Studi Efek Antikanker Protein Hasil Isolasi dari Biji Jarak Pagar
(Jatropha curcas L) In vitro
Kemampuan Induksi Apoptosis dan Penelusuran Mekanisme Aksi melalui
Aktivasi Caspase-3
In Vitro Study of The Effect of Anticancer Protein Isolated from Jarak Pagar
(Jatropha curcas L) Seeds
Inducing apoptosis through caspase-3 activation Dian Apriliana Rahmawatie1* dan Atina Hussaana2
ABSTRACT
Background: Jatropha curcas L has shown to have the activity of RIP exhibiting the cytotoxic effect against
cancer cells. This study was designed to elucidate the anticancer effect and the mechanism of the anticancer activity of protein isolated from Jatropha curcas L. This study aimed at :1) investigating the effect of Jatropha curcas L on the viabilities of cancer sell invitro, 2) investigating the potensial of Jatropha curcas L in inducing apoptosis in cancer cell, 3) investigating the potensial of Jatropha curcas L protein to increase the caspase activity in cancer cell. Jatropha curcas L extract was made using the Dialysis Method.
Design and method: The cytotoxic effect of protein extract of Jatropha curcas L was tested in the HeLa cell,
the culture of cervix cancer. LC50 was determined using probit analysis. Electrophoresis detection was applied to asses the protein extract of Jatropha curcas L apoptosis. Immunohistochemistry method was used to investigate the effect of caspase-3 expression in the HeLa cell.
Result: The study showed that the cytotoxic effect of the protein isolated from the seed extract of Jatropha
curcas or Lethal concentrations (LC50 values) was 3.822 µg/µl (within the range of 2.616 to 8.051 µg/µl).
Conclusion: In conclusion the protein extract of Jatropha curcas L seed induces apoptosis and increases the
expression of Caspase-3 which serves as executor of apoptosis (Sains Medika, 2 (1): 15-22).
Key words: anticancer, caspase-3, Jatropha curcas L, RIP, Hela cell, cytotoxic
ABSTRAK
Pendahuluan: Biji Jatropha curcas L telah diketahui mempunyai protein dengan aktivitas khas Ribosome
Inactivating Protein (RIP), suatu famili protein yang mempunyai efek sitotoksik. Oleh karena itu, pada
penelitian ini akan dipelajari efek antikanker serta mekanisme antikanker ekstrak protein biji Jatropha
curcas L. Secara khusus, penelitian ini bertujuan untuk: (1) mengetahui pengaruh ekstrak protein biji Jatropha curcas L terhadap viabilitas sel kanker in vitro, (2) mengetahui apakah ekstrak protein biji Jatropha curcas L mampu menginduksi terjadinya apoptosis pada sel kanker, (3) mengetahui apakah ekstrak protein
biji Jatropha curcas L mampu meningkatkan aktivitas caspase-3 pada sel kanker.
Metode Penelitian: Ekstrak Protein Jatropha curcas L (EPBJ) dibuat dengan metode dialisis. Efek sitotoksik
EPBJ diuji pada sel HeLa yang merupakan kultur sel kanker cervix. LC50 ditetapkan dengan analisis probit.
Uji apoptosis EPBJ dengan metode deteksi elektroforesis. Pengaruh EPBJ terhadap ekspresi caspase-3 pada sel HeLa diamati menggunakan metode immunohistokimia. Semakin tinggi dosis EPBJ menunjukkan semakin tinggi prosentase kematian sel HeLa.
Hasil Penelitian: Ekstrak protein biji jarak pagar mempunyai efek sitotoksik atau mampu memacu kematian
sel kanker dengan harga LC50 terhadap sel HeLa sebesar 3,822 µg/µl (rentang tertinggi 2,616; terendah
8,051 µg/µl).
Kesimpulan: Ekstrak protein biji jarak pagar mampu menginduksi proses apoptosis dan dapat
meningkatkan ekspresi Caspase-3 yang bertindak sebagai eksekutor terjadinya proses apoptosis (Sains Medika, 2(1): 15-22).
Kata kunci: antikanker, apoptosis, caspase-3, Jatropha curcas L, RIP, sel Hela, sitotoksik.
Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung (UNISSULA) Email: d_aprilia@yahoo.com
Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung (UNISSULA) 1
* 2
PENDAHULUAN
Kanker masih merupakan penyakit penyebab kematian nomor enam di Indonesia (Anonim, 1998). Selama ini pengobatan terhadap kanker dilakukan dengan pengangkatan jaringan kanker, kemoterapi dan radiasi. Penatalaksanaan kanker dengan metode tersebut masih memberikan efek samping yang besar. Oleh karena itu, banyak usaha yang dilakukan untuk mengembangkan obat kanker dari tanaman, dengan harapan ditemukan antikanker yang spesifik atau bekerja pada aras molekuler. Strategi baru pengembangan antikanker adalah dengan mempengaruhi transduksi sinyal yang menuju apoptosis, sehingga merupakan antikanker yang selektif dan spesifik (Carmichael, 1994).
Salah satu kandidat antikanker dari tanaman yang sekarang banyak dieksplorasi berdasarkan kemampuan untuk mempengaruhi apoptosis adalah protein yang termasuk dalam famili Ribosome-inactivating protein (RIP). RIP adalah protein yang terdistribusi luas pada tanaman. Aktivitas dari RNA N-glikosidase dalam RIP mampu menghambat sintesis protein dengan memotong ikatan glikosidik adenin tertentu pada 28S rRNA (26S rRNA khamir). Pemotongan ini mencegah pengikatan faktor perpanjangan 2 (EF-2) pada ribosom, sehingga sintesis protein berhenti (Chaddock et al., 1996). Selain aktivitas N-glikosidase, RIP juga mempunyai aktivitas memotong DNA plasmid superkoil dan sirkuler secara in vitro (Roncuzzi & Gasperi-Campadin, 1996).
Biji Jatropha curcas L telah diketahui mempunyai protein dengan aktivitas khas RIP, suatu famili protein yang tersebar di berbagai tanaman dan mempunyai efek sitotoksik. Adanya kandungan RIP pada suatu tanaman seringkali menjadi dasar eksplorasi tanaman tersebut untuk dikembangkan menjadi kandidat antikanker. Dari eksplorasi tersebut telah dibuktikan adanya efek antikanker dari beberapa tanaman yang mengandung RIP, dan beberapa diantaranya mempunyai mekanisme antikanker dengan menginduksi terjadinya apoptosis melalui jalur aktivasi caspase. Hussaana (2000) melaporkan bahwa protein dari biji buah tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L) mampu memotong DNA superkoil dengan pola pemotongan seperti RIP. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dipelajari efek antikanker serta mekanisme antikanker ekstrak protein biji Jatropha curcas L.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak protein biji Jatropha curcas L terhadap viabilitas sel kanker in vitro, serta apakah ekstrak protein biji Jatropha curcas L mampu menginduksi terjadinya apoptosis dan mampu meningkatkan aktivitas caspase-3 pada sel kanker.
METODE PENELITIAN
Pembuatan ekstrak protein Jatropha curcas L (EPBJ)
Biji jarak pagar diperoleh dari biji yang sudah tua dari tanaman jarak pagar yang tumbuh di daerah pantai Samas, Bantul, Yogyakarta. Biji Jatropha curcas L dicuci bersih kemudian ditumbuk halus dengan penambahan 80 ml dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M natrium klorid pada suhu 4°C. Ekstrak yang diperoleh disentrifugasi dan diambil supernatannya. Selanjutnya supernatan ditambah ammonium sulfat dengan kejenuhan 100 %. Larutan disentrifugasi, supernatan dibuang dan endapan dilarutkan dalam sedikit mungkin dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya dilakukan dialisis dengan menggunakan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Hasil dialisis disentrifugasi dengan kecepatan 8500 g selama 10 menit pada suhu 4°C. Endapan dibuang dan supernatan yang dihasilkan merupakan sampel fraksi protein (Stirpe & Barbieri, 1986 ).
Uji pengaruh protein biji Jatropha curcas L terhadap viabilitas sel kanker
Suspensi sel kanker (5 x 104 sel/ ml) dimasukkan kedalam mikrowell dan
diinkubasi dengan satu seri konsentrasi protein biji Jatropha curcas L pada medium
RPMI 1640 (37°C, CO2 5%, 24 dan 48 jam). Pada akhir inkubasi, pada setiap sumuran
ditambahkan 10 ml MTT 2,5 mg/ml dalam medium RPMI dan diinkubasi kembali selama 24 jam (37°C). Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Intensitas warna ungu yang terbentuk (λ 550 nm) berbanding terbalik dengan jumlah sel
yang mati. LC50 ditetapkan dengan analisis probit.
Uji apoptosis dari protein biji Jatropha curcas L dengan metode deteksi elektroforesis
Sel kanker dengan konsentrasi 5 x 104 sel/100 ml sebanyak 250 ml diinkubasi
bersama protein biji Jatropha curcas L dalam satu seri dosis selama 24 jam. Selanjutnya DNA sel kanker diisolasi dengan mensuspensikannya dalam dapar lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 8, EDTA 0,5 mM dan NaCl 100 mM) yang mengandung proteinase K 10 mg/ml dan Na dodesil sulfat 0,2%, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama semalam. Preparat DNA diekstraksi dengan pelarut fenol:kloroform:isoamil alkohol (25:24:1) dan kemudian dengan kloroform:isoamil alkohol (24:1). RNase kemudian ditambahkan pada kadar 100 mg/ml, dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 jam. Preparat DNA diekstraksi lagi dan diendapkan dengan etanol. Endapan dilarutkan dalam dapar TE
(Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 dan EDTA 1 mM). Hasil isolasi dielektroforesis pada gel agarosa 2%. DNA diwarnai dengan etidium bromida dan dideteksi dengan sinar UV (Kasagi, 1999).
Pengaruh EPBJ terhadap ekspresi caspase-3 pada sel HeLa
Suspensi sel HeLa (5 x 104 sel/ ml) dimasukkan ke dalam mikrowell dan diinkubasi
dengan satu seri konsentrasi protein biji jarak pagar pada medium RPMI 1640 (37 °C, CO2
5%, selama 24 dan 48 jam). Pada akhir inkubasi, sel dipanen dan dicuci dengan Phospate Bovine Saline (PBS). Sel kemudian diteteskan di atas gelas obyek polilisin dan dilakukan pengecatan imunositokimia dengan antibodi terhadap protein Caspase-3. Hasil pengecatan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali dan dibandingkan dengan kontrol tanpa ekstrak protein biji jarak pagar. Peningkatan ekspresi protein Caspase-3 ditandai dengan meningkatnya warna coklat pada sitoplasma.
Analisis data
Data dari uji viabilitas, berupa perbedaan serapan pada panjang gelombang (λ) 550 nm antara kontrol sel dan sel yang diberi perlakuan dengan EPBJP, digunakan untuk
menentukan LC50. LC50 ditentukan dengan analisis probit. Dari hasil elektroforesis uji
apoptosis, akan dapat ditentukan adanya induksi apoptosis berdasarkan adanya pita DNA smear. Pita DNA smear tersebut menandakan terjadi fragmentasi DNA hasil dari proses apoptosis. Aktivasi caspase-3 pada sel HeLa oleh EPBJ dapat dilihat dengan adanya peningkatan warna coklat pada sitoplasma.
HASIL PENELITIAN
Uji pengaruh protein biji Jatropha curcas L terhadap viabilitas sel kanker
Protein dalam biji diendapkan seluruhnya dengan penambahan ammonium sulfat 100% jenuh dimaksudkan supaya tidak tercampur dengan senyawa non protein. Dialisis dilakukan untuk menghilangkan ammonium sulfat agar tidak mengganggu proses uji aktivitas. Rendemen yang diperoleh dari ekstraksi protein 50 mg biji jarak pagar adalah sebanyak 2 ml ekstrak dengan kadar protein 10 mg/ml.
Hasil uji sitotoksisitas EPBJ diketahui terdapat perbedaan gambaran sel HeLa yang diberi perlakuan dengan EPBJ dan yang tidak diberi perlakuan, sebagaimana ditunjukkan pada Gambar 1. Pada sel HeLa kontrol (Gambar 1a) tampak relatif lebih
banyak sel viabel dengan bentuk khas, mempunyai tangan untuk melekat pada flask. Adapun pada sel HeLa yang mendapat perlakuan dengan EPBJ 5 µg/µl, tampak lebih banyak sel HeLa mati, bentuk membulat (kehilangan sifat plastic adhesive ) dan isi sel keruh (Gambar 1b).
Gambar 1. Hasil pengamatan mikroskopis pengaruh EPBJ pada sel HeLa: (a) Kontrol
(b). Perlakuan EPBJ 5 µg/µl; dengan karakteristik sel viabel (ditunjuk dengan panah 2), sel HeLa mati (ditunjuk dengan panah 1). Perbesaran 100 kali. Uji sitotoksisitas juga menunjukkan hubungan antara dosis EPBJ dengan prosentase kematian sel HeLa, dimana semakin tinggi dosis EPBJ maka semakin tinggi prosentase kematian sel HeLa (Tabel 1.). Hasil analisis probit uji sitotoksik diperoleh nilai
LC50 EPBJ terhadap sel HeLa sebesar 3,822 µg/µl (kisaran 2,616- 8,051 µg/µl).
Tabel 1. Hubungan Dosis EPBJ dengan Prosentase Kematian Sel HeLa
Uji apoptosis dari protein biji Jatropha curcas L dengan metode deteksi elektroforesis
Hasil deteksi elektroforesis menunjukkan bahwa pada sel HeLa yang tidak mendapat perlakuan dengan EPBJP tidak mengalami fragmentasi DNA (Gambar 2a.),
sedangkan pada sel HeLa yang mendapat perlakuan dengan EPBJ terjadi fragmentasi DNA (Gambar 2b.).
Gambar 2. Elektroforegram gel agarosa hasil isolasi DNA sel HeLa: (a) Kontrol (tanpa
perlakuan EPBJ), (b) Perlakuan dengan EPBJ 4 mg/ml
Pengaruh EPBJP terhadap Ekspresi Caspase-3 pada sel HeLa
EPBJ menyebabkan peningkatan ekspresi caspase-3 yang ditunjukkan pada sel yang mendapat perlakuan dengan EPBJ, kebanyakan sitoplasma dan membran inti sel menjadi berwarna coklat (Gambar 3.)
Gambar 3. Hasil imunositokimia ekspresi caspase-3 pada sel HeLa karena perlakuan
selama 24 jam: (a) Kontrol tanpa perlakuan EPBJ, (b) EPBJ 4 mg/ml, dan (c) EPBJ 8 mg/ml. Perbesaran 400 kali.
PEMBAHASAN
Uji pengaruh protein biji Jatropha curcas L terhadap viabilitas sel kanker
Telah diketahui bahwa EPBJ mempunyai aktivitas khas seperti Ribosome-inactivating protein, yaitu mampu memotong DNA superkoil (Hussaana,2000). Dalam
penelitian efek sitotoksik EPBJ ini digunakan sel HeLa yang merupakan kultur sel kanker cerviks karena sel tersebut relatif mudah ditumbuhkan dan rentan terhadap kematian sel karena induksi apoptosis.
Uji apoptosis dari protein biji Jatropha curcas L dengan metode deteksi elektroforesis
Setelah terbukti bahwa EPBJP memiliki efek sitoktoksik terhadap sel HeLa, maka dilanjutkan penelitian untuk melihat kemampuan EPBJP dalam menginduksi apoptosis. Pada penelitian ini, uji apoptosis dilakukan dengan metode fragmentasi DNA (Kasagi, et al., 1999) pada sel HeLa sebagai model sel kanker. DNA dari sel HeLa yang mendapatkan perlakuan dengan EPBJP maupun yang tidak, diisolasi dan dideteksi dengan elektroforesis gel agarosa untuk melihat apakah terjadi fragmentasi DNA.
Hasil deteksi elektroforesis menunjukkan bahwa EPBJP memacu proses apoptosis. Fragmentasi DNA merupakan tanda khas pada proses apoptosis, yang terjadi karena pengaktifan caspase (terutama caspase-3) atau DFF45 (DNA Fragmentation Factor-45) oleh senyawa apoptotik yang kemudian diikuti oleh aktivasi endonuklease (Walker,et al.,
1999). Pengaktifan DFF45 terjadi dengan pemotongan pada residu D117 yang kemudian
memacu aktivitas DFF40 nuclease, penyebab fragmentasi DNA (Sharif-Askari, et al., 2001).
Pengaruh EPBJP terhadap Ekspresi Caspase-3 pada sel HeLa.
Uji ekspresi p53 yang telah dilakukan menunjukkan adanya peningkatan ekspresi p53 (Hussaana dkk., 2007a,b). Untuk itu perlu dilakukan penelusuran mekanisme apoptosis selanjutnya melalui uji ekspresi caspase-3. Ekspresi caspase-3 merupakan jalur transduksi sinyal pada proses apoptosis di tingkat downstream. Sebagaimana Gambar 3 di atas sel HeLa yang mendapat perlakuan EPJB menunjukkan terjadinya peningkatan ekspresi caspase-3.
Dari keseluruhan data-data diatas dapat disimpulkan bahwa EPBJP mampu menginduksi apoptosis pada sel HeLa melalui peningkatan ekspresi caspase-3 yang menjadi downstream dalam proses transduksi sinyal menuju apoptosis. Inisiasi dari caspase-9 akan mengaktifkan caspase-3 yang bertindak sebagai eksekutor terjadinya serangkaian reaksi cascade aktivitas proteolitik (apoptosis) berupa pencernaan struktur protein di sitoplasma dan penghancuran kromosom DNA.
KESIMPULAN
Ekstrak protein biji jarak pagar mempunyai efek sitotoksik atau mampu memacu
kematian sel kanker dengan harga LC50 terhadap sel HeLa sebesar 3,822 µg/µl (rentang
tertinggi 2,616; terendah 8,051 µg/µl). Ekstrak protein biji jarak pagar mampu menginduksi proses apoptosis dan dapat meningkatkan ekspresi Caspase-3 yang bertindak sebagai eksekutor terjadinya proses apoptosis.
SARAN
Perlu dilakukan studi efek ekstrak protein biji jarak pagar terhadap sel kanker secara in vivo.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1998, Cancer Facts and Figures , American Cancer Society, Atlanta.
Carmichael, J. , 1944, Current Issues in Cancer: Cancer Chemotherapy: identifying novel anti cancer drugs, BMJ 308: 1288 – 1290.
Chaddock, J.A, Mozingo A.E , Robertus J.D , Lord J.M and Robert L.M., 1996, Major structural differences between pokeweed antiviral protein and ricin A-chain do not account for their differing ribosome specificity, J. Biochem, 235: 59 – 166.
Hussaana, A., 2000, Uji Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil dari Ekstrak Protein Biji Jatropa curcas, L, data belum dipublikasi.
Hussaana, A., H.Sarosa dan Rahmawati, D. A., 2007a, Pengaruh Ekstrak Protein Biji Jarak Pagar (Jatropha curcas, L) terhadap Ekspresi Caspase-9 pada Kultur Sel Kanker, data belum dipublikasi.
Hussaana, A., H.Sarosa dan Rahmawati, D. A., 2007b, Pengaruh Ekstrak Protein Biji Jarak Pagar (Jatropha curcas L) terhadap Ekspresi p53 pada Kultur Sel Kanker, data belum dipublikasi.
Kasagi, N., 1999, Ethanol induces apoptosis in human gastric carcinoma cells: The role of apoptosis related molecules, Yonago Acta Me, 42: 197 – 199.
Roncuzzi, L. and Gasperi – Campani A., 1996, DNA nuclease activity of the single chain ribosome inactivating proteins diathin 30, saporin 6 and gelonin, FEBS Let, 392: 16 –20.
Sharif-Askari, E. et al., 2001, Direct cleavage of the human DNA-fragmentation factor-45 by granzyme B induces caspase-activated DNase release and DNA fragmentation, The EMBO Journal, 20(12): 3101-3113.
Stirpe, F. and Barbieri, L., 1986, Ribosome- Inactivating Proteins up to date, FEBS Lett. 195: 1- 8.
Walker, P.R., Leblanc, J., Carson, C., Ribecco, M., and Sikorska, M., 1999, Neither Caspase-3 nor DNA Fragmentation Factor Is Required for High Molekular Weight DNA Degradation in Apoptosis, Annals of the NY Acad. Sci. 887: 48-59.
