destilasi yang lain.

- Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui kandungan minyak atsiri

(47)

DAFTAR PUSTAKA

Agusta. A, 2000, Minyak Atsiri Tumbuhan Tropika Indonesia, Bandung, Penerbit ITB

Anonim. 1986, Medical Herb Index In Indonbesia, PT Eisai Indonesia, Palembang

Chaudhri. R, 1996, Herbal Drugs Industry. A. Practical Approach to Industrial, Pharmacognosy. First Edition, Eastern Publisher, New Delhi

Dachriyanus, 2004, Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi, Cetakan Pertama, Padang, Andalas Universiti Press

Ditjen POM, 2000, Acuan Sediaan Herbal, Edisi Pertama, PT Indofarma, Jakarta

Gritter. R.J, 1991. Pengantar Kromatografi, Bandung, Penerbit ITB

Guenther. E, 2006, Minyak Atsiri. Jilid 1, Jakarta, UI-Press

Ketaren. S. 1985, Pengantar Teknologi Minyak Atsiri, Balai Pustaka, Jakarta

Khopkar, S.M, 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, Jakarta, UI-Press

Mcnair. H.M, 2009, Basic Gas Chromatography, Second Edition, New Jersey , A john Wiley & Sons, Inc Publicaation

Pasto. D. J, 1992, Experiments and Techniques in Organic Chemistry, New Jersey, Prentice Hall, Englewood Cliffs

Perry. L. 1980, Medical Plant of East and Southeast Asia and Uses, Press Cambridge England

Pine. S.H, 1988, Kimia Organik, Terbitan keempat, Bandung, Penerbit ITB

Rohman. A, 2009, Kromatografi Untuk Analisis Obat, Edisi Pertama, Yokyakarta, Graha Ilmu

(48)

Setyawan, A.D, 2002, Keragaman Varietas Jahe (Zingiber officinaleRosc) Berdasarkan Kandungan Kimia Minyak Atsiri, Jurnal Biologi FMIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta, BioSMART Volume 4, Nomor 2, 48-54

Silverstein. R. M, 1981, Spectrometric Indentification of Organic compound, Fouth Edition, New Jork, John wiley and Sons

Sudaryanti dan Sugiharti, 1990, Budidaya dan Penyulingan Nilam, Penebar Swadaya, Jakarta

Tim Penulis Martha Tilaar Center (MTIC), 2002, Budidaya Secara Organik Tanaman Obat Rimpang, Penebar Swadaya, Jakarta

Willet. J. E, 1987, Gas chromatography, London, John Wiley & Sons

Yazid. E, 2005, Kimia Fisika Untuk Paramedis, Yokyakarta, Penerbit Andi

(49)

(50)

(51)