ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA ANTIBAKTERI DARI FRAKSI ETIL ASETAT KULIT BATANG
LANSIUM DOMESTICUM CORR. CV KOKOSSAN
Tri Mayanti, Euis Julaeha, Yurita Putri A.
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran
ABSTRAK
Kokossan merupakan tanaman dari famili Meliaceae yang tumbuh di Indonesia. Famili Meliaceae dikenal kaya akan senyawa terpenoid dengan berbagai bioaktivitasnya. L. domesticum Jack (duku) sebagai tanaman satu spesies dengan kokossan telah lama digunakan dalam pengobatan tradisional khususnya obat diare yang disebabkan oleh bakteri. Penelitian lain telah diketahui bahwa L. domesticum Corr memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri penyebab diare. Telah dilakukan isolasi dan karakterisasi senyawa antibakteri dari fraksi etil asetat kulit batang kokossan (L. domesticum Corr). Kulit batang kokossan dimaserasi dengan metanol. Ekstrak pekat metanol difraksinasi menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat. Fraksi aktif etil asetat dipisahkan dan dimurnikan melalui metode kromatografi sehingga diperoleh isolat berbentuk kristal amorf berwarna putih sebanyak 52,5 mg dengan titik leleh 143-144 0C. Isolat murni dikarakterisasi dengan pereaksi Liebermann-Buchard dan spektrofotometer inframerah. Isolat diduga merupakan golongan onoceran yang identik dengan onocerandiendion. Hasil uji hayati menunjukkan isolat memiliki aktivitas antibakteri secara in vitro terhadap bakteri E. coli pada konsentrasi 500-1000 ppm dengan kloroform sebagai kontrol.
Kata kunci : Kokossan; Meliaceae; Onocerandiendion; Aktivitas antibakteri
ISOLATION AND CHARACTERIZATION ANTIBACTERIAL COMPOUND FROM ETHIL ACETATE FRACTION OF LANSIUM DOMESTICUM CORR.
CV KOKOSSAN BARK
ABSTRACT
Kokossan is one of plant from Meliaceae family which grows in Indonesia. Family Meliaceae consists of triterpenoid compounds with several bioactivities. L. domesticum Jack (duku) which is the same species with kokossan often be used in
folk medicine especially diarrhea drug caused by bacteria. The other research showed that L. domesticum Corr has antibacterial activity against bacteria which caused diarrhea. Isolation and characterization antibacterial compound from the bark of L. domesticum Corr (kokossan) has been done. Fresh bark of kokossan was maserated with methanol. Concentrated methanol extract was fractionated using n-hexane and ethyl acetate solvent. Bioactive compounds in ethyl acetate were separated by chromatography method so that obtained white amorphous crystal as much as 52.5 mg with melting point 143-144 0C. The pure isolate was characterized with Liebermann-Buchard test and infrared spectrophotometer. After identified, it’s presumed that isolate is onoceran compound, like onocerandiendion. The result of bioassay showed that the isolate has in vitro antibacterial activity against E. coli at concentration 500-1000 ppm with chloroform used as a control.
Keywords : Kokossan; Meliaceae; Onocerandiendion; Antibacterial activity
PENDAHULUAN
Kokossan merupakan tanaman dari famili Meliaceae dan kultivar dari L. domesticum yang lebih dikenal dengan nama duku. Kokossan dan duku yang banyak tumbuh tersebar di Indonesia telah lama digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai obat diare. Menurut De Clereq, bagian tanaman L. domesticum Corr. kultivar duku yang digunakan dalam pengobatan tradisional penyakit diare yang disebabkan oleh bakteri adalah kulit batang bagian dalamnya (Heyne, 1987). Penelitian pendahuluan tentang studi pemanfaatan biji duku L. domesticum Jack sebagai obat diare secara in vitro telah dilakukan oleh Loekitowati et al. (2000). Hasil pengamatan menunjukkan ekstrak etanol, fraksi n-heksana, diklorometana, dan etil asetat aktif terhadap bakteri penyebab diare secara in vitro yaitu E. coli, Salmonella typhi, dan Shigella flexneri.
Senyawa dari kulit buah L. domesticum Corr. kultivar duku yang berhasil diisolasi yaitu asam lansat (Kiang et al., 1967), asam lansiolat (triterpen golongan lanosta), dan lansiosida A, B, C (Nishizawa et al., 1983). Pada daun L. domesticum Corr. kultivar duku dilaporkan adanya asam lansiolat (Nishizawa et
al., 1983) dan asam 3-okso-24-sikloarten-21-oat (Nishizawa et al., 1989). Sedangkan pada biji buah L. domesticum Corr. kultivar duku ditemukan dukunolida A, B, C (Nishizawa et al., 1985) dan dukunolida D, E, F (Nishizawa et al., 1988) yang merupakan golongan tetranortriterpenoid.
Kosela et al. (2001) telah melakukan studi isolasi dan penentuan struktur molekul senyawa kimia dalam fraksi n-heksana kulit buah kokosan (L. domesticum Var.). Senyawa yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi adalah Onocerandiendion.
Penelitian mengenai senyawa antibakteri dari kulit batang kokosan belum dilakukan. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menemukan senyawa antibakteri dari kulit batang L. domesticum Corr. kultivar kokosan yang dapat dijadikan alternatif sumber alami sebagai senyawa antibakteri baru.
BAHAN DAN METODE Bahan Tanaman
Kulit batang L. domesticum Corr. kultivar kokosan sebanyak 5 kg diperoleh dari daerah Cililin Kabupaten Bandung pada bulan September 2005.
Instrumen/Peralatan
Bejana maserasi, mesin grinding, seperangkat alat distilasi, penguap hampa putar R114 Buchi yang dilengkapi vacuum system Buchi B169, bejana kromatografi (chamber), seperangkat alat kromatografi kolom, sprayer, elektrotermal, lampu ultralembayung Vilber lourmat λ 254 nm, alat ukur titik leleh John-Fisher, spektrofotometer inframerah System Perkin Elmer Spectrum One, serta ose.
Ekstraksi dan Fraksinasi
Sebanyak kulit batang kokosan (5 kg) dihaluskan dengan mesin grinding menjadi bentuk serbuk (2,98 kg) kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak 4 x @ 24 jam pada suhu kamar. Filtrat kemudian disaring dan diuapkan pada tekanan rendah, suhu 40 0C. Perlakuan ini diulang sampai ekstrak berwarna bening. Ekstrak pekat metanol (211,60 g) ini kemudian dilarutkan dengan
metanol:air (8:2 v/v) dan dipartisikan berturut-turut dengan n-heksana dan etil asetat kemudian diuapkan pelarutnya hingga diperoleh ekstrak pekat n-heksana (70,70 g), etil asetat (41,90), dan metanol-air. Fraksi yang diperoleh diuji antibakteri untuk selanjutnya dipilih salah satu fraksi aktif untuk diisolasi.
Penapisan Fitokimia
Ekstrak pekat metanol diuji fitokimia yaitu uji alkaloid (negatif), uji terpenoid/steroid (positif), dan fenolik (negatif).
Kromatografi
Ekstrak yang aktif antibakteri (etil asetat) dipisahkan dengan metode kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan fasa diam silika gel GF254 dan pelarut dengan elusi bertahap (n-heksana:diklorometan:etil asetat). Fraksi hasil KCV dipantau dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dan disemprot dengan penampak noda asam sulfat dalam etanol atau serium sulfat. Fraksi yang mempunyai pola noda sama digabungkan (1-18 fraksi gabungan), lalu diuapkan dengan penguap vakum pada suhu 40 oC dan diuji aktivitas antibakterinya. Fraksi aktif 4 dan 5 (1,4854 g) digabung dan dilakukan pemisahan ulang dengan kromatografi kolom terbuka dengan silika gel G60 (70-230 mesh) menggunakan eluen n-heksan:etil asetat (9,5:0,5 v/v). Fraksi 4E dipisahkan kembali dengan kromatografi kolom terbuka menggunakan fasa diam silika gel G60 (70-230 mesh) dan eluen n-heksan:aseton (99,95:0,05 v/v). Fraksi 4EB berupa kristal amorf berwarna putih diperoleh sebanyak 52,5 mg.
Uji Kemurnian
Uji kemurnian dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan beberapa macam sistem eluen, plat ODS, dan dua dimensi.
Uji Antibakteri
Bakteri uji yang digunakan adalah E. coli (bakteri Gram negatif) dan B. cereus (bakteri Gram positif). Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan secara in vitro dengan menggunakan metode cakram kertas yang berdiameter 6 mm. Pelarut kloroform digunakan sebagai kontrol.
Pembuatan media agar. Sebanyak 7,2 g nutrient broth (2 g natrium klorida 0,85%; 1,2 g ekstrak daging sapi dan 4 g pepton) disuspensikan dalam 400 mL akuades kemudian ditambahkan 12 g agar dan dipanaskan hingga larut. Selanjutnya disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada 1210C. Penyediaan bakteri uji dilakukan pada media agar (permukaan miring) dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama 18-24 jam.
Penentuan aktivitas antibakteri. Sampel dilarutkan dalam pelarut kloroform sampai diperoleh konsentrasi tertentu kemudian dimasukkan cakram kertas dan disterilisasi menggunakan sinar ultra lembayung sekitar 24 jam. Cakram kertas berisi sampel diletakkan di atas permukaan agar dan diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 0C. Setelah lewat masa inkubasi, diameter zona hambat yang terbentuk berupa daerah bening, diukur sebagai parameter untuk menentukan besarnya aktivitas antibakteri.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak metanol, n-heksana, dan etil asetat diuji aktivitasnya sebagai panduan untuk memudahkan dalam memperoleh senyawa aktif antibakteri dan dipilih salah satu fraksi aktif untuk diisolasi. Hasil uji antibakteri ekstrak metanol, n-heksana, dan etil asetat tercantum pada Tabel 1.
Tabel 1. Data penghambatan pertumbuhan bakteri oleh ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksana kulit batang L. domesticum kultivar kokosan dengan metode cakram kertas
Diameter hambat pertumbuhan bakteri (mm) Metanol n-heksana Etil asetat
Bakteri 0,1 (%) 0,5 (%) 1,0 (%) 0,1 (%) 0,5 (%) 1,0 (%) 0,1 (%) 0,5 (%) 1,0 (%) Bakteri Gram positif
B. cereus 10,5 9,5 12,0 - - - 11,0 10,5 12,5
Bakteri Gram negatif
E. coli - 13,5 10 - - - 9,0 10,5 14,0
Keterangan :
Berdasarkan data pada Tabel 1 ternyata ekstrak yang memiliki aktivitas antibakteri terbesar terhadap bakteri B. cereus (G+) dan bakteri E. coli (G-) adalah ekstrak etil asetat dengan diameter zona hambat terbesar terhadap bakteri pada konsentrasi 1,0%.
Ekstrak aktif etil asetat dipisahkan dengan kromatografi cair vakum (KCV) menghasilkan 18 fraksi. Fraksi 4 dan 5 dipilih untuk diuji aktivitasnya terhadap bakteri B. cereus (G+) dan bakteri E. coli (G-) karena memiliki pola noda sama yang mudah untuk dipisahkan, selain itu jumlahnya yang relatif banyak (1,4854 g) sehingga memungkinkan untuk dipisahkan pada proses isolasi tahap selanjutnya. Hasil uji antibakteri fraksi 4 dan 5 terlihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Data penghambatan pertumbuhan bakteri oleh fraksi 4 dan 5 hasil kromatografi cair vakum (KCV) pada konsentrasi 0,1% dengan bakteri E. coli dan B. cereus menggunakan metode cakram kertas
Diameter hambat pertumbuhan bakteri (mm) Fraksi 4 Fraksi 5 Etil asetat
Bakteri 0,1% 0,1% 0,1% 0,5% 1,0%
Bakteri Gram positif
B. cereus - - 11,0 10,5 12,5
Bakteri Gram negatif
E. coli 6,0 7,0 9,0 10,5 14,0
Bila dibandingkan dengan diameter zona hambat awal ekstrak etil asetat, diameter zona hambat fraksi 4 dan 5 hasil KCV mengalami penurunan. Hal ini diduga disebabkan oleh adanya efek sinergis (efek dimana jika kerja dua atau lebih senyawa secara bersamaan jauh lebih besar daripada satu senyawa saja) senyawa antibakteri dengan senyawa lain sehingga ketika terjadi pemisahan, efek sinergis tersebut menghilang.
Fraksi 4 dan 5 digabung dan dipisahkan kembali dengan metode kromatografi kolom terbuka hingga diperoleh isolat berbentuk kristal amorf berwarna putih sebanyak 52,5 mg dengan titik leleh 143-144 0C. Selain itu isolat tidak berpendar di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm. Isolat dikarakterisasi dengan cara kimia, fisik, dan fisikokimia menggunakan spektrofotometri inframerah (FT-IR).
Uji Kimia Isolat. Berdasarkan uji fitokimia, isolat diduga merupakan golongan senyawa triterpenoid. Hal ini ditunjukkan oleh hasil uji Liebermann-Buchard yang menghasilkan warna merah kecoklatan.
Uji Fisikokimia Isolat. Spektroskopi inframerah berfungsi untuk mengetahui keberadaan gugus fungsi pada suatu senyawa. Serapan pada bilangan gelombang tertentu berasal dari adanya interaksi antara atom-atom yang terikat baik berupa bending ataupun stretching. Berdasarkan spektrum inframerah pada Gambar 1.
Gambar 1. Spektrum inframerah isolat F.4EB dengan menggunakan pelet KBr
Identifikasi Senyawa. Berdasarkan uji fitokimia, isolat diidentifikasikan sebagai senyawa triterpenoid. Dari hasil pengukuran spektroskopi inframerah, isolat ini diduga merupakan senyawa triterpenoid dari golongan onoceran. Isolat ini memiliki karakter yang identik dengan senyawa golongan onoceran yang telah ditemukan pada kulit buah kokosan yaitu onocerandiendion (Kosela et al., 2001). Keberadaan gugus fungsi dari isolat diduga banyak memiliki kemiripan dengan spektrum inframerah dari onocerandiendion seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3. Regang OH Regang C-H alifatik Regang C=O Regang C=C Regang C-O Lentur C=C
Tabel 3. Perbandingan data spektroskopi inframerah dan titik leleh isolat dengan onocerandiendion
Parameter Fraksi 4EB Onocerandiendion
Regang =C-H 3040 3100
Regang C=O 1708,8 1714
Lentur C-H (CH2) 1450 1456
Lentur C-H (Gem dimetil) 1384,8-1360 1386-1366 Lentur C-H dalam bidang 1010,6 1034 Lentur C-H luar bidang 983,6 980
Lentur C=C 887,2 844
Bilangan gelombang (, cm-1)
Lentur CH2 721,3 722
Titik leleh 143-144 0C 140-142 0C
Berdasarkan data pada Tabel 3. maka isolat diduga merupakan senyawa golongan onoceran yang mirip dengan onocerandiendion namun telah mengalami oksidasi pada ikatan rangkap C=C ataupun reduksi pada gugus karbonilnya C=O. Hal ini menyebabkan adanya gugus –OH hidroksil pada struktur isolat yang diperkuat dengan adanya regang –OH pada panjang gelombang 3402,2 cm-1.
O O Onocerandiendion R R Onoceran
Gambar 2. Kerangka struktur onoceran dan onocerandiendion (Kosela et al., 2001)
Hasil Uji Antibakteri Isolat
Aktivitas antibakteri isolat ditentukan pada konsentrasi 500 ppm dan 1000 ppm terhadap dua bakteri yaitu E. coli dan B. cereus. Data dan hasil uji antibakteri isolat pada Tabel 4.
Tabel 4 Data penghambatan pertumbuhan bakteri oleh isolat F.4EBterhadap bakteri E. coli dan B. cereus menggunakan metode cakram kertas.
Diameter zona hambat pertumbuhan bakteri (mm) F.4EB (ppm) Bakteri 500 1000 Kloroform (kontrol) 7,5 8,0 E. coli 6,0 6,5 - - - B. cereus + + + Keterangan :
+ = diameter zona hambat kecil
= tidak ada zona hambat pertumbuhan bakteri
Hasil pengujian menunjukkan bahwa pada rentang konsentrasi 500 sampai 1000 ppm, isolat masih memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri E. coli. dan B. cereus. Namun keaktifan terhadap B. cereus diduga berasal dari kloroform yang digunakan sebagai pelarut. Hal ini diperkuat dengan adanya zona hambat pada kloroform terhadap bakteri Gram positif B. cereus. Kloroform memiliki aktivitas antibakteri karena dapat bertindak sebagai disinfektan golongan halogen organik. Hal ini berarti isolat hanya aktif terhadap bakteri E. coli dan ternyata hasil ini mendukung alasan penggunaan L. domesticum Corr. sebagai obat diare karena bakteri yang cukup potensial menyebabkan diare yaitu E. coli (Loekitowati et al., 2000)
Selain itu, isolat memiliki aktivitas antibakteri terbesar terhadap bakteri E. coli pada konsentrasi 1000 ppm dengan diameter hambat sebesar 8,0 mm. Dari data terlihat adanya peningkatan diameter zona hambat seiring dengan meningkatnya konsentrasi isolat.
Senyawa aktif antibakteri atau isolat diperoleh diduga merupakan senyawa triterpenoid. Mekanisme antibakteri senyawa triterpenoid umumnya terjadi melalui pengrusakan membran sel bakteri karena sifat senyawa triterpenoid cenderung lipofilik (Cowan, 1999). Kerusakan membran sel dapat terjadi ketika senyawa aktif antibakteri bereaksi dengan sisi aktif dari membran atau dengan melarutkan konstituen lipid dan meningkatkan permeabilitasnya. Membran sel bakteri terdiri dari fosfolipid dan molekul protein. Akibat peningkatan permeabilitas, senyawa antibakteri dapat masuk ke dalam sel. Ketika di dalam sel,
senyawa tersebut dapat melisis membran sel atau mengkoagulasi sitoplasma dari sel bakteri tersebut (Banwart, 1981).
KESIMPULAN
1. Berdasarkan hasil uji Liebermann-Buchard isolat dan hasil perbandingan terhadap titik leleh dan spektrum inframerah, isolat diduga merupakan senyawa triterpenoid golongan onoceran yang identik dengan onocerandiendion.
2. Isolat yang diperoleh memiliki aktivitas antibakteri secara in vitro terhadap bakteri E. coli pada konsentrasi 1000 ppm dengan diameter hambat 8,0 mm.
DAFTAR PUSTAKA
Banwart, G. J. (1981). Basic Food Microbiology. Avi. New York
Cowan, M. M. (1999). Plants products as antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews, 12(4), 564-582.
Heyne, K. (1987). Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid II. Diterjemahkan oleh Badan Litbang Kehutanan Yakarta. Yayasan Sarana Wana Jaya. Jakarta.
Kiang, A.K., E. L. Tan., F.Y. Lim., K. Habaguchi., K. Nakanishi., L. Fachan & G. Ourisson. (1967). Lansic acid, a bicyclic triterpene. Tetrahedron Letters, 37, 3571-3574.
Kosela, S., N. Wendri & Riswanto. (2001). Studi isolasi dan penentuan struktur molekul senyawa kimia dalam fraksi n-heksana kulit buah kokosan (L. domesticum Var). Jurnal Penelitian, 5(1), 329-335. Jurusan Kimia FMIPA UI. Depok.
Loekitowati, H., Poedji & Hermansyah. (2000). Studi pemanfaatan biji duku (Lansium domesticum Jack) untuk obat diare secara in vitro. Jurnal Penelitian Sains, 7, 41-48.
Nishizawa, M., H. Nishide., S. Kosela & Y. Hayashi. (1983). Structures of lansiosides : biologically active new triterpene glycosides from Lansium domesticum. Journal Organic Chemistry, 48, 4462-4466.
Nishizawa, M., Y. Nademoto., S. Sastrapradja., M. Shiro, & Y. Hayashi. (1985). Structure of dukunolide, bitter principles of Lansium domesticum. American Chemical Society, 50(26), 5487-5490. Washington DC.
Nishizawa, M., Y. Nademoto., S. Sastrapradja., M. Shiro & Y. Hayashi. (1988). Dukunolide D, E and F: new tetranortriterpenoids from the seeds of Lansium domesticum. Phytochemistry, 27(1). 237-239. Pergamon Journal Ltd. Great Britain.
Nishizawa, M., M. Emura., H. Yamada., M. Shiro., Chairul, Y. Hayashi & H. Tozuda. (1989). Isolation of a new cycloartanoid triterpenes from leaves Lansium domesticum: novel skin-tumor promotion inhibitors. Tetrahedron Letter, 30 (41), 5615-5618.
