Pendahuluan
Penyakit bintik putih (white spot syndrome virus atau WSSV) merupakan jenis penyakit viral yang paling ditakuti oleh petambak seluruh dunia. Penyakit ini dapat menyerang hampir seluruh jenis krustasea air laut dan air tawar dengan pengecualian udang galah (Macrobrachium rosenbergii) dan sejenis udang putih amerika (Penaeus duorarum). Penyakit ini juga dapat ditemukan pada sebagian serangga rawa-rawa pantai (Chironomid spp.) dan lima jenis moluska di India (kemungkinan juga di tempat lainnya).
Kerugian akibat serangan penyakit ini di Cina, India, Thailand dan Indonesia per tahun masing-masing melebihi 500 juta US $, belum termasuk kerugian dari negara negara Amerika latin yang mulai tertular sejak tahun 1995. Jenis udang
penaeid industri budidaya yang terkena dampaknya adalah udang windu (Penaeus monodon), udang Cina (Penaeus chinesis) udang Jepang (Penaeus japonicus) dan udang putih Amerika (Penaeus stylirostris dan Penaeus vannamei). (Lightner et al., 2001).
Serangan penyakit WSSV dicirikan dengan pengurangan nafsu makan dan beberapa udang yang berenang ke tepi pematang. Gejala selanjutnya adalah kematian lebih dari lima ekor per hari dan jumlah kematian bertambah drastis setiap hari dan tidak berhenti. Udang akan banyak yang berwarna merah sakit dan bertubuh lunak namun ada beberapa yang tubuhnya masih keras. Pada hari hari terakhir banyak bintik putih pada bagian dalam kulit dengan permukaan kulit yang tetap halus (Gambar 1). Serangan penyakit WSSV
Mensiasati Penyakit WSSV Di Tambak Udang
Coco Kokarkin Soetrisno
Microbiology and Immunology, Biomedical Science James Cook University Queensland. Australia. E–mail : [email protected]
Abstract
Coco Kokarkin Soetrisno. 2004. White spot syndrome virus (WSSV) poses prevention at the pond penaeid culture. Aquacultura Indonesiana, 5(1): 19–31. White spot syndrome virus (WSSV) poses a serious threat to the penaeid industry around the world and has caused billion US $ losses annually. This vast host ranging diseases can be detected by PCR with high accuracy, however sampling method weakness and financial consideration make this method unpopular among the farmers. Improvement in PCR sampling method combined with using haemocyte features and heat shock protein as alternative biomarkers can be use as presumptive diagnosis for disease outbreak. Better control to some key environmental factors might be useful to prevent increasing WSSV prevalence and infection rate. Most financial handicaps are potentially solved by collective means and it is possible to reduce the use of these costly method if Indonesia has a comprehensive national program for specific pathogen free (SPF) broodstock.
Keyword: Cope to WSSV disease; Shrimp pond.
Abstrak
Penyakit bintik putih (WSSV) merupakan ancaman serius bagi industri udang penaeid di seluruh dunia dibuktikan dengan dampak kerugian hingga milyaran dolar amerika setiap tahunnya. Virus yang memiliki inang yang beragam sekali ini dapat dideteksi dengan akurat melalui PCR namun keterbatasan biaya dan teknik sampling membuat teknik ini tidak populer di masyarakat. Perbaikan teknik sampling pada pemeriksaan PCR, pengamatan kondisi darah udang dan heat shock protein (HSP) dapat dilakukan sebagai alternatif deteksi rutin awal sebelum munculnya ledakan penyakit. Pemahaman faktor faktor lingkungan tertentu yang bernilai strategis akan sangat membantu menahan penyakit pada udang yang sudah sedikit terinfeksi WSSV. Banyak kendala biaya yang dapat diatasi dengan penanganan secara kelompok, namun pemeriksaan PCR dan lainnya yang relatif mahal ini akan hanya tinggal pelengkap bila benih dan induk yang bebas virus sudah dihasilkan oleh panti induk skala nasional.
dicirikan dengan pengurangan nafsu makan dan beberapa udang yang berenang ke tepi pematang. Gejala selanjutnya adalah kematian lebih dari lima ekor per hari dan jumlah kematian bertambah drastis setiap hari dan tidak berhenti. Udang akan banyak yang berwarna merah sakit dan bertubuh lunak namun ada beberapa yang tubuhnya masih keras. Pada hari hari terakhir banyak bintik putih pada bagian dalam kulit dengan permukaan kulit yang tetap halus (Gambar 1). Kematian massal akan
terjadi pada hari ketiga hingga hari ke tujuh setelah kematian lima ekor atau lebih di hari pertama. Kema tian mendadak inilah ya ng dirasakan menghantui petambak karena selalu terlambat diantisipasi dengan panen karena ukuran tubuh yang belum ekonomis untuk dijual. Upaya pengobatan selalu dilakukan petambak dengan mengganti air atau memberikan obat obatan namun hampir selalu diikuti dengan kematian yang semakin banyak dan biaya yang semakin besar.
Gambar 1. Contoh kulit kepala udang yang terkena WSSV (Lightner, 1996)
Demikian seriusnya dampak serangan virus ini secara nasional, produksi udang tambak Indonesia menurun dari sekitar 180.000 ton/tahun di tahun 1995 menjadi sekitar 125.000 ton di tahun 2000 dengan luas tambak yang relatif semakin bertambah (menjadi 300.000 Ha). Di tingkat masyarakat, kegagalan ini berdampak sosial tinggi dengan menganggurnya buruh tambak, industri sampingan (rumah makan, warung, bengkel) dan semakin gelisahnya penduduk pesisir secara psikologis. Tidak sedikit perusahaan hulu dan hilir yang mengalami kerugian dan pemutusan hubungan kerja, rasionalisasi skala produksi. Penyelamatan usaha dilakukan dengan menerapkan teknik
pemeliharaan tertutup dengan benih yang terbukti beba s virus. Sistem yang di adopsi dan diintroduksikan BBPBAP Jepara sejak tahun 1998 ini masih diterapkan dengan sukses di berbagai daer ah namun diakui harus membutuhkan keterampilan dan ketekunan yang tinggi. Sistem ini juga terbatas diterapkan pada teknologi semi intensif hingga intensif. Kelemahan secara menyeluruh bagi penerap sistem tertutup adalah jarang adanya jaminan pembenihan bahwa benih yang akan dipakai tidak terinfeksi WSSV karena kelemahan waktu dan teknik sampling serta beban biaya analisis PCR yang harus dikompensasikan pada pembeli. Beralih pada jenis udang lain terutama udang P. vannamei dan
P. stylirostris telah dilakukan petambak dan berbagai lembaga penelitian dengan hasil produksi yang baik. Namun persaingan pasar dengan produsen yang sebenarnya untuk jenis udang ini membuat petambak Indonesia harus lebih bersiasat dalam musim tanam. Keberhasilan tampilan P. vannamei dan P stylirostris bukanlah disebabkan udang ini kebal terhadap WSSV namun lebih disebabkan induk udang ini tidak mengandung WSSV. Beberapa pengujian laboratorium dan bukti di lapangan menunjukkan kedua jenis udang ini sangat lemah terhadap infeksi WSSV pada umur berapapun.
Upaya mengatasi serangan penyakit ini sangat intensif dilakukan seluruh dunia bahkan oleh negara negara yang tidak memiliki industri udang penaeid seperti Belanda, Jerman dan Inggris. Hampir semua studi yang dilakukan mengarah pada pengenalan sifat dan dampak biologis virus ini pada tingkat jaringan dan sel. Sepertiga jumlah penelitian diarahkan untuk menghasilkan metode membuktikan keberadaan (kualitatif) dan jumlah (kuantitatif) penyakit virus ini. Penelitian mengenai penciptaaan kekebalan telah intensif dilakukan oleh peneliti Asia (Jepang, Cina, India dan Taiwan) dengan hasil cukup menarik namun harus hati–hati untuk diikuti karena immunostimulant tidak dapat mencegah penularan WSSV yang baru, berjangka waktu singkat dan mahal untuk diterapkan.
Penggunaan immunostimulant harus di mengerti sebagai upaya mengendalikan/menahan penyakit, bukan mencegah ataupun mengobati. Mengingat hasil tangkapan ikan di seluruh dunia akan terus menurun, dan jumlah penduduk yang semakin bertambah maka budidaya udang tetap akan menjadi usaha ‘papan atas’ yang akan memberikan kontribusi ekonomis yang sangat berarti bagi masyarakat yang menggelutinya dengan serius. Kasus serangan WSSV yang sangat luas hingga kini dapat ditemukan pada banyak jenis udang liar di laut namun bukannya tidak bisa diantisipasi dan disiasati. Hasil penelitian para ahli bila disintesis akan menghasilkan kiat–kiat yang dapat dipergunakan untuk berkelit dari masalah ini.
Biologi Udang
Udang windu dan udang penaeid lainnya tergolong krustasea yang tidak memiliki sistem pengingatan kekebalan. Sehingga penyakit yang sama dapat menyerang berkali kali dan dihadapi
dengan sistem kekebalan sederhana yang dimilikinya atau tidak dilawan sama sekali. Berdasarkan Phasarawipas, kemungkinan udang tidak bisa membuang vir us sehingga memiliki sistem penampungan virus (Viral accommodation theory) yang selanjutnya dipertegas; selama jumlahnya tidak berlebihan (Flegel dan Pasharawipas, 1998) yang dibuktikan dengan metode pengujian PCR dua langkah (2 step PCR).
Penelitian seorang ahli Indonesia di Australia menghasilkan teori bahwa udang membersihkan semua penyakit bakterial dan viral di kantung pembersihan (lymphoid organ spheroid–LOS) yang hanya akan berkembang bila udang tersebut sebelumnya sudah terpapar penyakit bakteri maupun virus (Anggraeni dan Owens, 2002). Organ ini tidak berkembang bila udang tersebut dipelihara dalam sistem yang steril di laboratorium sehingga hanya memiliki alat berupa Lymhoid organ (LO) saja. LOS secara teratur akan membersihkan virus virus yang lepas dari jaringan yang menampung virus dalam jumlah sedikit sehingga virus bebas ini tidak tumbuh di organ/tempat yang baru. Sedangkan yang bertugas membawa virus bebas ini ke LOS adalah sel sel darah (haemocyte). Sesampai di LOS, haemocyte dan virus bebas ini akan dibunuh dalam proses bunuh diri sel yang dikenal dengan istilah Apoptosis. Haemocyte terbunuh, demikian juga virus yang dikandungnya karena tubuh udang tidak bisa membunuh virusnya secara langsung. Perlu dimengerti bahwa virus asalnya tetap diakomodasi dan hidup di salah satu jaringan tubuh (Gambar 2). Keterangan tersebut dapat menjelaskan bahwa sekelompok udang yang positif tertular WSSV dideteksi dengan 2 step PCR (sangat sensitif untuk jumlah virus yang sedikit, dibandingkan 1 step PCR) tetap dapat berhasil dipelihara hingga panen. Perlu ditekankan bahwa udang ini sama sekali tidak dapat dikatakan kebal karena tidak pernah membunuh virusnya secara langsung dan tetap menampung virus (sedikit) dengan sifat yang tetap. Sifat dan keganasan virus ini sulit dikurangi karena tergolong ds DNA (double strand DNA) yang stabil dibandingkan RNA virus yang mudah bermutasi.
Sifat menampung virus inilah yang menjelaskan mengapa induk laut dapat terinfeksi virus namun mampu bertelur (tidak mati sejak awal) dan akhirnya menularkan virus tersebut pada keturunannya. Induk yang tertular virus inipun
memiliki dua nasib, bila setelah bertelur, jumlah virusnya mencapai >100.000 copy/µg DNA. Maka enam jam kemudian induk ini akan mati. Bila hanya mencapai 10.000 copy maka induk ini akan selamat namun tetap menularkan virusnya pada keturunan selanjutnya. Induk yang terinfeksi dan akhirnya mati ini ternyata disebabkan oleh berpindahnya sebagian besar haemocyte ke ovary (kantung telur) segera setelah telur dikeluarkan. Perpindahan ini karena haemocyte juga berfungsi membawa lemak (lipid) untuk kembali disimpan di ovary. Akibatnya proses pembersihan virus oleh haemocyte di LOS (Gambar 3.) tertunda atau terhenti, akibatnya virus akan bertebaran di organ yang baru dan berbiak cepat. Tubuh akan bereaksi balik dengan memerintahkan pembunuhan sel yang mengandung virus yang baru berkembang ini tetapi yang terbunuh adalah jaringan jaringan vital (syaraf, insang, otot dan lain lain) yang mengakibatkan kelumpuhan dan kematian udang itu sendiri.
Haemocyte sebagai kendaraan serba guna ini juga akan menghilang dari peredaran bila udang mengalami kejutan suhu dingin, rendah oksigen, terpapar Ammonia, diserang bakteri Vibrio atau terluka, selain molting dan habis bertelur (Le Moullac et al.,1999). Penggunaan parameter haemocyte sebagai indikator stress pada udang windu akan mulai dapat dimasyarakatkan di Indonesia pada awal tahun 2004.
Kesulitan baru yang muncul adalah penelitian beberapa ahli mulai mengarah pada pertanyaan, apakah WSSV mampu menahan apoptosis ! bukti buktinya adalah sel yang mengalami apotosis ternyata adalah sel-sel tetangga di sekitar sel yang terinfeksi, sementara sel yang mengandung virus tetap utuh ditengahnya (Wongpraset et al., 2003). Namun baiknya tubuh mampu membunuh sel
(apoptosis) dengan cara alternatif yang lain sehingga pada jaringan tertentu sel yang mengandung WSSV tetap ada yang mengalami kematian. Walaupun memerlukan penelitian lebih lanjut, kita harus mengerti bahwa menghilangkan virus ini 100% dari dalam tubuh udang sejauh ini masih belum memungkinkan dan masih memerlukan waktu dan kajian yang lebih banyak.
Peranan Lingkungan
Pengamatan Tsai et al. (1999) di Taiwan menunjukkan bahwa hampir semua penyakit WSSV meledak pada musim penghujan, musim panca roba dan musim dingin. Di benua Amerika, kematian P. vannamei akibat WSSV paling banyak terjadi pada musim dingin (Granja et al., 2003).
Secara kronologis, hampir semua serangan penyakit WSSV terjadi pada umur >30 hari. Padahal umumnya ukuran muda (benih) adalah ukuran yang paling rawan terhadap serangan penyakit sehingga bila suatu populasi diketahui sudah terserang virus sejak awal, seharusnya populasi tersebut segera mengalami penyakit sejak masih kecil > kenyataannya penya kit ter sebut mampu diakomodasi oleh udang hingga usia >30 hari. Berdasarkan Chanratchakool and Limsuwan (1998) dan Avnimelech dan Rotva (2003) usia tambak >30 hari hampir identik dengan kondisi mulai memburuknya dasar tambak yang berdampak pada menurunnya kualitas air. Percobaan Tsai et al. (1999) yang berhasil memelihara udang terinfeksi WSSV hingga 13 bulan tanpa kematian yang berati, dilakukan pada bak berukuran 1.000 m2 dan
berdasar semen.
Penelitian pada 188 buah tambak intensif di Thailand (Withyachumnarnkul et al. 2003) menunjukkan bahwa walaupun sebagian besar
Gambar 3. Model mekanisme pembersihan virus oleh LOS pada haemocyte sebagai alat transportasi dan faktor faktor yang mengurangi jumlah haemocyte beredar
benih yang terinfeksi mengakibatkan kematian prematur (>90 hari), namun terdapat 50 buah kasus yang positif tertular namun tidak berakhir dengan panen prematur. Data penelitian ini menunjukkan bahwa tambak terinfeksi yang berhasil panen baru terdeteksi mengandung WSSV setelah 1 bulan pemeliharaan yang menunjukkan rendahnya tingkat penularan. Secara analogis, dapat dimengerti bahwa benih harus terinfeksi WSSV dalam tingkat yang sedikit/rendah dan tambak harus berkondisi air dan tanah yang baik untuk mencegah stressor yang berlebihan agar udang dapat dipelihara hingga panen dengan berhasil.
Sumber Stressor
Hujan yang menyebabkan salinitas turun mendadak (hypoosmotic) adalah stressor yang paling berat dan dapat dengan mudah dibuktikan dala m skala lapangan maupun laboratoris. Perubahan mendadak sebanya k 4 ppt akan mengakibatkan respon stres molekular dengan timbulnya heat shock protein (HSP) yang akan terdeteksi paling cepat 6 jam setelah mengalami stress. Stressor kedua adalah penurunan suhu (hypothermia) mendadak dan dialami selama minimal 2 jam juga akan menimbulkan HSP.
Hasil studi risk factor analysis yang mendetail di India dan Vietnam oleh tim Mohan, Corsin, Turnbull dan beberapa ahli lokal sejak tahun 1999 menunjukkan hal”hal yang menarik. Teknik ini mengumpulkan faktor apa saja yang mungkin berpengaruh pada keberhasilan pemeliharaan udang dengan data dari hampir 300 petambak. Kekuatan analisis ini adalah semakin banyak data, faktor tertentu akan semakin kuat pengaruhnya. Faktor-faktor yang dianggap beresiko membuat petambak gagal karena penyakit virus WSSV adalah :
1. Benur yang berukuran kecil 2. Musim dingin
3. Penggunaan pakan buatan 4. Jumlah udang mati
5. Periode ditemukannya udang terinfeksi WSSV
Ukuran
Ukuran udang ditebar pada saat panen sangat berhubungan dengan stress transportasi dan adaptasi makanan hidup alami. Hampir seluruh teknik penebaran benih (warna air, pengaturan waktu, suhu
dan salinitas) dilakukan dengan standar walaupun ukuran benihnya bervariasi. Benih yang lebih kecil akan lebih bersifat planktonik (melayang/berenang), tertarik cahaya dan terbiasa dengan pemberian pakan sebanyak 8 kali sehari. Sebaliknya benih yang sudah berukura n lebih besar akan menghindari cahaya dan mengandalkan makanan yang memang tersedia didasar tambak sehingga tingkat kehidupannya akan jauh lebih tinggi di awal masa penebaran.
Bila pakan hidup tersedia di dasar tambak dan benih kecil selalu mencari pakan di permukaan atau kolom air maka udang ini akan mengalami kelaparan. Benih yang sudah terinfeksi WSSV walaupun dalam tingkat rendah (dibuktikan dengan 2 step PCR) bila berpuasa akan berpotensi meningkatkan derajad infeksinya sehingga akan mudah dideteksi dengan 1 step PCR sekalipun.
Musim
Musim hujan dan musim dingin merupakan faktor yang paling terbukti berpengaruh pada meledaknya penyakit pada udang yang sejak awal sudah terinfeksi WSSV tingkat rendah (2 step PCR) lebih lebih yang terinfeksi tingkat tinggi (1 step PCR). Musim hujan akan sangat menimbulkan stress karena kejutan salinitas, suhu dan fluktuasi oksigen ser ta pH yang sa ngat tinggi (Chanratchakool dan Limsuwan, 1998; Boyd, 1989). Musim dingin juga terbukti musim mewa bahnya kasus WSSV pa da uda ng P vannamei.
Mensiasati Jumlah Udang yang Mati
Bila jumlah udang yang mati di tepi pematang mencapai 5 ekor per hari dan keesokan harinya tetap lima ekor atau bahkan bertambah maka panen harus segera diputuskan. Parameter ini dapat dipercaya karena hasil pengamatan di Jepara menunjukkan bahwa untuk seekor udang yang mati maka sebenarnya udang tsb telah mewakili 10 udang lainnya bila ukuran tubuhnya 3 g dan mewakili 40 udang lainnya bila telah mencapai lebih dari 5 g. Standar perlakuan di BBPBAP Jepara di musim tanam yang normal (salinitas dan suhu optimum) adalah memanen udang yang menepi walaupun udang tersebut sehat sehingga lebih baik salah tangkap ketimbang udang terlanjur mati dan dikonsumsi oleh udang lain yang masihseha t. Hasil pengamatan di Jepara, pema nenan a ktif seperti ini ter bukti dapat menyelamatkan udang intensif (30 ekor/m2) yang
bermasalah WSSV dari 4 kolam dalam periode yang berbeda namun berdekatan.
Perhitungan Faktor Periode Ditemukannya
WSSV
Penelitian di India dan Vietnam menunjukkan bila penyakit baru dideteksi pada bulan kedua maka kemungkinan selamat akan tinggi. Sekali lagi kita harus berhati hati dan mencermati parameter ini. Seba nyak 30 sampel udang yang t elah ‘memunculkan’ penyakitnya sejak awal hingga bulan pertama dengan uji PCR menandakan tingkat infeksi yang tinggi diantara populasi udang. Bila baru mucul di bulan kedua artinya tingkat serangan cukup rendah terlebih bila baru bisa dideteksi dengan 2 step PCR. Namun infeksi pada bulan kedua tetap harus diwaspadai agar tidak berkembang menjadi lebih tinggi atau lebih banyak dengan menghindari stress lingkungan.
Penyebab Keberhasilan
Studi yang dilakukan para ahli tersebut juga menyimpulkan bahwa petambak yang udangnya berhasil panen walaupun terinfeksi WSSV erat hubungannya dengan 2 faktor yaitu:
1. Gejala serangan vibrio pada kaki renang dan ekor
2. Kehadiran kepiting dan ikan gobid Kelemahan metode risk factor analysis adalah kesimpulan sebuah pa rameter yang pengaruhnya sebenarnya tidak langsung atau tidak ada (tidak koheren) namun secara statistik (angka) tersebut sangat kuat. Kedua faktor di atas harus secara hati hati diterima kerena agak bertentangan dengan anjuran biosecurity (tertutup) yang justru berhasil diterapkan bertahun tahun dalam jumlah ulangan dan skala yang lebih besar dan dalam level teknologi semi intensif dan intensif di Thailand dan Amerika Latin. Jika stabilitas kualitas lingkungan (melalui manajemen kualitas air yang tepat) dapat dijaga maka kehadiran organisme lain akan memaparkan udang windu yang dipelihara dengan bakteri/virus baru (patogen sejati atau fakultatif) secara lebih intensif dengan akibat terbentuknya LOS dari asal mulanya LO. Dengan aktifnya LOS, maka proses pembunuhan haemocyte yang membawa WSSV akan lebih intensif dan teratur
dilakukan. Sehingga jumlah tidak bertambah dan bisa dipelihara hingga saat panen
Bila stress lingkungan merupakan faktor meledaknya kasus penyakit maka monitoring teratur terhadap tingkat stress akan membuat kita mampu meramal saat akan terjadinya peledakan penyakit.
Heat Shock Protein (HSP)
Stress terhadap kedinginan (hypothermia) dan salinitas rendah (hypoosmotic) pada P. monodon telah terbukti menghasilkan HSP 86 (Corsin et al., 2002) sedangkan pemanasan (hyperthermia) dari 27°C hingga 34°C terbukti justru meningkatkan produksi apoptosis dan menyelamatkan udang yang di tulari WSSV hingga SR–nya mencapai 60–70%. Pada saat kepanasan (hyperthermia), HSP yang diproduksi pada organisme pada umumnya adalah HSP–90.
HSP sendiri merupakan molekul protein yang banyak berfungsi sebagai komponen perbaikan dari protein lain yang rusak, terlipat dan terputus. Tetapi timbulnya HSP juga merupakan indikasi terjadinya stress besar. Stres besar dalam jangka waktu lebih dari 6 jam akan bisa ditolerir oleh udang yang bersih dari virus tetapi akan menjadi stress yang berlebihan bagi udang yang sudah mengandung virus. Bagi udang yang sudah mengakomodasi virus, stress merupakan pemicu berkurangnya proses pembersihan virus, berubahnya arah tujuan haemocyte yang mengandung virus sehingga virus akan bertebaran di mana-mana dan melakukan pembelahan (replikasi) dan direspon tubuh dengan pembunuhan sel (apoptosis) secara massal (Sahtout et al., 2001).
Bila dalam periode musim dingin udang yang dipelihara sudah terus menerus memproduksi HSP 86, maka petambak sudah harus sudah bersiap panen karena tanpa melihat WSSV melalui uji PCR yang jauh lebih mahal, dalam waktu tertentu WSSV tersebut akan berganda dan akan mulai mematikan sebagian udang yang dipelihara.
Hemogram
Beberapa indikator stress lain yang juga sangat bermanfaat adalah dari jumlah haemocyte yang dapat ditemukan sedang bersirkulasi di dalam tubuh. Udang yang mengalami stress karena luka dan penyakit bakterial akan mengalami kekurangan haemocyte. Kondisi ini jelas akan berbahaya bagi
udang yang sedang mengakomodasi virus dan secara teratur membersihkan virus virus baru. Jumlah haemocyte udang yang normal adalah 2x107sel/ mL haemolymph (ca iran dara h).
Haemocyte di udang yang mengalami stress hypothermia, hypoxia dan hypoosmotic dan peningkatan NH3–N akan menurun jumlahnya dan seterusnya akan meningkatkan jumlah partikel WSSV (Le Moullac et al., 1999). Contoh lain, dalam uji kekebalan P. stylirostris terhadap serangan bakteri Vibrio penaeicida. Udang yang selamat seluruhnya memiliki THC da n aktivitas phenoloxydase darah (sistem kekebalan dasar) yang tinggi ketimbang udang yang mati terkena bakteri fatogen tersebut.
Pengukuran jumlah butiran darah di dalam haemocyte ini dilakukan setelah memberi zat capuran anti penggumpal di dalam tabung suntik sebelum darah disedot. Untuk keperluan penelitian, komposisi jenis jenis hameocyte (%) antara udang yang berbeda kondisi juga memiliki perbedaan (Van de Braak, 2002).
Waktu Penggumpalan Darah
(Clotting Time)
Hampir semua jenis darah memiliki sifat clotting (menggumpal) agar dapat menutupi luka. Sifat ini juga dimiliki haemolymph udang. Salah satu jenis sel darah yang bertugas menggumpal ini adalah sel darah yang paling muda (hyalinocyte–Hc). Berkurangnya sel darah akibat stressor juga akan
mengurangi jumlah Hc sehingga darah akan lebih lambat menggumpal atau tidak pernah akan menggumpal walaupun cair an dara hnya (haemolymph) dapat diambil dalam jumlah banyak/ normal. Susunan sifat WSSV juga diketahui memiliki kemampuan anti koagulasi, sehingga udang yang terserang WSSV berpeluang tidak dapat menggumpal (Van de Braak, 2002). Darah udang yang normal rata–rata akan menggumpal dalam waktu kurang dari empat menit. Lebih dari waktu ini akan berarti bahwa udang dalam status sakit ataupun stres.
Parameter clotting time ini tergolong yang paling ringkas karena tidak memerlukan sarana laboratorium dan membuat petambak mengenal kondisi kesehatan udang yang sesungguhnya, yang secara visual seringkali masih dianggap normal (asymptomatic). Pengambilan darah untuk uji THC atau Clotting time dapat dilakukan dengan mudah sekali, hanya dengan menusukkan jarum halus sedalam 2–3 mm di pangkal salah satu kaki jalan terakhir dan menyedotnya dengan perlahan sebanyak 0,1 mL untuk Clotting time dan sisanya untuk THC. Penghitungan waktu penggumpalan (clotting time) harus dilakukan segera setelah darah disedot dengan mengusiknya dengan jarum/tusuk gigi hingga terlihat menggumpal. Sebaiknya udang yang baru dihisap darahnya tidak dikembalikan ke tambak karena beresiko terserang WSSV (karena haemocyte yang berkurang (Gambar 3) dan memulai rantai kematian.
Gambar 3. Menghitung jumlah haemocyte atau menghitung jumlah masing masing jenis haemocyte dan melihat kondisi haemocyte dibawah mikroskop (Van de Braak et al., 2002 dan Wongpraset et al., 2003).
Managemen Lingkungan Pada Tambak
Beresiko WSSV
Kematian akibat WSSV yang hampir selalu terjadi setelah udang dipelihara 30 hari atau lebih memunculkan beberapa hipotesis; penyakit semakin banyak, kekebalan udang menurun dengan membesarnya ukuran, kanibalisme yang semakin tinggi, stres abiotik dan biotik yang semakin kerap/ intensif. Jawaban yang dapat mewakili semua hipotesis tersebut adalah hipotesis baru: semakin bertambahnya usia pemeliharaan akan semakin banyak sisa pakan, dan akan semakin memburuk kualitas air dan semakin stress udang yang dipelihara. Di padukan dengan meningkatnya proses kanibalisme oleh udang udang yang agresif, stres akan semakin bervariasi dari ba han toksik sementara, toksik permanen, luka kanibalisme dan pakan yang kurang. Kurangnya konsumsi pakan bukan disebabkan pemberian yang kurang tetapi disebabkan memburuknya kualitas air dan tanah dan ancaman udang yang berukuran lebih besar/lebih sehat.
Deteksi Masalah Melalui Pengukuran
Parameter Penting
Penurunan salinitas dan suhu air tambak dapat dideteksi dengan indra manusia dan para petambak sudah terbisa mengenalnya namun masing-masing mengantisipasi dengan beberapa cara yang berbeda. Parameter yang berbahaya namun sulit dideteksi adalah tingkat kelarutan oksigen (DO). Pada tingkat 3 mg/L udang masih mengkonsumsi pakan namun tidak bisa tumbuh, bila kurang dari 3 mg/L maka nafsu makan sudah hilang. Bila kurang atau sama dengan 2 mg/L udang sudah stres, puasa dan pertumbuhan negatif dan sangat beresiko pada peledakan penyakit viral dan bakterial. Pada DO=1 mg/L, dibeberapa lapisan tanah proses penguraian anaerob semakin banyak terjadi dan menghasilkan zat-zat beracun.
Kesulitan petambak adalah anggapan alat DO meter yang berharga mahal yang sebenarnya bisa diatasi bila satu alat dibeli oleh 2–5 petambak untuk meliput 10–15 petak tambak per hari. DO seharusnya diukur pada pagi hari sesaat sebelum matahari terbit karena saat itulah DO yang terendah, bila tambak terlalu banyak atau luas sampel masih dapat diambil oleh pekerja tambak di dalam botol gelap tertutup dengan tidak menyisakan
udaranya (ditutup di dalam air). Pengukuran selanjutnya dapat dilakukan di satu tempat dalam waktu yang bersamaan. Menduga penurunan DO berdasarkan asumsi semakin banyak biota (plankton, partikel organik dan bakteri) akan semakin tinggi konsumsi oksigen dikenal dengan laju konsumsi oksigen biologis (BOD). Angka apparent BOD ini sebenarnya berada dibawah BOD yang sebenarnya karena telah meniadakan faktor lumpur dan udang yang juga mengkonsumsi oksigen.
Manajemen Kualitas Tanah
Jarang praktisi dan peneliti yang memperhatikan kualitas tanah tambak. Tanah tambak berfungsi seperti spon yang mampu menyerap racun dalam jumlah banyak dan bila tertekan akan melepaskannya sekaligus dalam jumlah yang banyak pula. Status kualitas tanah dan racun yang dikandungnya dapat dimengerti melalui pengamatan langsung pada tanah tersebut. Namun pengukuran kualitas tanah itu sendiri harus dilakukan dengan disain sampling yang tepat ka rena pengukuran hanya dipinggir tambak akan selalu menghasilkan data kulitas tanah yang baik, tidak seperti ditengah tambak yang selalu menghasilkan data jelek sejak minggu kedua pemeliharaan.
Cara praktis untuk menduga status kualitas tanah adalah dengan mengukur redox potential tanah dan laju konsumsi oksigen (soil oxygen demand–SOD) oleh permukaan tanah. Redox potensial tanah terendah yang masih aman adalah –150 mV sehingga apabila 70% permukaan tanah tambak masih belum mencapai angka –200mV maka tambak tersebut masih dapat diharapkan panen untuk dua minggu selanjutnya.
SOD yang aman bagi kelanjutan pemeliharaan udang adalah di awal 60 mg O2/m2/
jam dan di akhir pemeliharaan maksimum 330 mg/ O2/m2/jam. Pada bulan ketiga dan keempat
pemeliharaan, tanah adalah pengkonsumsi 50% oksigen yang tersedia di tambak, Sisanya untuk fitoplankton dan bekteri dan udang hanya memperoleh sekita r 20–25% oksigen. Meminimumkan luas daerah yang memiliki redox– 200 mV dapat dilakukan dengan pengaturan kincir, pembuangan air dasar dan parit perangkap endapan tambak (Gambar 4.) Untuk mengurangi laju penurunan redox tanah dasar tambak dapat dilakukan dengan pemupukan Nitrat (
NO
3–N) sekitar 5 mg N/liter yang oleh banyak ahli dikatakanmemiliki kapasitas oksidasi yang kuat. Penggunaaan nitrat tidak akan bereaksi dengan partikel organik seperti chlorine dan H2O2 sehingga tidak akan berbahaya untuk udang yang dipelihara (Avnimelech dan Rotva, 2003). Penambahan nitrat
akan mampu membuat redox menjadi positif (dapat mencapai 300 mV) pada lapisan tanah setebal 15 mm (Meijer dan Avnimelech, 1999), mencegah pembentukan sulfide dan methan (Jenneman et al, 1986)
Gambar 5. Dasar tambak yang dilengkapi saluran dalam untuk mengumpulkan limbah organik dan (dapat dilengkapi) outlet khusus.
Peluang dan Kiat Petambak
Dewasa ini laboratorium PCR sedang banyak didirikan di Indonesia, walaupun akurasi deteksi alat PCR mencapai 100% namun pemanfaatannya harus efektif agar biaya tidak tinggi untuk hal yang sia– sia. Penggunaan PCR untuk udang ditambak petani sangat tidak dianjurkan karena sudah sangat terlambat, monitoring WSSV di tambak dapat dilakukan dengan teknik histologi yang lebih sederhana dan murah.
Memanfaatkan Pengujian PCR Secara
Efektif
Uji dengan PCR seharusnya dilakukan pada benih yang akan ditebar. Uji PCR pada benih harus dilakukan pada sampel yang banyak agar walaupun 1 ekor yang tertular diantara 300 ekor, masih dapat dideteksi dengan 2 step PCR. Petambak kecil hendaknya bersatu dengan petambak lainnya untuk menguji infeksi WSSV dari salah satu bak yang akan ‘diborong’ agar biaya PCR (Rp 300.000,-) dapat di tanggung bersama.
Satu hal yang perlu dicatat adalah menguji benur secara massal hanya dapat dilakukan pada benih usia kurang dari PL 10. Bila melebihi PL 10 maka setiap PL yang akan diuji harus dibuang kedua tangkai matanya, baru tubuhnya di satukan dan digerus untuk dianalisa. Tangkai mata udang >PL 10 diketahui akan membiaskan hasil uji PCR sehingga seolah olah bebas virus (false negative) (Tsai et al., 1999).
Meningkatkan derajad penularan agar infeksi WSSV semakin mudah dideteksi adalah dengan
menampung benih dalam jumlah padat selama 6 jam tanpa diberi pakan dengan aerasi yang rendah. Stress yang terjadi karena starvasi, kanibalisme dan rendah oksigen akan meningkatkan populasi WSSV sehingga akan lebih mudah dideteksi dengan 2 step PCR. Cara yang lebih praktis adalah dengan teknik pencucian formalin 100 mg/L 30 menit dalam aerasi yang cukup, benih yang mengendap baik besar maupun kecil dapat dipakai untuk sampel uji PCR juga selama ukurannya lebih kecil dari PL 10. Bila lebih besar harus dipotong tangkai matanya.
Bagi pembenihan, memelihara benih hingga 21 hari dan akhirnya terdeteksi mengandung WSSV merupakan kerugian sehingga pembenihan harus menduga kualitas benih dengan menguji kaki renang induk yang telah selesai bertelur 6 jam kemudian dengan PCR. Bila positif tertular maka induk dan telurnya harus segera di eliminasi. Pengujian lebih lanjut juga dilakukan pada benih yang telah mencapai stadia PL 1 hingga PL 8 sebelum diuji oleh petambak calon pengguna.
Secara ringkas dapat di uraikan bahwa benih sebanyak 300 ekor dikumpulkan, digerus dan diuji dengan 2 step PCR. Bila hasil ini positif, sebanyak 150 ekor benih baru, digerus dan diuji dengan 1 step PCR. Bila hasil uji kedua positif, benih ditolak. Bila uji 1 step PCR ini negatif maka benih ini masih dapat lolos dengan harga yang murah karena beresiko mati ditambak terutama pada :
1. Petambak yang memiliki sarana terbatas, 2. Menebar dengan kepadatan >30/m2 di
tambak intensif dan diatas 0,6 ekor/ m2 di
tambak tradisional
4. Lahan tua lebih dari 6 siklus memelihara udang,
5. Ditebar pada musim pancaroba.
Hasil terbaik di tambak untuk benih yang terinfeksi rendah adalah bila menginfeksi kurang dari 2 persen benih benih yang ada (Prevalency< 2%). Hasil paling ideal adalah bila >300 ekor benih menunjukkan hasil negatif terhadap uji 2 step PCR. Metode sampling yang terpola seperti di atas akan sangat menghemat biaya dan meningkatkan efektivitas penggunaan PCR sehingga petambak dan pembenihan tidak alergi dengan pemanfaatan metode yang sangat akurat ini.
Menghindari Stres Buatan Manusia
Dalam masa transisi penggunaan PCR di Indonesia, hasil negatif walaupun benih sebenarnya positif mengandung virus sangat mungkin terjadi. Bila uji dua tahap dilakukan, maka tingkat infeksi ini adalah tingkat yang rendah sehingga peluang untuk panen tetap terbuka selama petambak mampu mengurangi stres biotik dan abiotik.Tambak tradisional Indonesia dengan kedalaman 30 cm sangat berbeda dengan tambak serupa di India dan Vietnam yang memiliki kedalaman rata–rata 60 cm. Tambak Indonesia banyak yang berkembang dari tambak ikan bandeng yang memang membutuhkan penumbuhan klekap di dasar yang dangkal. Memperdalam tambak keseluruhan atau memperbanyak bagian yang dalam dan hanya menebar sesuai dengan luas bagian yang dalam adalah strategi yang tepat bagi petambak tradisional Indonesia untuk menghindari stress berlebihan pada udang yang dipelihara. Padat penebaran yang paling aman untuk petambak tradisional adalah 0,5–0,7 ekor/m2 untuk daerah yang
dalam. Lebih dari kepadatan ini peluang akan mati oleh WSSV akan semakin besar.
Tambak Intensif juga memiliki ciri yang sangat spesifik pada setiap lokasi namun secara keseluruhan dapat dikatakan bahwa petambak Indonesia masih berkonsentrasi pada air ketimbang ‘bom’ sedimen. Tambak yang dirancang ideal persegi panjang atau bujur sangkar memiliki keunggulan pengaturan sedimen dengan baik. Kincir air seringkali digunakan sebagai penambah daya tampung udang (kepadatan tinggi) namun jarang disadari sebagai pengatur pembuangan sedimen organik. Sedimen organik yang boleh tertinggal ditambak seharusnya maksimum hanya 40% luas
tambak di akhir masa pemeliharaan sehingga 60% wilayah seharusnya tetap bersih.
Pematang yang tergerus oleh arus kincir merupakan penyumbang terbesar sedimen (60– 80%) sehingga idealnya pematang dilindungi secara permanen (tembok/ plastik) atau secara tidak permanen dengan kasa. Kincir juga diatur agar tidak terlalu berdekatan dengan pematang (10–12 m) agar arus di pinggir tidak sekuat di tengah. Kincir air yang terbaik adalah kincir berangkai yang dipadani dengan pematang yang permanen/ kokoh. Bila kincir tunggal yang akan dipergunakan maka jumlah idealnya untuk tambak tanah yang sudah tua adalah sebuah kincir untuk 250 kg udang. Bagi tambak yang pengaturan aliran airnya sulit, caren yang sempit tetapi dalam >0,5 m di tengah dasar tambak dapat berfungsi sebagai penampungan sedimen organik yang secara berkala dapat disifon atau bahkan di diamkan hingga panen berakhir.
Aplikasi Probiotika dan Sistem Heterotroph
Penggunaan probiotik untuk air secara intensif terbukti efektif dalam beberapa percobaan skala produksi. Keberhasilan dalam skala massal juga diduga berkaitan erat dengan penggunaan probiotika. Aplikasi probiotika dalam skala massal ditambak (4 buah intensif dan 4 buah semi intensif) dimulai sejak awal penebaran terbukti dapat berproduksi normal (4 bulan kemudian) untuk benih yang terinfeksi rendah pada 25% populasi.Penggunaan probiotik dengan cara yang benar juga terbukti membuat dasar tambak tidak membusuk sehingga ideal diterapkan pada tambak yang sulit mengatur aliran airnya, tambak yang jarang ganti air dan petambak yang berpendapat aerasi dapat menentukan kepadatan pemeliharaan. Kunci semua nya ada lah probiotik yang membutuhkan oksigen dan karbon akan mempercepat proses dekomposisi secara aerobik sehingga tidak sempat menyerap ke dalam sedimen dan didaur ulangkan dalam bentuk biomassa bakteri dan sedikit fitoplankton (system heterotroph). Kondisi ini membuat kestabilan kualitas air yang lebih besar selama aerasi tidak terhenti dan menyebabkan tingkat infeksi WSSV tidak meningkat. Efek tidak langsung dari penggunaan probiotika adalah bakteri Vibrio yang tidak berkembang, terbentuknya LOS pada tubuh udang dan ketersediaan pakan alami (biomassa bakteri) dan pasokan immunostimulant alami yang lebih teratur. Udang terinfeksi yang
dipa nen pada empat bulan kemudian akan menunjukkan kualitas fisik yang normal hingga baik sekali namun udang ini tidak boleh dikatakan kebal WSSV karena pemindahan udang ini ke bak bak percobaan langsung diikuti dengan stress yang berat, peningkatan infeksi dan kematian massal oleh WSSV dalam 3–4 hari kemudian.
Arah Masa Depan
Dengan strategi pemanfaatan fasilitas serta sumberdaya yang ada maka sebenarnya Indonesia dengan mudah akan mengejar produksi udangnya dalam jangka pendek maupun jangka panjang. Dalam jangka pendek, penempatan laboratorium PCR hendaknya disesuaikan dengan sentra induk atau sentra pembenihan bukan sentra pertambakan. Bila di negara lain para individu petambak yang aktif mela ksanakan uji PCR maka di Indonesia, menggerakkan kelompok tambak untuk bersama membayar uji PCR akan jauh lebih effektif dan murah. Efektif juga dikarenakan petambak suatu wilayah seluruhnya akan menebar benih yang bebas
WSSV atau minimal terinfeksi sangat rendah. Program jangka panjang namun harus dimulai sejak sekarang adalah dengan membangun konsorsium induk udang nasional. Dikatakan konsorsium karena biaya operasional yang tinggi namun memerlukan teknik managerial yang profesional dengan sistem audit yang baik (karena bernilai strategis) serta insentif yang disesuaikan dengan pencapaian target serta produktivitas.
Konsorsium terdiri atas para peneliti dari lembaga perikanan pemerintah, perguruan tinggi dan pemerintah daerah serta perusahaan swasta yang memiliki komitmen pada keberlanjutan kegiatan ini dalam jangka waktu minimal 5 tahun. Fasilitas utama akan menghasilkan induk penjenis dan menyebarkan benih calon induk (bakalan) ke fasilitas regional. Fasilitas regional akan membesarkan benih dan menjual induk bebas virus dan atau unggul ke pembenihan di daerah seperti tampak dibawah (Gambar 4).
Gambar 4. Jenis kegiatan dan input produksi masing masing rantai produksi program induk nasional.
Bank Induk
Pembenihan Benih SPF Induk SPF/ Induk Unggul Pembesaran Regional Induk SPF Regional Pembenihan Swasta / Daerah komersil Sumber Induk Petambak rakyat Petambak intensifNational Broodstock Centre
Regional Broodstock Centre
Konsumen Akhir
Kegiatan produksi induk udang nasional ditetapkan pada jenis udang windu, udang putih (P. Merguiensis dan P. indicus) serta udang api api (Metapenaeus monoceros). Udang windu adalah udang yang relatif sulit diproduksi dunia di masa mendatang karena kelangkaan induk alam sehingga bila produksi dikuasai, Indonesia akan menguasai pasar tersendiri. Mengingat strategisnya kegiatan ini maka tim yang terlibat dalam skala nasional dan regional harus dapat menjaga kerahasiaan seluruh informasi proses produksi. Melalui perencanaan yang baik, induk udang windu bebas virus tertentu (specific pathogen free/SPF) akan dihasilkan dalam 3 tahun proyek berjalan dan induk yang unggul akan mulai dihasilkan pada tahun kelima dan seterusnya setiap tahun. Udang P. merguiensis dan P. indicus merupakan model dasar penciptaan induk SPF Indonesia yang akan dilanjutkan dengan seleksi pertumbuhan unggul. Hasil induk SPF dan unggul udang ini bahkan telah dapat dipasarkan pada tahun kedua proyek berjalan. Produksi induk udang api api merupakan buffer institusi induk udang nasional dan regional terhadap ketersediaan udang alam sebagai sumber penghasilan nelayan rawa–rawa dan pesisir
Kesimpulan
1. Benih yang telah terinfeksi WSSV dengan uji 1 step PCR wajib dimusnahkan dan tidak boleh dipergunakan untuk pembesaran di tambak 2. Pembenihan harus menguji induk yang selesai
bertelur dengan 2 step PCR) sebelum terlanjur mengeluarkan biaya pemeliharaan benih udang yang terinfeksi.
3. Peningkatan produksi udang melalui jenis udang windu di Indonesia dapat dilakukan melalui siasat menghindari stressor buatan manusia di tambak atau stressor alami (hujan dan musim dingin) terutama untuk benih yang dideteksi terinfeksi sangat rendah (dengan 2 step PCR) 4. Program memasyarakatkan uji PCR pada pelaksana industri udang harus dimulai di daerah pembenihan agar lebih efektif dan murah terlebih bila biaya ditanggung oleh kelompok tambak
5. Kesinambungan produktivitas dan daya saing udang Indonesia di masa mendatang dapat direbut melalui pembentukan sebuah konsorsium induk udang na sional yang melibatkan pemerintah dan swasta
Daftar Pustaka
Anggraeni, M.S. and L. Owens. 2000. The haemocytic origin of lymphoid organ spheroid cells in the penaeid prawn Penaeus monodon. Diseases of Aquatic Organisms, 40: 85–92.
Avnimelech, Y. and G. Rotva. 2003. Shrimp and fish pond soil: processes and management. Aquaculture,
220: 549–567.
Boyd, C.E. 1989. Pond water aeration systems. Aquac. Eng., 18: 9–40.
Chanratchakool, P. and C. Limsuwan. 1998. Application of PCR and formalin treatment to prevent white spot disease in shrimp. Aquatic Animal Health Research Institute, Dept of Fisheries, Bangkok, Thailand.
Corsin, F., J.F. Turnbull, N.V. Hao, C.V. Mohan, T.T. Phi, L.H. Phuoc, N.T.N. Tinh and K.L. Morgan. 2002. Risk factor associated with white spot syndrome virus infection in a Vietnamese riceshrimp farming system. Disease of Aquatic Organisms, 47: 1–12.
Flegel, T.W. and T. Pasharawipas. 1998. Active viral accommodation: a new concept for crustacean response to viral pathogens. In: Flegel T.W. (Ed.),
Advance in Shrimp Biotechnology, National Cen tr e for Gen etic En gin eer in g an d Biotechnology., Bangkok. pp. 245–250.
Granja, C., L.F. Aranguren, O.M. Vidal, Aragon and M. Salzar. 2003. Does hyperthermia increase apoptosis in white spot syndrome virus (WSSV) infected Litopenaeus vannamei ? Dis. Aquat. Org., 54: 73–78.
Jenneman, G.E., Mc M.J. Inerney and R.M. Knapp. 1986. Effect of nitrate on biogenic sulfide production,
Appl. Environ. Microbiol. 51: 1205–1211.
Le Moullac, G.E., M.L. Groumellec, D. Asquer, S. Froisseard, P. Levy and Aquacop. 1999. Haematological and phenoloxidase activity changes in the shrimp Penaeus stylirostris in relation with the moult cycle: protection against vibriosis. Fish and Shellfish Immunology, 7: 227– 234.
Lightner, D.V. 1996. A Handbook of shrimp pathology and diagnostic procedur es for diseases of cultured penaeid shrimp. J. World Aquaculture Society, Baton Rouge, Louisiana, USA, 7: 93–98.
Lightner, D.V., R.M. Redman, B.T. Poulos, L.M. Nunan, J.L. Mari, C.R. Pantoja, Q. Wang, J.L. Zhou, S. Durand, K.W. Hasson and B.L. White. 2001. The penaeid shrimp viruses TSV, IHHNV, WSSV and YHV: current status in the Americas, available diagnostic methods and management strategies.
haematopoietic tissue in haemocyte production
and maturation in the black tiger shrimp (Penaeus monodon). Fish and Shellfish Immunology, 12 (3): 253–272.
Withyachumnarnkul, B., V. Boosaeng, R. Chomsoong, T.W. Flegel, S. Muangsin and G.L. Nash. 2003. Seasonal variation in white spot syndrome virus positive samples in broodstock and post larvae of Penaeus monodon in Thailand. Dis. Aquat. Org., 53: 167–171.
Wongpraset, K., K. Khanobdee, S.S. Glunukarn, P. Meeratana and B. Withyachumnarnkul. 2003. Time course and levels of apoptosis in various tissues of black tiger shrimp Penaeus monodon
infected with white spot syndrome virus. Disease of Aquatic Organisms, 55: 3–10.
Meijer, L.E. and Y. Avnimelech. 1999. On the use of micro electrodes in fish pond sediment. Aquacultural engineering, 21: 71–83
Sahtout, A.H., M.D. Hassan and M. Shariff. 2001. DNA fragmentation, an indicator of apoptosis, in cultures black tiger shrimp Penaeus monodon
infected with white spot syndrome virus (WSSV).
Disease of Aquatic Organisms, 44: 155–159.
Tsai, M F., G.H. Kou, H.C. Liu, K.F. Liu, C.F. Chang, S.E. Peng, H.C. Hsu, C.H. Wang and C.F. Lo. 1999. Long term presence of white spot syndrome virus (WSSV) in a cultivated shrimp population without disease outbreaks. Dis. Aquat. Org., 38: 107–114.
Van de Braak, C.B.T, M.H.A. Botterblom, N. Taverne, W.P.W. Van Der Knaap and J.H.W.M. Rombout.
