Pengenalan Alat dan Media
Pengenalan Alat dan Media
A.
A. Alat
Alat
Untuk pemeriksaan mikrobiologi dilakukan peralatan, diantaranya sebagai berikut : Untuk pemeriksaan mikrobiologi dilakukan peralatan, diantaranya sebagai berikut :
1.
1. MikroskopMikroskop
a.
a. Mikroskop cahayaMikroskop cahaya
Gambar 1. Mikroskop monokuler Gambar 1. Mikroskop monokuler
Gambar 2. Mikroskop biokuler Gambar 2. Mikroskop biokuler
Bagian-bagian mikroskop cahaya : Bagian-bagian mikroskop cahaya :
Bagian statis : kaki mikroskop(Bagian statis : kaki mikroskop(basebase), tiang mikroskop, tangkai mikroskop(), tiang mikroskop, tangkai mikroskop(neck neck ),),
meja preparat(
meja preparat( stage stage), makrometer(), makrometer(course focuscourse focus), mikrometer(), mikrometer( fine fine coursecourse),), pengatur meja preparat (
pengatur meja preparat (coaxial stage controlscoaxial stage controls))
Bagian optik : buluh teropong, lensa obyektif, lensa okuler(Bagian optik : buluh teropong, lensa obyektif, lensa okuler(eyepieceeyepiece))
Alat penerangan : lampu, diafragma, kondensorAlat penerangan : lampu, diafragma, kondensor
Cara pemakaian mikroskop cahaya: Cara pemakaian mikroskop cahaya:
1.
1. Membersihkan lensa dan cerminMembersihkan lensa dan cermin 2.
2. Melihat sumber cahayaMelihat sumber cahaya 3.
3. Mencari medan penglihatanMencari medan penglihatan 4.
4. Memasang preparatMemasang preparat 5.
5. Mengatur fokusMengatur fokus 6.
6. Paska penggunaanPaska penggunaan
Untuk pemeriksaan mikrobiologi digunakan pembesaran antara 600-1000 kali (lensa Untuk pemeriksaan mikrobiologi digunakan pembesaran antara 600-1000 kali (lensa okuler pembesaran 6 atau 10, lensa obyektif 100kali).
okuler pembesaran 6 atau 10, lensa obyektif 100kali). Untuk cara ini dibutuhkan
Untuk cara ini dibutuhkan
Minyak emersiMinyak emersi
Lensa obyektif harus terendam dalam minyak emersiLensa obyektif harus terendam dalam minyak emersi
Kondensor dinaikkan maksimalKondensor dinaikkan maksimal
Diagfragma dibuka selebar-lebarnyaDiagfragma dibuka selebar-lebarnya
b.
b. Mikroskop lapangan gelap/Mikroskop lapangan gelap/darkdark field: Mikroskop ini digunakan untuk melihat sediaanfield: Mikroskop ini digunakan untuk melihat sediaan basah.
basah. Bakteri Bakteri masih masih hidup hidup sehingga sehingga dapat dapat dilihat dilihat pergerakannya pergerakannya yang yang khas. khas. BakteriBakteri tampak terang latar belakang yang gelap.
c.
c. Mikroskop elektronMikroskop elektron
Dengan menggunakan seberkas elektron yang difokuskan dengan magnet maka Dengan menggunakan seberkas elektron yang difokuskan dengan magnet maka mikroskop elektron dapat menampakkan partikel-partikel secara terpisah yang terletak mikroskop elektron dapat menampakkan partikel-partikel secara terpisah yang terletak kurang 0,001µm satu terhadap yang lain. Virus dari garis tengah < 0,001- 0,2 µm dapat kurang 0,001µm satu terhadap yang lain. Virus dari garis tengah < 0,001- 0,2 µm dapat dengan mudah dilihat secara terpisah satu sama lainnya.
dengan mudah dilihat secara terpisah satu sama lainnya. d.
d. Mikroskop faseMikroskop fase
Yang mendasari mekanisme cara kerja mikroskop adalah kenyataan bahwa gelombang Yang mendasari mekanisme cara kerja mikroskop adalah kenyataan bahwa gelombang cahaya yang melalui benda-benda tembus cahaya, seperti sel, akan keluar lagi dengan cahaya yang melalui benda-benda tembus cahaya, seperti sel, akan keluar lagi dengan fase-fase yang berlainan tergantung pada sifat bahan yang dilalui. Suatu sistem optik fase-fase yang berlainan tergantung pada sifat bahan yang dilalui. Suatu sistem optik khusus dapat merubah perbedaan fase ini ke dalam perbedaan intensitas, sehingga khusus dapat merubah perbedaan fase ini ke dalam perbedaan intensitas, sehingga beberapa struktur terlihat lebih gelap dari yang lainn
beberapa struktur terlihat lebih gelap dari yang lainn ya, sehingga dapat digunakan uya, sehingga dapat digunakan untukntuk memeriksa sel/bakteri hidup tanpa harus diwarnai terlebih dahulu.
memeriksa sel/bakteri hidup tanpa harus diwarnai terlebih dahulu.
2.
2. Autoclave Autoclave
Alat ini digunakan untuk mensterilkan bahan/alat/media dengan cara pemanasan basah Alat ini digunakan untuk mensterilkan bahan/alat/media dengan cara pemanasan basah ((moist heat moist heat ))
Cara sterilisasi menggunakan
Cara sterilisasi menggunakan autoclaveautoclave (temperature 121 (temperature 12100C selama 15 menit)C selama 15 menit)
Isi autoklaf dengan aquades secukupnya(4-5cm)Isi autoklaf dengan aquades secukupnya(4-5cm)
Masukkan sampel yang akan disterilkan kedalamMasukkan sampel yang akan disterilkan kedalam
dandang bagian dalam. dandang bagian dalam.
Penutup autoklaf diolesi vaselin tipis pada bagian Penutup autoklaf diolesi vaselin tipis pada bagian luarluar
yang akan menempel di badan autoklaf, kemudian yang akan menempel di badan autoklaf, kemudian
tutuplah autoklaf dengan rapat, anak panah pada penutup tutuplah autoklaf dengan rapat, anak panah pada penutup
harus bertemu dengan garis di badan autoklaf. Buka katup klep (posisi tegak lurus).
Nyalakan kompor atau listrik, tunggu sampai klep mengeluarkan uap dan mulai hitung
selama lima menit, kemudian tutuplah katup hingga posisi horizontal.
Tunggu sampai jarum menunjukkan angka 15 PSI (1210C), biarkan pada posisi tekanan 15 PSI selama 15 menit. Setelah itu matikan listrik atau api lalu buka klep.
Penutup autoklaf jangan dibuka dulu sebelum semua uap keluar.
Setelah itu buka penutup autoklaf.
3. H ot air ster il izer
Fungsi : untuk mensterilkan alat dengan cara pemanasan kering (dry heat ). Untuk sterilasi
* 1600C selama 60 menit
* 1700C selama 40 menit * 1800C selama 20 menit
4. I ncubator
Fungsi :
Untuk mengeramkan mikroorganisme yang telah ditanam
pada media kultur.
Untuk menyimpan bahan pemeriksaan/spesimen
5. Inspirator/koagulator
Fungsi : untuk memadatkan dan mensterilkan media yang mengandung protein dengan cara pemanasan basah dimana media tersebut tidak dapat disterilkan dengan autoklaf, misalnya pada media Loeffler atau PAI dan media LJ (Lowenstein jensen)
6. Refrigerator
Fungsi :
Menyimpan media steril yang siap pakai agar isi dan mutu media tersebut tidak
rusak/berubah
Menyimpan untuk sementara waktu bahan/spesimen yang belum sempat diperiksa
agar tidak mengalami perubahan.
Menyimpan cakram antibiotika yang belum dipakai agar tidak berubah
Menyimpan stok mikroorganisme.
7. Alat-alat lainnya
a. Timbangan
Mechanical scales (Neraca ohauss) Analytical scales
c. Centrifuges
d. Vortex
e.Anaerobic jar
f. Rak pewarnaan
h. Cawan petri
i. Glass beaker
j. Obyek glass & cover glass
k. Micropipette
l. Stirrer
n. Tabung
o. Jangka sorong
B. Media
Dalam pemeriksaan laboratoris mikrobiologi penggunaan media sangat penting untuk isolasi, identifikasi maupun diferensiasi. Sedangkan media kultur adalah adalah beberapa nutrisi baik organik maupun anorganik yang dapat dalam bentuk cair, semi solid dan padat yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Untuk mendapatkan suatu lingkungan kehidupan yang cocok bagi pertumbuhan bakteri, maka syarat-syarat media, pembuatan media harus memenuhi beberapa hal dibawah ini :
1. Susunan makanan
Dalam suatu media yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri haruslah ada : a. Air
b. Nitrogen
c. Sumber energy d. Vitamin dan mineral e. Gas f. Solidifying agents Gelatin Agar-agar 2. Tekanan osmose 3. Derajat keasaman (pH) 4. Temperature 5. Sterilisitas
Penggolongan media
1. Berdasarkan jenisnya dibagi menjadi dua, yaitu;
a. Media Hidup
Terutama digunakan untuk menanam/mengisolasi virus, di samping itu sering pula media hidup digunakan untuk mengetahui sifat-sifat tertentu dari bakteri
misalanya: untuk mengetahui jenis Escherichia coli yang patogen digunakan tikus putih yang berumur 3-7 hari. Kebanyakan virus hanya dapat ditanam pada bagian tertentu dari binatang, misalnya: ginjal kera, embryo ayam, dll
b. Media buatan
Adalah media yang dibuat, berasal dari kumpulan zat-zat tertentu (organik dan anorganik). Untuk masing-masing bakteri membutuhkan susunan media yang berbeda-beda.
2. Berdasarkan konsistensinya dikenal adanya :
a. Media padat (datar, padat miring, dan tegak) b. Media setengah padat (semi solid)
Misalnya : SSS (semi solid sucrose medium), MIO (motility indol ornithine). c. Media cair (ex: media gula-gula, media kaldu, kaldu pepton, kaldu darah)
3. Menurut isi dari media
a.
Media basal-
Media basal padat : kaldu agar, TSA (tryptone soy agar)-
Media basal cair : air pepton,kaldu pepton4. Berdasarkan tingkatannya dibedakan menjadi :
a.
Media sederhanaHanya mengandung zat-zat kimia yang sederhana, misalnya :
-
Media larutan alkali pepton-
Media gula-gulab.
Media kayaMengandung zat-zat kimia sederhana dan zat organik tingkat tinggi seperti : Serum, darah dan telur.
5. Menurut penggunaannya dapat digolongkan menjadi :
a. Media kaya
Digunakan untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri yang tidak dapat tumbuh dalam media sederhana (ex: Gonococcus, Pneumococcus dll).
Contoh : media agar darah, agar coklat, kaldu darah
b. Media ekslusif
Media ini dibuat khusus untuk bakteri tertentu, dapat berupa : 1. Membuat pH sangat alkalis :
- Media cair alkali pepton
- TCBS untuk isolasi Vibrio cholera 2. Menambahkan antibiotik tertentu :
- Chloramphenicol untuk jamur Sabourraud
c. Media selektif
Media ini mempunyai susunan sedemikian rupa, sehingga kuman yang dicari akan tumbuh dengan koloni yang khas.
Contoh : media tellurit yang digunakan untuk isolasi Corynebacterium diphteriae, dimana koloni difteri akan berwarna hitam.
d. Media pembiakan
Media ini digunakan bila dalam suatu material, kuman yang dicari jumlahnya sedikit dan atau terdapat kuman-kuman lain dalam jumlah besar. Oleh karena itu material perlu dimasukkan ke dalam media pembiakan, agar kuman yang dicari dapat tumbuh subur, sedang kuman yang lain akan terhambat pertumbuhannya. Contoh :
- media SC (selenite Cystein) broth yang digunakan sebagai media penyubur untuk salmonella,
- media alkali pepton cair yang digunakan sebagai media penyubur untuk vibrio
e. Media untuk mengetahui sifat biokimiawi bakteri terhadap berbagai
macam zat
1. Media gula-gula
Contoh : glukosa, maltosa, laktosa, sakarosa, manitol, xylose dll Yang perlu diamati apakah bakteri tersebut :
- Memecah gula-gula menjadi asam dan gas
- Memecah gula-gula hanya menghasilkan asam tanpa gas - Tidak memecah gula-gula
2. Media darah
Dalam media ini dipelajari sifat-sifat bakteri terhadap darah,apakah bakteri tersebut :
- Menghemolisa darah (β-streptococcus)
- Hemodigesh terhadap darah (α- streptococcus)
- Tidak berpengaruh terhadap darah (λ - streptococcus)
3. Media yang dapat digunakan mempelajari berbagai sifat bakteri, contoh :
a. KIA (Kliger Iron Agar)
Dalam media ini (bentuknya miring) di samping mempelajari reaksi bakteri terhadap kmponen penyusun media juga diperhatikan adanya produksi asam atau perubahan warna dari merah ke kuning, baik pada daerah yang miring (slant) ataupun tusukan (butt). Dengan media KIA dapat dipelajari;
Reaksi bakteri terhadap gula-gula (lactose dan dextrose) apakah bakteri tersebut:
Menghasilkan asam dan gas
Tidak memecah kedua gula tersebut
Kemampuan bakteri membentuk H2S
Adanya ferri ammonium sulfat dalam media ini maka bila kuman tersebut membentuk H2S akan diikat sebagai Ferri sulfid yang akan
terlihat berwarna hitam.
Prinsipnya media ini hampir sama dengan KI-Agar hanya perbedaan pokok adalah dalam media TSI mengandung tiga macam gula yakni:
Dextrose, Lactose, dan Sucrose
c. SSS (Semi Solid Sucrose)
Dalam media ini dapat dipelajari: Motility (pergerakan bakteri)
Reaksi bakteri terhadap sucrose
Di samping itu bila sucrose diganti dengan gula yang lain ( yang diperlukan) maka dapat diketahui kelakuan bakteri terhadap gula tersebut.
d. LIA (Lysin Iron Agar)
Dalam media ini dapat dilihat kelakuan bakteri terhadap: - L.Lysine
- Kemampuan membentuk H2S
e. MIO (Manitol Indol Ornithine)
Dalam medium ini dipelajari : - Pergerakan bakteri
- Kemampuan bakteri menghasilkan Indol - Reaksi pemecahan ornithine
f. Media agar
Disamping itu dewasa ini untuk menyimpan bakteri dalam jangka waktu yang lama (juga virus), dapat ditempuh dengan menyimpan bakteri pada suhu kira-kira -60oC (minus 60oC).
Secara garis besar dan dipandang dari segi praktis, maka laboratorium Mikrobiologi membagi media yang dipakai sebagai berikut:
1. Media transport
A. BGS (Buffered Glycerol Saline) B. Cary dan Blair transport medium C. Amies transport medium
D. Alkaline pepton water (air pepton alkalis) E. Stuart transport medium
F. Kaldu pepton
2. Media untuk isolasi:
A. Kultur umum
1) Agar darah (untuk kultur dan angka kuman) 2) Agar coklat
3) DCLS (Deoxycholate Citrate Lactose Sucrose agar) 4) Media Tellurit
5) Media untuk pertusis (Bordet Gengou Agar) 6) Thayer Martin Medium
B. Penanaman Mycobacterium tuberculosa Loewenstein medium
C. Penanaman bakteri anaerob 1) Brucella Agar Darah
2) Brucella Agar darah dengan kanamycin/antibiotik lain 3) Agar darah
4) Thioglycolat
5) Thioglycolat dengan antibiotik D. Leptospira
Fletcher’s medium E. Bagian Mikologi
Sabouraud
Sabouraud dengan chloramphenicol F. Enterobacter
1) DCLS 2) TCBS
3) Mc.Conkey Agar
3. Enriched media (media penyubur)
A. Selenite Cystein Broth B. Larutan alkali pepton C. Kaldu darah
D. Thioglycolat E. Gall kultur
4. Media untuk sensitivitas test
A. Mueller Hinton Agar B. DST Agar
C. Supristol Agar
D. BHI (Brian Heart Infusion) E. Agar Base
5. Media untuk identifikasi
A. Kultur umum
1) Media gula-gula
2) Deret media komplek untuk identifikasi kuman perut batang gram negatif B. Enterobacter
1) KIA/TSI Agar 2) SSS
3) LIA
4) MIO
5) ACE (Acetat Agar) 6) Urea broth
7) MR (Methyl Red) 8) VP (Voges Proskauer)
Beberapa contoh media
Tryptic soy agar (TSA)
Tryptic soy agar, uninoculated
Type: General
Purpose: Cultivation of nonfastidious bacteria
Chocolate agar
Chocolate agar, uninoculated
Type: Enriched
Purpose: Cultivation of fastidious organisms such as Neisseria or Haemophilussp.
Interpretation: Some organisms grow on chocolate agar that do not grow on standard media
Thayer-Martin agar
Thayer-Martin agar, uninoculated
Type: Enriched and selective; contains three antibiotics -- colistin (kills gram-negative coliforms), vancomycin (kills gram-positives), and nystatin (kills fungi)
Purpose: To select for fastidious organisms, such as N. gonorrhoeae, in patient samples containing large numbers of
normal flora, such as from the female genital tract MacConkey (lactose) agar
MacConkey agar, uninoculated
Type: Selective and differential
Purpose: Contains bile salts and crystal violet which selects for gram-negative enterics, differentiates lactose fermenters from nonfermenters. Can include sugars other than lactose for further differentiation (e.g., to differentiate enterohemorrhagic E. coli (EHEC), which does not ferment sorbitol, from other E. coli types which do)
Interpretation: Selects for nonfastidious gram-negatives; red
colonies indicate fermentation of lactose, white colonies indicate no fermentation of lactose
Hektoen agar
Hektoen agar, uninoculated
Type: Selective and differential
Purpose: Detects lactose fermentation and H2S production, inhibits
nonenterics
Interpretation: Lactose fermenters are yellow or salmon while nonfermenters colorless; H2S production causes black precipitate
Mannitol salt agar
Mannitol salt agar, uninoculated
Type: Selective and differential
Purpose: Selects for staphylococci, which grow at high salt concentrations; differentiates Staphylococcus aureus from other staphylococci
Interpretation: Staphylococcus aureus is yellow (ferments mannitol), other staphylococci are white
Sheep blood agar
Sheep blood agar, uninoculated
Type: Differential and enriched
Purpose: Determine types of hemolysis (i.e., α, β, γ)
Interpretation: α, partial clearing, green or brownish ring; β, wide zone of clearing; γ, no clearing, nonhemolytic
Salmonella typhi
Tube Indole = Negative
TSI slant = Alkaline / Acid, no gas production and very weak hydrogen disulfide production
LIA slant = Lysine decarboxylase positive, deaminase negative
MIO agar = Motility negative, ornithine decarboxylase negative
Urea slant = Urease negative
Tube TSI slant LIA slant MIO Urea slant Indole
TCBS untuk Vibrio cholera
Vibrio cholerae : Tumbuh
sebagai koloni berwarna kuning Vibrio parahaemolyticus :
Tumbuh sebagai koloni berwarna hijau
Staphylococcus aureus : Tidak tumbuh
SS (Salmonella Shigela agar)
Salmonella typhi: Koloni tak berwarna dengan bagian tengah berwarna hitam
Escherichia coli: Koloni berwarna merah muda
Citrat Agar
Citrat (+) : warna biru ( Klebsiella pneumonia dan Proteus mirabilis)
Citrat (-) : warna hijau ( E. coli dan Shigella dysentriae)
KIA
MR (methyl red)
If the pH indicator (methyl red) is added to an aliquot of the culture broth and the pH is below 4.4, a red color will appear (tube on the left). If the MR turns yellow, the pH is above 6.0 and the mixed acid fermentation pathway has not been utilized (tube on the right)
VP (Voges-Proskauer)
If the culture is positive for acetoin, it will turn “brownish-red to pink” (tube on the left). If the culture is negative for acetoin, it will turn “brownish-green to yellow” (tube on the left)
Tugas mahasiswa :
1. Amati dan gambarlah alat dan media yang ada dalam demonstrasi (warna gambar sesuai dengan asli)!
2. Tuliskan fungsi dari masing-masing alat dan media tersebut !
3. Buat laporan praktikum masing-masing kelompok satu laporan dengan ketentuan sebagai berikut :
Ditulis di folio bergaris (tulis tangan)
Terdiri dari :
o Judul praktikum
o Tujuan praktikum
o Dasar teori
o Alat dan bahan
o Hasil pengamatan
o Pembahasan
o Kesimpulan dan
o Daftar pustaka
Pemeriksaan Air Minum Secara Bakteriologis
A. Syarat kualitas air minum
Dari segi kualitas, air minum harus memenuhi persyaratan fisika, kimia, bakteriologis dan radioaktif. Di Indonesia syarat kualitas air minum berdasarkan Kepmenkes RI adalah sebagai berikut:
a. Syarat Bakteriologis
Adapun persyaratan bakteriologis air minum ditentukan oleh ada tidaknya mikroorganisme patogen. Air minum harus bebas dari bakteri patogen karena bakteri patogen dapat menimbulkan penyakit. Bakteri patogen biasanya berasal dari
kontaminasi tinja. Air minum tidak boleh mengandung E. coli ( fecal coli) dalam 100 ml air yang dianalisis. Kadar yang diisyaratkan dan tidak boleh dilampaui adalah sebagai berikut:
Tabel 1. Syarat Bakteriologis Air Minum
No Parameter Satuan Kadar maksimum
yang diperbolehkan 1 2 3 Air Minum E.coli atau fecal coli
Air yang masuk sistem distribusi
E.coli atau fecal coli
Total Bakteri Coliform Air pada sistem distribusi E.coli atau fecal coli Total Bakteri Coliform Jumlah per 100 ml sampel Jumlah per 100 ml sampel Jumlah per 100 ml sampel Jumlah per 100 ml sampel Jumlah per 100 ml sampel 0 0 0 0 0 Sumber: Kepmenkes No.907/Menkes/SK/VII/2002 tentang persyaratan kualitas air minum
b. Syarat Fisik
Syarat fisik air minum adalah air minum tidak boleh berbau, tidak boleh berasa, tidak boleh berwarna, dan jernih. Kadar yang diisyaratkan dan tidak boleh dilampaui adalah sebagai berikut:
Tabel 2. Syarat Fisik Air Minum
Parameter Satuan Kadar maksimum yang
diperbolehkan
Keterangan Warna
Rasa dan bau Temperatur Kekeruhan TCU -0 C NTU 15 -suhu udara ± 30C 5 Tidak berbau dan berasa
Sumber: Kepmenkes No.907/Menkes/SK/VII/2002 tentang persyaratan kualitas air minum c. Syarat Radioaktivitas
Syarat radioaktivitas air minum adalah air minum tidak boleh tercemar bahan-bahan buangan radioaktif karena senyawa radioaktif yang memancarkan radiasi alfa (α) dan beta (β) dapat membahayakan kesehatan manusia. Kadar yang diisyaratkan dan tidak boleh dilampaui:
Tabel 3. Syarat Radioaktivitas Air Minum
Parameter Satuan Kadar maksimum yang
diperbolehkan Gross alpha activity
Gross beta activity
(Bq/liter) (Bq/liter)
0,1 1
Sumber: Kepmenkes No.907/Menkes/SK/VII/2002 tentang persyaratan kualitas air minum d. Syarat Kimia
Syarat kimia air minum yaitu air minum tidak boleh mengandung zat-zat yang berbahaya dan beracun. Kadar yang diisyaratkan dan tidak boleh dilampaui oleh bahan
Tabel 4. Syarat Kimia Air Minum Berdasarkan Bahan Anorganik
Parameter Satuan Kadar maksimum yang
diperbolehkan Ammonia Alumunium Klorida Tembaga Kesadahan Hidrogen Sulfida Besi Mangan pH Sodium Sulfat
Total zat padat terlarut Seng mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l 1,5 0,2 250 1 500 0,05 0,3 0,1 6,5-8,5 200 250 1000 3
Sumber: Kepmenkes No.907/Menkes/SK/VII/2002 tentang persyaratan kualitas air minum
B. Pemeriksaan air minum secara bakteriologis
1. Standar Air Minum
Standar air minum yang dipakai adalah dari WHO (Edisi III thn 1971). Semua sampel tidak boleh mengandung E. coli dan sebaliknya juga bebas dari bakteri Coliform. Standar WHO tersebut adalah: (1) Dalam setiap tahun 95% dari sampel-sampel tidak boleh mengandung Coliform dalam 100 ml; (2) Tidak boleh ada sampel yang mengandung E. coli dalam 100 ml; (3) Tidak boleh ada sampel yang mengandung Coliform lebih dari 10 dalam 100 ml; (4) Tidak boleh ada coliform dalam 100 ml dari dua sampel yang berurutan.
2. Frekuensi Sampling
Lebih baik sering mengambil sampel dan diperiksa dengan cara yang sederhana daripada jarang mengambil sampel walaupun cara pemeriksaannya lebih lengkap. Pengambilan sampel perlu ditingkatkan pada keadaan hujan deras terus-menerus, sangat panas, kecepatan aliran berkurang, angin kencang, dan angin yang berdebu.
3. Metode Sampling dan Pengirimannya
Pada waktu sampling harus selalu dijaga agar tidak terjadi kontaminasi. Untuk itu digunakan botol steril yang tertutup ( screw cup) yang dibalut dengan celophan sebelum diotoklaf. Bila sampel yang akan diambil adalah air yang telah diklorinasi, botol diberi sedikit larutan Na2S2O3 misalnya 0,1 ml dari 3% Na2S2O3 tiap 100 ml air sebelum
disterilkan.
4. Pengujian Bakteriologis dari Air Minum
Pengujian bakteriologis terutama berhubungan dengan kesehatan konsumen dan meniadakan bakteri patogen untuk air minum. Karena kuman patogen biasanya ada dalam jumlah kecil, maka tidak sesuai bila yang digunakan sebagai standar untuk pengujiian adalah ada atau tidaknya kuman patogen dalam air. Oleh karena itu adanya bakteri yang berasal dari faeces dipakai sebagai indikator adanya kuman patogen dari kuman perut. Kuman patogen dapat berasal dari manusia, binatang (piaraan atau liar), dan burung. Walaupun demikian tidak dapat diasumsikan bahwa air dari persediaan yang tertutup untuk pabrik (diisolasi) dan distok akan bebas dari kuman perut, walaupun biasanya derajat kontaminasinya jauh berkurang. Yang biasa digunakan sebagai indikator dari polusi faeces adalah E. coli, Streptococcus faecalis, Clostridium perfingens, dan virus perut. Pemeriksaan bakteriologis air minum terdiri dari:
a. Pemeriksaan Kualitatif
Pemeriksaan ini mempunyai langkah-langkah sebagai berikut: 1) Uji Presumptif (Presumptive Coliform Count), uji untuk mengetahui angka terkaan tertinggi (Most Probable Number) kuman Colilform tiap 100 ml contoh air. Ada 2 metode yaitu; a) metode 155, digunakan bila contoh air yang akan diperiksa tampak
cukup jernih; b) metode 333, digunakan bila contoh air yang akan diperiksa tampak cukup keruh; 2) Uji Eijkman (Differential Coliform Test), uji ini untuk mengetahui angka terkaan tertinggi (Most Probable Number) kuman E. coli tiap 100 ml contoh air; 3) Completed Test, uji ini dilakukan untuk menegakkan diagnosa akhir kuman yang ditemukan pada Differential Coliform Test.
1) Uji Presumtif (Presumptive Coliform Count)/Metode 333
Pada metode ini terdapat tiga kelompok tabung reaksi yang berisi medium cair laktosa atau medium cair Mac. Conkey modifikasi dan tabung Durham (tabung kecil yang dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan mulut tabung menghadap ke bawah). Kelompok pertama: terdiri dari 3 tabung reaksi dan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang telah berisi 10 ml medium, ditambahkan 10 ml contoh air. Kelompok kedua: terdiri dari 3 tabung reaksi dan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang telah berisi 1 ml medium, ditambahkan 1 ml contoh air. Kelompok ketiga: terdiri dari 3 tabung reaksi dan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang telah berisi 0,1 ml medium, ditambahkan 0,1 ml contoh air. Semua tabung reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Bila tidak terdapat cukup gas (<10%) pada tabung Durham, dinyatakan presumtif negatif, diinkubasi 24 jam lagi. Bila ternyata terdapat cukup gas (10% atau lebih) pada tabung Durham, dinyatakan presumtif positif. Kemudian dicatat banyaknya tabung reaksi yang presumtif positif pada masing-masing kelompok. Menggunakan tabel Mc Crady untuk mengetahui Most Probable Number (MPN) kuman Coliform tiap 100 ml contoh air.
Biakan tiap tabung reaksi yang presumtif positif ditanam pada tabung reaksi yang berisi medium cair Mac Conkey modifikasi dan tabung Durham. Kemudian diinkubasi pada suhu 44oC selama 24 jam. Bila terdapat gas, dinyatakan positif dan dianggap mengandung E. coli. Kemudian dicatat banyaknya tabung yang positif dari masing-masing kelompok. Menggunakan tabel Mc Crady untuk mengetahui Most Probable Number (MPN) kuman E. coli tiap 100 ml contoh air.
3) Completed Test
Biakan dalam tiap tabung pada nomor 2 yang positif, ditanam secara goresan pada lempeng agar Eosin Methylen Blue (EMB). Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Koloni kuman E. coli pada medium agar EMB menunjukkan gambaran metallic sheen. Terhadap koloni ini dilakukan penanaman secara goresan pada lempeng agar nutrien. Setelah diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, lakukanlah pewarnaan gram terhadap kuman yang tumbuh. Bila kuman yang diperiksa berbentuk batang gram negatif dan tidak membentuk spora, dikatakan completed test positif.
b. Pemeriksaan Kuantitatif
Pada pemeriksaan ini dilakukan perhitungan terhadap semua kuman yang tumbuh dari sejumlah contoh air yang diperiksa. Bila koloni kuman yang tumbuh begitu banyak, hingga secara makroskopik tidak dapat dihitung, maka dipakai alat penghitung koloni dari Quebeck .
1) Total Plate Count (TPC)
Satu mililiter contoh air yang tidak diencerkan ditanam pada lempeng agar nutrien dengan metode tuang. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
Kemudian dihitung jumlah koloni kuman yang tumbuh (bila perlu digunakan Quebeck Colony Counter ). Bila koloni yang ditemukan antara 30-300, jumlah tersebut menyatakan jumlah kuman tiap mililiter contoh air. Bila koloni yang tampak sukar dihitung secara langsung, dapat digunakan kotak-kotak berarsir pada alat penghitung koloni ini sebagai pembantu. Kemudian dihitung koloni kuman pada 10 kotak berarsir, kemudian dihitung rata-ratanya. Bila angka tersebut dikalikan luas permukaan medium, dianggap menyatakan jumlah koloni kuman yang tumbuh pada
medium lempeng agar tersebut dan sekaligus menyatakan banyak kuman dalam sejumlah volume bahan cair (1 ml contoh air) yang telah ditanam pada medium lempeng agar itu.
Tabel 5. Persyaratan air minum menurut WHO MPN Coliform MPN E. coli TPC 0/100 ml air 0/100 ml air 100 kuman/ml air
Tabel 6. Persyaratan air minum menurut Menteri Kesehatan RI MPN Coliform MPN E. coli TPC 0/100 ml air 0/100 ml air 200 kuman/ml air
C. Media spesifik pembiakan E. coli
Eosin Metilen Blue
Media ini mengandung zat warna eosin dan metilen blue, juga mengandung laktosa. Medium ini bisa membedakan kuman yang memfermentasi laktosa dan yang tidak memfermentasi laktosa. E. coli menimbulkan warna metallic sheen, karena asam yang dihasilkan akibat fermentasi laktosa akan membuat zat warna eosin dan metilen blue
mengadakan presipitasi dalam permukaan agar. Koloni kuman enterobactericeae yang tidak memfermentasi laktosa tidak berwarna.
Gambar :
Cara kerja untuk menghitung MPN, uji coliform
Berdasar sifat coliform, maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi.
Cara kerja :
1. Sediakan 9 tabung berisi LactoseBroth (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham. Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar).
2. Kocok botol yang berisi air sampel.
3. Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama, secara aseptis.
4. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua, secara aseptis.
5. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 0,1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga, secara aseptis.
6. Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam.
7. Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya.
Tabel 7. MPN metode 333
Contoh :
Didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 312 maka jumlah bakteri coliform adalah 120 sel/100 ml.
