METODE Waktu dan Tempat Materi Sampel DNA Primer

METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan September 2010 sampai dengan bulan Pebruari 2011. Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Bagian Pemuliaan dan Genetika dan Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor.

Materi Sampel DNA

Sampel DNA diisolasi dari beberapa jenis tikus yaitu tikus got, tikus putih, tikus rumah, mencit dan tikus hutan, sebagai pembanding digunakan sampel dari berbagai jenis hewan antara lain kambing, ayam, sapi, domba, babi, kuda dan marmut (tikus Belanda). Sampel DNA yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari darah, daging dan produk olahan. Sampel DNA yang diisolasi dari darah yaitu kambing, ayam, sapi, domba, kuda, tikus dan marmut. Sampel DNA yang berasal dari daging yaitu babi dan tikus. Sampel DNA yang berasal dari produk olahan yaitu bakso dan abon. Jumlah sampel yang berasal dari darah, daging dan produk olahan yaitu berturut-turut sebanyak 32, 4 dan 52 sampel. Pembuatan produk olahan daging (bakso dan abon) menggunakan daging tikus Ratus norvegicus strain albino sebagai bahan campuran pada produk bakso dan abon sapi yang terdiri atas beberapa level cemaran yaitu 1; 2.5; 5; 7.5; 10; 15; 20 dan 25%.

Primer

Primer yang digunakan dalam amplifikasi fragmen DNA spesifik kambing, ayam, sapi, domba, babi dan kuda mengacu pada Matsunaga et al. (1999) dengan primer forward yang sama untuk semua jenis hewan yaitu 5‟-GAC CTC CCA GCT CCA TCA AAC ATC TCA TCT TGA TGA AA-3‟. Primer reverse untuk mengamplifikasi fragmen spesifik tikus dirancang dengan software MEGA 4. Sampel marmut (tikus Belanda) diamplifikasi menggunakan primer yang sama dengan primer untuk tikus. Sekuen primer reverse pada setiap jenis hewan dapat dilihat pada Tabel 5.

Tabel 5 Sekuen primer spesifik gen cyt b dari tujuh jenis hewan

Jenis Hewan Reverse (5‟ – 3‟) Hasil Amplifikasi

Kambing CTC GAC AAA TGT GAG TTA CAG AGG GA* 157 bp

Ayam AAG ATA CAG ATG AAG AAG AAT GAG GCG* 227 bp

Sapi CTA GAA AAG TGT AAG ACC CGT AAT ATA AG* 274 bp

Domba CTA TGA ATG CTG TGG CTA TTG TCG CA* 331 bp

Babi GCT GAT AGT AGA TTT GTG ATG ACC GTA* 398 bp

Kuda CTC AGA TTC ACT CGA CGA GGG TAG TA* 439 bp

Tikus GAA TGG GAT TTT GTC TGC GTT GGA GTT T** 603 bp

Keterangan: * berdasarkan Matsunaga et al. (1999)

** perancangan primer menggunakan software MEGA 4

Bahan kimia yang digunakan adalah buffer TEN (10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA dan 10 mM NaCl), 10 % SDS, fenol, kloroform, etanol 70 %, etanol absolut, 5M NaCl, buffer TE (10 mM Tris-HCl dan 1 mM EDTA), akuades, akuabides, 10 x buffer PCR (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2 dan 0.1 % Triton X-100), dNTP‟s, agarose, ethidium bromida, buffer TAE (Tris-HCl, asam asetat, EDTA), loading dye dan DNA marker. Enzim yang digunakan adalah 10 mg/µl proteinase-K, RNA-se dan Taq DNA Polymerase.

Peralatan yang digunakan adalah tabung eppendorf (1.5 ; 0.5 dan 0.2 ml), tip pipet (100 ; 200 dan 1000 l), pipet mikro, mikro sentrifuse, mortar, vorteks, water bath-shaker, vacuum dryer, spektrofotometer (GeneQuant 1300), mesin PCR GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems™), satu set alat elektroforesis gel agarose (MUPID) dan kamera Polaroid (MP 4 Polaroid camera + UV transilluminator).

Prosedur Perancangan Primer Reverse Tikus

Perancangan primer spesifik untuk tikus berdasarkan runutan nukleotida gen cyt b pada tikus yang terdapat dalam GenBank (NCBI). Spesies tikus yang digunakan yaitu Rattus norvegicus sepanjang 1143 pb (nomor akses GenBank HM222710). Sekuen gen tersebut kemudian dihomologikan dengan cyt b Capra hircus (nomor akses GenBank EU130780), Gallus gallus (nomor akses GenBank AF195628), Bos taurus (nomor akses GenBank AF195628), Ovis aries (nomor akses GenBank EU365990), Sus scrofa (nomor akses GenBank AY634188) dan Equus caballus (nomor akses GenBank AY522328). Setelah diketahui situs penempelan primer forward dan reverse pada masing-masing jenis hewan tersebut

kemudian dilakukan perancangan primer reverse tikus dengan melihat runutan basa yang hanya terdapat pada tikus tetapi tidak terdapat pada jenis hewan lain, sehingga diharapkan primer reverse tersebut dapat menjadi primer spesifik tikus.

Software yang digunakan untuk perancangan primer spesifik tikus adalah MEGA 4. Tahapan penggunaan program yaitu (1) runutan nukleotida yang diperoleh dari GenBank dan primer dipastikan sudah dalam bentuk FASTA (2) runutan nukleotida setiap jenis hewan dan primer tersebut dibuka pada software MEGA 4, (3) dilakukan multiple alignment dengan terlebih dahulu mencari situs penempelan primer forward untuk semua jenis hewan dan (4) ditentukan daerah spesifik untuk tikus yang tidak terdapat pada keenam jenis hewan yang digunakan.

Uji Homologi Primer Spesifik

Uji homologi primer spesifik terhadap tujuh jenis hewan yang digunakan dalam penelitian ini dilakukan dengan genetic information processing software GENETYX-WIN versi 4.0. Tahapan penggunaan program ini yaitu (1) software dibuka, (2) diklik „New Sequence‟ pada „File‟, (3) diberi nama primer pada ID yang tersedia, (4) runutan primer diketik pada kotak, (4) diklik „Search Homology‟ pada „Nucleotide‟, (5) sekuen cyt b yang sudah dalam bentuk FASTA dimasukkan dengan cara diklik „add‟ lalu „ok‟ dan hasil pengujian akan langsung ditampilkan.

Pembuatan Produk Olahan Asal Daging (Kontrol Positif)

Pembuatan Bakso Dicemari Daging Tikus. Daging sapi segar yang sudah

dibersihkan lemaknya dipotong kecil-kecil, kemudian ditambahkan daging tikus dan dimasukkan ke dalam food processor. Persentase bahan yang ditambahkan yaitu untuk es batu, tepung tapioka, garam, bawang putih, STPP dan merica berturut-turut sebanyak 40%, 20%, 3%, 0.5%, 0.5% dan 0.5% dari daging. Es batu dan NaCl ditambahkan, kemudian digiling halus selama 1 menit. Lada, tepung tapioka dan bawang putih ditambahkan ke dalam campuran daging tersebut, kemudian digiling kembali selama 1 menit. Adonan dicetak berbentuk bulatan-bulatan bakso dan dimasukkan kedalam panci yang berisi air mendidih (80oC) selama 15 menit. Bulatan-bulatan bakso dimasak kembali pada air mendidih

(100oC) selama 10 menit. Bakso kemudian diangkat dan ditiriskan selama 15 menit. Bakso dikemas dalam plastik untuk selanjutnya diekstraksi.

Pembuatan Abon Sapi Dicemari Daging Tikus. Daging segar yang telah

dibersihkan dari lemak dicuci. Daging tikus ditambahkan kemudian dimasukkan ke dalam panci presto yang berisi air sampai permukaan daging terendam, direbus dalam air mendidih (100oC) sampai empuk selama 30 menit. Daging tersebut diangkat dan ditiriskan dalam nampan yang dialasi kertas buram untuk mempermudah penyerapan air. Persentase bahan tambahan yang digunakan untuk ketumbar halus, bawang merah, garam, gula putih dan lengkuas berturut-turut sebesar 3.75%, 3.17%, 3.06%, 9.16% dan 5.40% dari daging. Daging diremah dengan garpu, kemudian dicampurkan bumbu-bumbu yang terdiri atas garam, ketumbar, lengkuas, gula putih, bawang merah yang telah dihaluskan dan ditumbuk sampai bumbu tercampur merata. Remahan daging berbumbu tersebut digoreng sampai terjadi perubahan warna menjadi agak kecokelatan selama 45 menit dengan suhu penggorengan 172oC. Abon dikeluarkan minyaknya dengan alat penekan manual dan dikeringkan pada suhu 105oC selama 30 menit. Abon yang sudah matang disimpan dalam nampan yang dialasi kertas minyak sambil diangin-anginkan untuk selanjutnya dikemas dan siap untuk diekstraksi.

Isolasi dan Ekstraksi DNA

Isolasi dan ekstraksi DNA dilakukan pada sampel darah dan produk olahan daging mengikuti metode Sambrook et al. (1989) yang telah dimodifikasi dalam preparasi sampel dan degradasi protein.

Preparasi Sampel. Sampel yang berasal dari darah dalam alkohol absolut

diperlukan sebanyak 200 µl, dari daging dalam alkohol absolut sebanyak 75 mg dan dari produk olahan sebanyak 75 mg. Masing-masing dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 ml. Sampel yang disimpan dalam alkohol terlebih dahulu dibersihkan dengan air destilasi sebanyak 1000 µl, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama lima menit. Alkohol yang terbentuk di bagian atas tabung kemudian dibuang, langkah tersebut dilakukan sebanyak dua kali agar alkohol dalam sampel benar-benar hilang. Sampel produk olahan yang tidak disimpan dalam alkohol terlebih dahulu dipotong-potong atau digerus dengan mortar.

Degradasi Protein. Sampel darah dan daging yang telah dibersihkan dari alkohol

serta sampel produk olahan yang telah dipotong halus tersebut masing-masing ditambahkan 1x STE (sodium tris EDTA) sampai volume 340 µl (± 200 µl), 40 µl SDS (sodium dosesil sulfat) 10% dan 20 µl proteinase K 10 mg/ml. Tabung berisi campuran tersebut dihomogenkan dengan shaker dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama 2 jam untuk mengoptimalkan kerja enzim dalam memecah protein.

Degradasi Bahan Organik. Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan fenol

sebanyak 400 µl, CIAA (kloroform : isoamil alkohol dengan perbandingan 24:1) sebanyak 400 µl dan 40 µl NaCl 5M, dicampurkan perlahan-lahan dan merata dengan cara menggerakkan tabung membentuk angka delapan selama satu menit. Larutan diinkubasi kembali selama 15 menit dalam suhu ruang sambil terus dibolak-balik.

Presipitasi DNA. Bahan organik yang sudah didegradasi disentrifugasi pada

kecepatan 12000 rpm selama 5 menit dengan suhu 20 oC hingga fase DNA terpisah dengan fase fenol. Fase DNA dipindahkan dalam tabung baru. Sebanyak 800 µl alkohol absolut dan 40 µl 5M NaCl ditambahkan, kemudian diinkubasi pada suhu -20 ºC selama semalam. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit, bagian alkohol dibuang sebanyak mungkin. Bagian endapan (DNA) yang tersisa ditambahkan 800 µl alkohol 70% dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit dengan suhu 20 oC, bagian alkohol yang terbentuk dibuang kembali sebanyak mungkin. Bagian DNA yang tersisa dibiarkan dalam keadaan terbuka pada suhu ruang sampai kering untuk menghilangkan alkohol, lalu ditambahkan sebanyak 100 µl larutan TE (Tris EDTA). Sampel DNA disimpan pada suhu -20 ºC dan siap untuk digunakan.

Pengujian DNA Total

Pengujian DNA hasil ekstraksi secara kualitatif dilakukan dengan elektroforesis pada gel 1%. Gel dibuat dari 0.3 gram agarose dan 30 ml larutan buffer (0.5 x TBE) yang dipanaskan. Larutan agarose dibiarkan agak dingin sambil diaduk dengan magnet stirrer, lalu ditambahkan 1.25 μl pewarna ethidium bromide. Sebanyak 5 μl sampel DNA dilarutkan dalam 1 μl loading dye. Elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada tegangan konstan 100 volt sampai pewarna bromtimol blue mencapai bagian bawah gel.

Pengujian DNA hasil ekstraksi secara kuantitatif dilakukan dengan spektrofotometer GeneQuant 1300. Sampel DNA sebanyak 3µl dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 ml ditambah air destilata sebanyak 597 µl. Larutan TE (Tris EDTA) digunakan sebagai blangko dengan cara yang sama yaitu sebanyak 3 µl larutan TE ditambah air destilata, lalu dimasukkan dalam tabung eppendorf 1.5 ml. Sampel dan blangko di spin down selama 0.5 menit, kemudian dilakukan pengujian dengan spektrofotometer.

Amplifikasi Fragmen DNA Spesifik

Amplifikasi ruas gen cyt b dilakukan dengan metode multipleks PCR. Sampel DNA sebanyak 2 µl dimasukkan ke dalam tabung PCR 0.2 ml, ditambahkan komponen-komponen PCR yang terdiri atas primer forward 35 pmol, primer reverse masing-masing 5 pmol, campuran dNTP 200 µl, MgCl2 1 mM, dan 0.5 unit enzim Taq polymerase dan bufernya. Proses amplifikasi dilakukan pada mesin thermocycler GeneAmp® PCR System (Applied Biosystems TM) dengan suhu pradenaturasi 94oC selama 5 menit, 30 siklus yang terdiri atas denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing 60oC selama 45 detik, elongasi 72oC selama 1 menit dan elongasi akhir 72oC selama 5 menit. Setelah proses tersebut selesai, tabung diambil dan disimpan pada suhu ruang atau pada suhu 4oC sampai akan dianalisis lebih lanjut.

Elektroforesis dan Visualisasi Produk PCR

Produk PCR divisualisasikan dengan teknik elektroforesis gel agarose 2%. Gel dibuat dari 0.6 gram agarose dan 30 ml larutan buffer (0.5 x TBE) yang dipanaskan. Larutan agarose dibiarkan agak dingin sambil diaduk dengan stirrer, lalu ditambahkan 2.5 μl pewarna ethidium bromide. Sebanyak 5 μl produk PCR dilarutkan dalam 1 μl loading dye. Elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada tegangan konstan 100 volt atau sampai pewarna bromtimol blue mencapai bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk dilakukan pemotretan menggunakan UV.

Analisis Data

Rataan pengulangan pengujian primer pada masing-masing sampel DNA dilakukan sebanyak empat kali dan pengulangan PCR sebanyak tiga kali. Data

yang diperoleh dianalisis secara deskriptif dan dihitung persentase keberhasilan sampel DNA yang teramplifikasi dengan rumus: