BAB 3
KERANGKA TEORI, KERANGKA KONSEP, DAN HIPOTESIS
3.1. Kerangka Teori
EGF PDGF IGF VEGF
Receptor Tyrosine Kinase
Ras PI3K RAF AKT PLCG PKC Cell IR51 SRC LPA PI(3)P MEK ERK
Cell Cell cycle progression MDM2 TP53 EP30 ATM BRC A DNA Repai CDKN1A INK4 E2F1 G1/S Progression Apoptosis Proliferatio eNOS Cell Migration Permeabilit
Ki-Angiogenes
NF-Gambar 3 Kerangka teori penelitian.
3.2 Kerangka Konsep
3.3 Hipotesis 1. Hipotesis Mayor
Terdapat hubungan antara ekspresi VEGF dengan ekspresi Ki-67 labeling index pada penderita astrositoma
2. Hipotesis Minor
a. Terdapat hubungan derajat WHO histopatologi dengan jenis kelamin b. Terdapat hubungan derajat WHO histopatologi dengan mortalitas
c. Terdapat hubungan ekspresi Ki-67 labeling index terhadap derajat WHO histopatologi astrositoma
d. Terdapat hubungan ekspresi Ki-67 labeling index terhadap mortalitas Variabel Bebas:
VEGF Ki-67
Variabel Terikat:
1. Derajat Klasifikasi WHO Astrositoma
2. Mortalitas 3. Jenis Kelamin
e. Terdapat hubungan ekspresi VEGF dengan derajat WHO histopatologi astrositoma
f. Terdapat hubungan ekspresi VEGF dengan mortalitas
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1. Desain
Penelitian ini merupakan penelitian cross sectional yang menggunakan metode penelitian analitik untuk menganalisis hubungan antara ekspresi VEGF dengan Ki-67 pada penderita astrositoma intrakranial di RSUP HAM pada Januari 2014 - Juni 2015. Jumlah subjek pada penelitian ini adalah sebanyak 25 subjek.
4.2. Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Departemen Ilmu Bedah Saraf RSUP.H. Adam Malik/FK USU Medan dan Departemen Patologi Anatomi FK USU Medan, Sumatera Utara, dilaksanakan mulai November 2016 – Desember 2016.
4.3. Populasi dan Subjek
B. Populasi terjangkau adalah penderita astrositoma yang menjalani operasi pengangkatan tumor di RSUP.H. Adam Malik Medan.
C. Subjek penelitian adalah seluruh penderita astrositoma yang menjalani operasi pengangkatan tumor di RSUP H. Adam Malik Medan antara bulan Januari 2014 sampai Juni 2015. Subjek penelitian ditentukan dengan metode total sampling dengan penetapan kriteria inklusi dan eksklusi.
4.4. Kriteria Inklusi dan Eksklusi 4.4.1. Kriteria Inklusi
a. Penderita tumor otak yang telah ditegakkan diagnosis astrositoma berdasarkan pemeriksaan histopatologi jaringan di Departemen Patologi Anatomi RSUP H. Adam Malik Medan
4.4.2. Kriteria Eksklusi
a. Menderita tumor pada organ tubuh lain yang dibuktikan dengan data sekunder pemeriksaan fisik dan radiologi bila dibutuhkan.
b. Lesi multipel pada otak berdasarkan pemeriksaan head CT scan
c. Kejadian berulang (rekurensi) atau kekambuhan (residif), yaitu pasien telah dilakukan tindakan pembedahan sebelumnya untuk pengangkatan tumor astrositoma pada otak, namun terjadi rekurensi atau residif.
4.5 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional Variabel 4.5.1 Variabel Penelitian
1. Variabel independen adalah jumlah sel astrositoma yang mengekspresikan VEGF dan Ki-67
2. Variabel dependen adalah derajat astrositoma menurut WHO dan luaran pasien
4.6.2 Definisi Operasional Variabel
Variabel Definisi Cara Ukur Alat Ukur Skala Ukur
Ekspresi VEGF
Jumlah sel astrositoma yang mengekspresikan VEGF pada pemeriksaan imunohistokimia Menilai jumlah sel astrositoma yang mengekspresikan VEGF pada pemeriksaan imunohistokimia. Mikroskop cahaya Ordinal Hasil: +1 +2 +3 +4 Ekspresi Ki-67
Jumlah sela strositoma yang mengekspresikan
Ki-67pada pemeriksaan imunohistokimia Menilai jumlah sel astrositoma yang mengekspresikan Ki-67 pada pemeriksaan imunohistokimia. Mikroskop cahaya Ordinal Hasil: Negatif < 10% >10% Derajat WHO Pengelompokan astrositoma berdasarkan potensi proliferasi, bentuk nucleus, nekrosis, dan aktivitas mitosis menggunakan system klasifikasi WHO (Reifenberger, Blümcke,
Pietsch, & Paulus, 2010)
Menilai sifat sel tumor pada spesimen yang mendapat pewarnaan hematoksilin-eosin Mikroskop cahaya Ordinal Hasil: Derajat I Derajat II Derajat III Derajat IV
saat pulang akhir penderita saat pulang (hidup/ meninggal) Hasil: - Hidup - Meninggal
4.6. Cara Kerja dan Teknik Pengumpulan Data 4.6.1. Cara Kerja
1. Diawali dengan identifikasi seluruh subjek penelitian yang sesuai dengan kriteria inklusi dan eksklusi. Data subjek penelitian diambil dari bank data Departemen Ilmu Bedah Saraf FK USU/RSUP H.Adam Malik Medan. Data yang diambil meliputi nama, umur, nomor rekam medis, dan gambaran imaging (MRI atau CT Scan).
2. Data outcome pasien saat pulang didapatkan dari rekam medis penderita. 3. Berdasarkan nomor rekam medis, dilakukan konfirmasi pada Departemen
Patologi Anatomi untuk mendapatkan nomor pemeriksaan Patologi Anatomi yang akan digunakan untuk mendapatkan blok paraffin.
4. Pewarnaan VEGF dilakukan di Departemen Patologi Anatomi FK USU oleh tenaga laboran yang sudah terlatih. Proses pewarnaan memakan waktu selama ± 270 menit dengan rincian sebagai berikut:
a. Blok paraffin dari specimen astrositoma dipotong dengan microtome dengan ketebalan 3 micron
b. Slide hasil potongan microtome dipanaskan pada hotplate dengan suhu 60 0
c. Dehidrasi dengan alcohol absolut 80% / 70% selama 2 menit C selama 60 menit
e. Bilas lagi dengan aquadesselama 5 menit
f. Masukkan slide kedalam TRS yang sudah dihangatkan
g. Masukkan ke dalam microwave samsung TDS dengan kondisi sebagai berikut: jika 800 watt panaskan selama 2,5-3 menit dan jika 100 watt panaskan selama 10 menit
h. Setelah itu dinginkan slide selama 20 menit
i. Slide dibilas lagi dengan wash buffer (WB)/PBS-T selama 5 menit j. Kemudian bloking dengan DAKO FLEX Peroxidase selama 5
menit
k. Bilas dengan wash buffer (WB)/PBS-T selama 5 menit l. Antibodi primer selama 20-60 menit
m. Bilas dengan wash buffer (WB)/PBS-T selama 5 menit n. DAKO FLEX HRP selama 20 menit
o. Bilas dengan wash buffer (WB)/PBS-T selama 5 menit p. DAKO FLEX DAB + SUBSTRAT selama 5 menit q. Bilas dengan air mengalir (keran) selama 5 menit r. Hematoxylin selama 2 menit
s. Bilas dengan air mengalir (keran) selama 5 menit
t. Dehidrasi dengan alkohol 70%, 80% dan absolute selama 2 menit u. Xylene 2 kali selama 2 menit
v. Mounting medium dan coverslip
5. Analisis ekspresi VEGF dilakukan secara semikuantitatif oleh seorang spesialis patologi anatomi tanpa mengetahui data klinis dan diagnosis
sebelumnya. Setiap specimen dikategorikan berdasarkan sistem berikut (Oehring et al., 1999):
a. 0: tidak ada sel yang imunopositif b. 1: sel imunopositif berjumlah<10% c. 2: sel imunopositif berjumlah 10-50% d. 3: sel imunopositif berjumlah 50-90% e. 4: sel imunopositif berjumlah>90%.
6. Pewarnaan Ki-67 Li dilakukan di Departemen Patologi Anatomi FK USU oleh tenaga laboran yang sudah terlatih. Proses pewarnaan memakan waktu selama ± 270 menit dengan rincian sebagai berikut:
a. Blok parafin dari spesimen meningioma dipotong dengan microtome dengan ketebalan 0,3 micron
b. Slide hasil potongan microtome dipanaskan pada hotplate dengan suhu 60 0
c. Dehidrasi dengan alkohol absolut 80% / 70% selama 2 menit C selama 60 menit
d. Kemudian slide dibilas dengan air mengalir (keran) selama 2 menit e. Bilas lagi dengan aquades selama 5 menit
f. Masukkan slide kedalam TRS yang sudah dihangatkan
g. Masukkan kedalam microwave samsung TDS dengan kondisi sebagai berikut: jika 800 watt panaskan selama 2,5-3 menit dan jika 100 watt panaskan selama 10 menit
h. Setelah itu dinginkan slide selama 20 menit
j. Kemudian bloking dengan DAKO FLEX Peroxidase selama 5 menit
k. Bilas dengan wash buffer (WB)/PBS-T selama 5 menit l. Antibodi primer selama 20-60 menit
m. Bilas dengan wash buffer (WB)/PBS-T selama 5 menit n. DAKO FLEX HRP selama 20 menit
o. Bilas dengan wash buffer (WB)/PBS-T selama 5 menit p. DAKO FLEX DAB + SUBSTRAT selama 5 menit q. Bilas dengan air mengalir (keran) selama 5 menit r. Hematoxylin selama 2 menit
s. Bilas dengan air mengalir (keran) selama 5 menit
t. Dehidrasi dengan alkohol 70%, 80% dan absolut selama 2 menit u. Xylene 2 kali selama 2 menit
v. Mounting medium dan coverslip w. Pengamatan dibawah mikroskop
Pemeriksaan IHC Ki-67 menggunakan reagen Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen yang diproduksi Dako North America Inc.
7. Analisis ekspresi Ki-67 dilakukan secara semikuantitatif oleh seorang spesialis patologi anatomi tanpa mengetahui data klinis dan diagnosis sebelumnya. Setiap specimen dikategorikan berdasarkan sistem berikut (Johannessen, 2006):
a. Pewarnaan Ki-67 negatif adalah apabila pada gambaran mikroskopis jaringan tumor tidak menyerap warna sama sekali
b. Pewarnaan Ki-67 lemah adalah apabila pada gambaran mikroskopis terdapat <10% nukleus yang menyerap warna dari 1000 sel tumor c. Pewarnaan Ki-67 kuat adalah apabila pada gambaran mikroskopis
terdapat >10% nukleus yang menyerap warna dari 1000 sel tumor.
4.6.2. Teknik Pengumpulan Data
Seluruh specimen blok paraffin astrositoma yang sebelumnya telah dilakukan pewarnaan dasar hematoxylin-eosin dan dikonfirmasi sebagai suatu astrositoma sejak Januari 2014 hingga Juni 2015 dikumpulkan dan dilakukan pencatatan data-data pasien yang diperoleh dari rekam medik pasien dan assesmen departemen bedah saraf. Data yang dicatat meliputi jenis kelamin, usia, grading WHO, dan jenis histopatologi.
Dilakukan pewarnaan imunohistokimia VEGF pada seluruh blok parafin yang terkumpul. Setelah dilakukan pewarnaan VEGF, dihitung persentase inti sel tumor yang menyerap warna.
Data ekspresi Ki-67 pada subjek penelitian ini diperoleh dari pemeriksaan sebelumnya yang telah dilakukan dan dilakukan penghitungan ulang presentase ekspresi sel.
Data mengenai mortalitas pasien didapatkan melalui pencatatan rekam medis.
4.7. Alur Penelitian
4.8. Rencana Pengolahan dan Analisa Data
Data yang didapatakan diolah dengan menggunakan menggunakan perangkat lunak pengolah data. Normalitas data akan dinilai menggunakan uji Kolmogorov. Variabel kategorik dianalisis dalam bentuk frekuensi dan persentase yang disajikan dalam bentuk tabel. Variabel numerik disajikan dalam bentuk rerata dan standar deviasi jika distribusi normal. Jika distribusi tidak normal, digunakan pengelompokan data kedalam kelompok.
Seleksi berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi
Pengumpulan data penderita astrositoma di RSUP H. Adam Malik
Pengumpulan blok paraffin dan preparat slide pemeriksaan IHC Ki-67 di Lab. Patologi Anatomi RSUP HAM
Pewarnaan IHC (VEGF) di Dep. Patologi Anatomi FK USU Penghitungan ekspresi Ki-67
BAB 5
HASIL PENELITIAN
Subjek penelitian diambil dari bulan Januari 2014 hingga Juni 2015. Penelitian ini memperoleh 25 spesimen dari pasien-pasien astrositoma intrakranial yang telah menjalani operasi pengangkatan tumor di RSUP. H. Adam Malik Medan. Diagnosis astrositoma berdasarkan konfirmasi hasil pemeriksaan histopatologi jaringan yang sesuai dengan gambaran astrositoma. Spesimen astrositoma yang telah berbentuk blok parafin tersebut dilakukan pewarnaan imunohistokimia VEGF. Hasil pemeriksaan Ki-67 labeling index diperoleh dengan penghitungan ekspresi sel pada preparat slide pemeriksaan IHC yang telah dilakukan sebelumnya.
5.1 Karakteristik Subjek Penelitian
Pada penelitian ini, didapati bahwa rerata usia subjek penelitian adalah 35,96 ± 14,67 tahun. Sebagian besar subjek penelitian berjenis kelamin laki-laki (15 orang/60%), sedangkan subjek perempuan sebanyak 10 orang (40%). Berdasarkan klasifikasi klasifikasi astrositoma berdasarkan grade WHO, terlihat bahwa frekuensi terbanyak adalah tipe astrositoma grade I yaitu sebanyak 9 orang (36%), kemudian diikuti oleh astrositoma grade II dan grade IV masing-masing sebanyak 6 orang (24) dan astrositoma grade III sebanyak 4 orang (tabel 5.1).
Tabel 5.1 Karakteristik Subjek Penelitian Karakteristik Usia (tahun) 35,96 ± 14,67 Jenis kelamin (n/%) Laki-laki 15 (60) Wanita 10 (40) Derajat WHO (n/%) I 9 (36) II 6 (24) III 4 (16) IV 6 (24) Total 25 (100)
5.2 Analisis Astrositoma Berdasarkan Derajat WHO 5.2.1 Analisis Derajat WHO dan Jenis Kelamin
Pada penelitian ini, terlihat bahwa sebagian besar subjek penelitian menderita astrositoma derajat I (33,3% pada laki-laki dan 40% pada perempuan). 26,7% subjek penelitian dengan jenis kelamin pria menderita astrositoma derajat II, sementara 40% sisanya menderita astrositoma derajat III (20%) dan derajat IV (20%). Sementara itu, 20% subjek dengan jenis kelamin wanita menderita astrositoma derajat II, 10% menderita astrositoma derajat I, dan 30% sisanya menderita astrositoma derajat IV (tabel 5.2). Setelah dilakukan uji statistik, tidak
terdapat perbedaan derajat WHO yang bermakna antara kelompok laki-laki dengan perempuan (p=1,000;tabel 5.2).
Tabel 5.2 Derajat WHO dan jenis kelamin
Derajat WHO Laki-laki n(%) Perempuan n(%) P
I 5 (33,3) 4 (40) 1,000a II 4 (26,7) 2 (20) III 3 (20) 1 (10) IV 3 (20) 3 (30) Total 15 (100) 10 (100) a
Uji Chi Square
5.2.2 Analisis derajat WHO dan mortalitas
Pada penelitian ini, terlihat bahwa tidak ada satu pun penderita astrositoma derajat I dan II yang meninggal (tabel 5.3). Sementara itu, 28.6% penderita astrositoma derajat III meninggal. Pada kelompok derajat IV, 71.3% penderita meninggal. Terdapat perbedaan signifikan derajat WHO antara kelompok yang hidup dengan kelompok yang meninggal (p=0,001, tabel 5.3).
Derajat WHO Hidup n(%) Meninggal n(%) P I 9 (50) 0 (0) 0.001a II 6 (33,3) 0 (0) III 2 (11,1) 2 (28,6) IV 1 (5,5) 5 (71,3) Total 18 (100) 7 (100) a
Uji Chi Square
5.3 Ekspresi Ki-67 labeling index
Dari 25 subjek penelitian, terdapat 2 subjek dengan ekspresi Ki-67 Li negatif, 9 subjek dengan ekspresi Ki-67 Li lemah, dan 14 subjek dengan ekspresi Ki-67 Li yang kuat.
A B
Gambar 4 Hasil Pewarnaan Ki-67: (A) Kuat (> 10 sel/10 LPB) (B) Lemah (< 10 sel/10 LPB)
Sebagian besar pria (53,3%) menunjukkan ekspresi Ki-67 Li yang kuat. Sementara itu, sekitar 40% wanita menunjukkan ekspresi Ki-67 Li yang lemah. Tidak ada satupun wanita yang menujukkan ekspresi Ki-67 Li yang negatif. Tidak terdapat perbedaan ekspresi Ki-67 Li yang bermakna antara laki-laki dengan perempuan (p=0,483, tabel 5.4)
Tabel 5.4 Ekspresi Ki-67 Li berdasarkan jenis kelamin
Ki-67 LI Laki-laki n (% Perempuan n (%) p
Negatif 2(13.3) 0 (0)
Lemah 5(33,3) 4 (40) 0.483a
Kuat 8 (53,3) 10 (10)
Total 15 (100%) 10 (100%)
a
Uji Chi Square
5.3.1 Ekspresi Ki-67 labeling index dan Klasifikasi Astrositoma
Jumlah mitosis yang diukur berdasarkan klasifikasi astrositoma didapati bahwa mayoritas astrositoma grade I memiliki mitosis yang lemah yaitu sebesar 6 subjek (66.67%) dan mitosis kuat sebesar 2 subjek (22.2%). Mayoritas strositoma grade II memiliki mitosis yang kuat yaitu sebesar 5 subjek (83.33%) dan mitosis lemah sebesar 1 subjek (16.67%). Mayoritas astrositoma grade III memiliki mitosis yang kuat yaitu sebesar 3 subjek (75%) dan mitosis lemah sebesar 0. Subjek. Mayoritas strositoma grade IV memiliki mitosis yang kuat yaitu sebesar 4 subjek (66.67%) dan mitosis lemah sebesar 2 subjek (33.33%, tabel 5.5).
Uji statistik menunjukkan korelasi positif yang tidak signifikan antara ekspresi Ki-67 dengan derajat astrositoma berdasarkan WHO (r=0,362; p=0,076).
Tabel 5.5 Distribusi ekspresi Ki-67 Li terhadap klasifikasi Astrositoma Ki-67
LI Grade I
Grade II Grade III Grade IV r (p)
Negatif 1 (11,11%) 0 (0,0%) 1 (25,0%) 0 (0,0%) Lemah 6 (66,67%) 1 (16,67%) 0 (0,0%) 2 (33,33%) 0,362 (0,076)a Kuat 2 (22,22%) 5 (83,33%) 3 (75,0%) 4 (66,67%) Total 9 (100%) 6 (100%) 4 (100%) 6 (100%) a Uji Spearman
5.3.2 Analisis Ekspresi Ki-67 labeling index terhadap Mortalitas
Berdasarkan data dari penelitian ini didapati bahwa pasien-pasien dengan ekspresi Ki-67 labeling index yang lemah terdapat 7 pasien (77.7%) yang hidup dan 2 pasien (22.22%) yang meninggal, sedangkan pada pasien-pasien dengan hasil pewarnaan Ki-67 kuat terdapat 9 pasien (64.2%) yang hidup dan 5 pasien (35.7%) yang meninggal. Dua pasien dengan hasil pewarnaan Ki-67 negatif, keduanya hidup (tabel 5.6).
Setelah dilakukan analisa statistik, terlihat tidak ada korelasi yang signifikan antara ekspresi Ki-67 Li dengan mortalitas (p=0,512; Tabel 5.6).
Tabel 5.6 Distribusi ekspresi Ki-67 labeling index terhadap mortalitas
Ki-67 LI Hidup Meninggal Total p
Negatif 2 (100%) 0 (0%) 2 (8%)
Lemah 7 (77,7%) 2 (22,2%) 9 (36%) 0.512a Kuat 9 (64,2%) 5 (35,7%) 14 (56%)
Total 18 (72%) 7 (28%) 25 (100%) a
Uji chi square
5.4 Ekspresi VEGF
Dari 25 subjek penelitian, terdapat 1 subjek dengan ekspresi VEGF + 2, 5 subjek dengan ekspresi VEGF +3 dan 19 subjek dengan ekspresi VEGF +4.
A B
Gambar 5. Ekspresi VEGF pada astrositoma. (A) Ekspresi VEGF +2, (B) ekspresi VEGF + 3, (C) dan (D) ekspresi VEGF +4
5.4.1 Analisis Ekspresi VEGF berdasarkan Jenis Kelamin
Sebagian besar pria (53,3%) menunjukkan ekspresi VEGF yang sangat kuat (+4). Sementara itu, sekitar 80% wanita menunjukkan ekspresi VEGF yang sangat kuat (+4). 20% subjek penelitian, baik pada kelompok pria maupun wanita, menunjukkan ekspresi VEGF +3. Tidak terdapat perbedaan ekspresi VEGF yang bermakna antara laki-laki dengan perempuan (p=0,704, tabel 5.7)
Tabel 5.7 Ekspresi VEGF berdasarkan jenis kelamin
VEGF Laki-laki n(%) Perempuan n(%) p
+2 1(13.3) 0 (0)
+3 3(20) 2 (20) 0.704a
+4 11 (53,3) 8 (80)
Total 15 (66,7) 10 (100)
a
Uji chi square
5.4.1 Analisis Ekspresi VEGF dengan Klasifikasi Astrositoma
Pada penelitian ini terlihat bahwa dari 25 subjek yang dilakukan pewarnaan VEGF, mayoritas memiliki ekspresi +4 yaitu 19 subjek (76%), 4 subjek (16%) memiliki ekspresi +3, 1 subjek (4%) memiliki ekspresi +2, dan tidak ada subjek yang memiliki ekspresi negatif dan +1 (tabel 5.8).
Tabel 5.8 Distribusi ekspresi VEGF terhadap klasifikasi astrositoma VEG F Derajat WHO n (%) Total r (p) I II III IV + 2 0 (0) 0 (0) 1 (25) 0 (0) 1 (4) + 3 1 (11.11) 1 (16.67) 0 (0) 3 (50) 4 (16) -0,331 + 4 8 (88.89) 5 (83.33) 3 (75) 3 (50) 19 (76) (0,106) Total a 9 (36) 6 (24) 4 (16) 6 (24) 25 (100) a
Setelah dilakukan analisis statistik, diketahui bahwa nilai signifikansi ekspresi VEGF terhadap klasifikasi astrositoma adalah p = 0.106 (p > 0.05) dan dapat ditarik kesimpulan bahwa tidak dijumpai korelasi yang signifikan antara kedua variabel tersebut (tabel 5.8).
Uji Spearman
5.4.2 Analisis Ekspresi VEGF dengan Mortalitas
Pada penelitian ini didapatkan bahwa mayoritas pasien yang meninggal sebanyak 5 orang (71.43%) memiliki ekspresi VEGF +4, dan 2 orang (28.57%) memiliki ekspresi VEGF +3. Sedangkan pasien yang hidup mayoritas memiliki ekspresi +4 yaitu 14 orang (73.68%), +3 sebanyak 3 orang (15.79%) dan +2 sebanyak 1 orang (5.56%, tabel 5.9).
Tabel 5.9 Distribusi ekspresi VEGF terhadap mortalitas VEGF Hidup n(%) Meninggal n(%) Total p + 2 1 (5.56) 0 (0) 1 (4) + 3 3 (15.79) 2 (28.57) 5 (20) + 4 14 (73.68) 5 (71.43) 19 (76) (0,680) Total a 18 (72) 7 (28) 25 (100) a
Setelah dilakukan analisis statistik, didapatkan nilai signifikansi p = 0.680, sehingga dapat ditarik kesimpulan bahwa tidak ditemukan korelasi yang signifikan antara ekspresi VEGF terhadap mortalitas pasien dengan astrositoma intrakranial (tabel 5.9).
Uji chi square
5.4.3 Hubungan Ekspresi VEGF terhadap Ki-67 labeling index
Setelah dilakukan analisis statistik, ditemukan bahwa nilai signifikansi antara kedua variabel tersebut adalah p = 0.508, sehingga dapat ditarik kesimpulan bahwa tidak ditemukan korelasi yang signifikan antara ekspresi VEGF terhadap Ki-67 labeling index (tabel 5.10).
Tabel 5.10. Hubungan ekspresi VEGF dengan Ki-67
VEGF
Ki-67
r (p) Negatif Lemah Kuat
+2 1 0 0 0,139 (0,508)
+4 1 7 11
a
Uji Spearman
BAB 6 PEMBAHASAN
Astrositoma merupakan jenis tumor glioma terbanyak yaitu sebesar > 75% dari seluruh glioma. Glioma sendiri merupakan tumor neuroektodermal yang berasal dari sel neuroglia sustentakular (Thotakurta et al, 2014).
Dalam abad terakhir, klasifikasi tumor otak telah didasarkan pada konsep histogenesis bahwa tumor dapat diklasifikasikan berdasarkan kesamaan mikroskopik dengan sel-sel asli yang berbeda dan tingkatan diferensiasi yang diperikirakan. Karakteristik dari kesamaan histologi ini terutama bergantung pada gambaran pada mikroskopik cahaya pada potongan yang diwarnai dengan hematoxylin dan eosin, ekspresi protein-protein tertentu pada imunohistokimia dan karakteristik utrastruktural (Louis, 2016).
Pada 2007, WHO membuat klasifikasi yang mengelompokkan semua tumor dengan fenotip astrositik terpisah dengan fenotip oligodendroglial, tidak masalah apakah beberapa tumor astrositik secara klinis sama atau berbeda.
Studi-studi dalam dua dekade terakhir telah mengklarifikasi dasar genetik dari tumorigenesis pada beberapa tumor otak yang biasa dan yang lebih jarang, meningkatkan kemungkinan bahwa pengetahuan tersebut mungkin terlibat dalam klasifikasi tumor (Louis, 2016).
Astrositoma diklasifikasikan menjadi empat grade dimana grade I dan grade II digolongkan menjadi low grade astrositoma, sedangkan grade III dan grade IV digolongkan menjadi high grade glioma (Tonn et al,2006; Winn ,2011).
Indeks proliferasi merupakan marker poten yang dapat mengestimasi pertumbuhan dari neoplasma secara kuantitatif dan sangat berguna untuk menentukan prognosis pada pasien-pasien dengan neoplasma. Ki-67 secara kuantitatif terkait dengan mitotik indeks melalui perbedaan dari perbedaan waktu siklus sel dan dapat menunjukan perbedaan grading malignansi pada tumor-tumor astrositik. Oleh karena itu Ki-67 diharapkan dapat menjadi parameter proliferasi yang penting untuk menentukan faktor-faktor prognosis lainnya (Schröder, Feisel, & Ernestus, 2002).
Vascular endothelial growth factor (VEGF) merupakan suatu vascular permeability factor (VPF), suatu protein yang disekresikan oleh tumor yang dimurnikan dari cairan asites yang disekresi oleh karsinoma hepar pada babi yang menyebabkan kebocoran vaskular. Beberapa karakter VEGF menjelaskan bahwa molekul ini terutama bertanggung jawab dalam proses angiogenesis di bawah kondisi fisiologis dan patologis. VEGF bertindak secara spesifik pada sel-sel endotelial; merupakan suatu mitogen dan suatu faktor kemotaktik untuk sel-sel endotelial dan menginduksi produksi protease seperti urokinase-type plasminogen activator dan interstisial collagenase oleh sel-sel endotelial. VEGF meningkatkan
permeabilitas pembuluh darah normal terhadap protein plasma tanpa menyebabkan cedera sel endotel, degranulasi sel mast, atau respon inflamasi yang signifikan (Machein & Plate, 2000).
Neovaskularisasi yang nyata merupakan karakter dari banyak neoplasma pada sistem saraf. Kebanyakan morbiditas dan mortalitas dari neoplasma sistem saraf ganas atau jinak berhubungan dengan derajat vaskular tumor dan luas edema vasogenik peritumoral (Machein & Plate, 2000). Bentuk ekspresi dari VEGF dan reseptornya pada tumor otak mengundikasikan bahwa VEGF mungkin memiliki peran besar dalam angiogenesis tumor dan pembentukan edema peritumoral yang berhubungan dengan tumor otak (Licht & Kesbet, 2013).
Pada penelitian ini ditemukan bahwa astrositoma grade I berdasarkan klasifikasi WHO merupakan jenis astrositoma yang terbanyak yaitu sebesar 36%, diikuti dengan grade II dan grade IV masing-masing sebesar 24%, dan grade III sebesar 14%. Hasil ini tidak menyerupai studi sebelumnya dimana insidensi terbanyak ditemukan pada astrositoma grade II sebesar 39,9% diikuti astrositoma gr IV sebesar 36,2%, astrositoma grade III sebesar 14,3% dan astrositoma grade I sebesar 9,5% (Thotakura, 2014). Studi lain mendapatkan insidensi terbanyak adalah astrositoma grade IV (52%), diikuti astrositoma grade II (21%), astrositoma grade III (17.1%) dan grade I (9.6%) (Anvari, 2015). Studi oleh Hu juga memperoleh hasil yang berbeda, di mana insidensi terbanyak adalah astrositoma derajat II (56 kasus), diikuti derajat III (52 kasus), derajat IV (35 kasus), dan derajat I (9 kasus) dari total 152 kasus astrositoma (Hu, 2013). Berdasarkan beberapa studi tersebut, insidensi astrositoma berdasarkan derajat histopatologi masih bervariasi. Hal ini juga dikarenakan belum adanya studi
epidemiologi tentang kejadian astrositoma di Indonesia secara umum, dan di kota Medan secara khusus.
Dari 25 subjek tersebut, 10 subjek perempuan dan 15 subjek laki-laki. Jika dilakukan perbandingan pada kedua jenis kelamin ini didapatkan perbandingan sebesar laki-laki : perempuan sama dengan 1,5:1, namun secara statistik tidak ditemukan perbedaan yang bermakna pada kedua kelompok tersebut (p = 1.000). Pada tahun 2014 Thotakura melalui studinya memaparkan hal yang sama bahwa insidensi astrositoma lebih banyak dijumpai pada laki-laki dibandingkan pada perempuan dengan perbandingan laki-laki:perempuan = 1,84:1 (Thotakura, 2014). Hal ini mendukung literatur-literatur yang sebelumnya menyebutkan bahwa astrositoma lebih banyak ditemukan pada laki-laki dibandingkan pada perempuan (Winn, 2011).
Pada penelitian ini didapatkan bahwa klasifikasi WHO memiliki peranan pada mortalitas dengan hasil signifikansi p=0,001 (p < 0,05). Hal ini menunjukkan terdapat ada hubungan yang signifikan antara klasifikasi WHO dengan prognosis dari pasien. Sama dengan studi yang dilakukan oleh Anvari et al, menyimpulkan bahwa derajat WHO klasifikasi astrositoma berhubungan dengan mortalitas (Anvari, 2016).
Pada penelitian ini tidak ditemukan hubungan bermakna antara ekspresi Ki-67 Li terhadap jenis kelamin (p = 0.483). Hal ini sama dengan studi yang dilakukan oleh Darweesh et al yang menyimpulkan bahwa tidak ditemukan hubungan yang bermakna antara ekspresi Ki-67 terhadap jenis kelamin (p = 0.481) (Darweesh, M.F, 2016).
Pada penelitian ini juga didapatkan bahwa ekspresi Ki-67 tidak memiliki peranan pada klasifikasi astrositoma dengan hasil signifikansi p=0,076 (p>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada hubungan yang signifikan antara persentase Ki-67 dengan klasifikasi astrositoma intrakranial. Hal ini tidak sesuai dengan publikasi-publikasi yang telah dilakukan sebelumnya yang menyimpulkan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara Ki-67 dengan derajat klasifikasi astrositoma. Publikasi oleh Johannessen et al (2006) memaparkan bahwa nilai ki-67 semakin meningkat dengan meningkatnya derajat klasifikasi WHO. Hal ini disebabkan oleh karena Ki-67 dapat menilai aktifitas proliferasi dari sel-sel tumor sehingga semakin tinggi nilai Ki-67 maka semakin meningkat derajat keganasan dari tumor tersebut (Johannessen, 2006). Dari studi yang dilakukan oleh Thotakura pada tahun 2014 juga didapatkan hasil yang serupa (Thotakura, 2014).
Pada penelitian ini juga tidak ditemukan hubungan yang signifikan antara ekspresi Ki-67 terhadap mortalitas (p = 0.512). Hal ini tidak sesuai dengan publikasi-publikasi yang telah dilakukan sebelumnya yang menyimpulkan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara Ki-67 dengan prognosis pasien-pasien penderita astrositoma. Pada tahun 1994, Sallinen menyimpulkan bahwa sensitifitas dan spesifisitas yang terbaik didapatkan pada nilai Ki-67 sebesar 8% dan Ki-67 dikatankan memiliki potensi untuk menilai prognosis yang kuat dengan angka 15,3% sebagai batas. Pada studi yang dilakukan oleh Di pada tahun 1997 menyimpulkan bahwa nilai Ki-67 <8% berkaitan dengan angka keselamatan yang lebih panjang baik 5 maupun 10 tahun. Sedangkan pada studi yang dilakukan oleh Reavey-Cantwell pada tahun 2001 menyatakan bahwa pasien-pasien penderita astrositoma dengan nilai Ki-67 >20% memiliki resiko kematian 2,2 kali lebih
besar dibandingkan dengan pasien-pasien penderita astrositoma dengan nilai Ki-67 <20% . Seluruh publikasi-publikasi ini mendukung bahwa Ki-Ki-67 memiliki nilai prognosis baik terhadap angka keselamatan maupun terhadap rekurensi (Johannessen, 2006).
Pada penelitian ini tidak ditemukan ekspresi VEGF yang negatif dan +1, dan mayoritas memiliki ekspresi +4. Setelah dilakukan analisis statistik dapat ditarik kesimpulan bahwa ekspresi VEGF tidak berhubungan dengan derajat klasifikasi astrositoma. Hal ini sama dengan studi yang dilakukan oleh Oehring et al pada 1999, di mana tidak dijumpai hubungan antara ekspresi VEGF terhadap derajat klasifikasi astrositoma (p = 0.3749). Berbeda dengan studi yang dilakukan oleh Wang et al pada 1999, menyimpulkan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara ekspresi positif VEGF terhadap klasifikasi patologi dan grade (p < 0.01).
Pada penelitian ini tidak ditemukan hubungan yang bermakna antara ekspresi VEGF terhadap mortalitas (p = 0.813), berbeda dengan studi yang dilakukan oleh Oehring et al pada 1999 menyimpulkan bahwa ekspresi VEGF memiliki hubungan yang bermakna dengan mortalitas (p = 0,0034). Abdulrauf et al dalam Oehring 1999 melakukan studi yang fokus pada fibrillary astrocytoma (derajat II WHO), pada 52% kasus dengan pewarnaan VEGF yang positif berhubungan signifikan dengan prognosis bila dibandingkan dengan kasus dengan pewarnaan negatif (Oehring, 1999). Studi yang dilakukan oleh Wang W et al pada 1999, menyimpulkan bahwa survival rate (6, 12, 24 bulan) pada pasien dengan astrositoma menurun secara gradual saat laju positif VEGF meningkat (W,1999). Investigasi VEGF juga dilakukan pada beberapa studi pada tumor jaringan tubuh
yang lain. Dalam Oehring, 1999, ekspresi VEGF pada adenokarsinoma memiliki nilai prognostik, tidak seperti pada kanker lambung pada manusia. Relf et dalam Oehring, 1999, mendemonstrasikan nilai prognostik ekspresi VEGF pada kanker payudara, yang tidak dikonfirmasi pada studi-studi lain (Oehring, 1999).
Pada penelitian ini tidak ditemukan hubungan yang signifikan antara ekspresi VEGF terhadap ekspresi Ki-67 (p = 0.508). Berbeda dengan studi yang dilakukan oleh Ruan pada tahun 2003 melalui studinya tentang ekspresi VEGF dan KI-67 pada astrositoma menemukan bahwa ekspresi VEGF dan Ki-67 berbeda secara bermakna pada tiap grading astrositoma dan berkorelasi positif dengan peningkatan progresifitas tumor (ruan, wag, & wang, 2003). Investigasi hubungan antara VEGF dengan Ki-67 juga dipelajari pada beberapa jenis tumor lainnya. Studi yang dilakukan oleh Djordjevic et al pada 2006 mengenai signifikansi nilai prognostik ekspresi VEGF pada karsinoma renal clear cell, menyimpulkan bahwa ekspresi VEGF > 75% berhubungan secara signifikan terhadap Ki-67 (p = 0.023) (Djordjevic, 2007). Studi yang dilakukan oleh Mineta et al pada 2002 pada 109 pasien dengan karsinoma sel skuamosa lidah, menemukan bahwa VEGF berkorelasi dengan Ki-67 secara signifikan. Ekspresi VEGF juga berhubungan secara signifikan terhadap stadium lanjut dan VEGF merupakan prediktor independen terhadap relapse free survival (RFS) (Hiroyuki, 2002). Berbeda dengan yang dikemukakan oleh Ji et al pada studi yang dilakukannya pada 45 pasien dengan karsinoma kelenjar air liur pada 2003, bahwa tidak ditemukan korelasi yang signifikan antara ekspresi VEGF terhadap Ki-67 dan VEGF juga merupakan fator prognostik independen pada karsinoma kelenjar liur (Lim, 2003). Studi yang dilakukan oleh Sun et al pada pasien-pasien dengan
karsinoma sel skuamosa laring menemukan bahwa ditemukan korelasi yang positif antara VEGF dan Ki-67. Namun Bao et al melalui studi yang dilakukannya tentang hubungan Ki-67 dengan p53, VEGF dan C-erbB-2 menemukan bahwa tidak ditemukan korelasi bermakna antara Ki-67 dengan VEGF, namun ko-ekspresi dari Ki-67 dan VEGF berhubungan dengan ukuran tumor dan stadium klinis (Li et al., 2004).
Sebagai limitasi dari penelitian ini adalah tidak adanya pembatasan usia pada pengambilan subjek, mengingat bahwa sifat biologis yang mendasari astrositoma anak berbeda dengan dewasa. Limitasi berikutnya adalah perhitungan subjek dihitung dengan total sampling, sehingga perhitungan statistik tidak sesuai. Jumlah subjek yang high grade sedikit dan tidak dilakukan pemeriksaan angiografi untuk menilai pembuluh darah pada tumor karena tindakan pembedahan yang dilakukan bersifat urgency juga menjadi limitasi pada penelitian ini.
BAB 7
SIMPULAN DAN SARAN
7.1 Simpulan
1. Tidak ditemukan hubungan ekspresi VEGF terhadap Ki-67 labeling index pada penderita astrositoma, p = 0.508 (p>0.05)
2. Tidak terdapat hubungan antara klasifikasi astrositoma berdasarkan WHO dengan jenis kelamin penderita astrositoma, p = 1,000 (p>0.05)
3. Terdapat hubungan antara klasifikasi astrositoma berdasarkan WHO dengan mortalitas penderita astrositoma, p = 0,001 (p<0.05)
4. Tidak ada hubungan bermakna antara indeks proliferasi berdasarkan nilai Ki-67 dengan klasifikasi astrositoma berdasarkan WHO, p = 0,076 (p>0.05)
5. Tidak ada hubungan antara indeks proliferasi berdasarkan nilai Ki-67 dengan mortalitas penderita astrositoma, p = 0,512 (p>0.05)
6. Tidak ditemukan hubungan ekspresi VEGF terhadap klasifikasi astrositoma berdasarkan WHO, p = 0.704 (p>0.05)
7. Tidak ditemukan hubungan ekspresi VEGF terhadap mortalitas penderita astrositoma, p = 0.680 (p>0.05)
7.2 Saran
1. Jumlah subjek yang diambil sebaiknya dihitung berdasarkan perhitungan besar subjek merujuk pada penelitian sebelumnya
