LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI (18). docx

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER ISOLASI DNA DAN ELEKTROFORESIS

Disusun oleh:

Biologi B 2015

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA

2016

Lia Indraswati 15308141004

Nur Aisyah 15308141007

Aisya Shahrani T. 15308141010

Muhson Isroni 15308141012

Saraswati Puji Astuti 15308141025

PENDAHULUAN A. Latar Belakang

Percobaan isolasi DNA tanaman perlu dilakukan karena isolasi DNA sendiri merupakan teknik esensial dalam biologi molekuler. Isolasi DNA adalah tahap awal dalam mempelajari DNA sequence yang spesifik dengan populasi DNA yang lengkap, dan dalam analisa struktur gen dan ekspresi gen ( Surzycki, 1936 ).

Pada sel eukariotik termasuk tanaman, bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. ( Surzycki, 1936 ). Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA.

Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam tumbuhan sitoplasma. ( Elrod, 2007 ).

Terdapat organel-organel bermembran ganda pada dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA dari tanaman dan hewan untuk mengetahui DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Dan Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleus yang terbungkus membran ( Albert, 1994 )

DNA bisa diukur dengan memotong DNA dengan enzim restriksi, menjalankannya pada gel agarosa, pewarnaan dengan bromida etidium atau noda yang berbeda dan membandingkan intensitas DNA dengan penanda DNA konsentrasi dikenal. Menggunakan teknik Southern blot ini diukur DNA dapat diisolasi dan diperiksa lebih lanjut menggunakan teknik elektroforesis, PCR dan RFLP. Prosedur ini memungkinkan diferensiasi diulang dalam urutan genom. Ini adalah teknik-teknik yang ilmuwan forensik digunakan untuk perbandingan, identifikasi, dan analisis.

B. Tujuan

2. Memahami prinsip kerja dan kegunaan teknik elektroforesis

3. Memahami pembuatan gel agarosa

4. Memahami cara memisahkan asama- asam nukleat dan molekul protein dengan menggunakan peralatan elektroforesis

C. TINJAUAN PUSTAKA

dapat dijadikan sebagai pengawet alami untuk industri pengolahan makanan. Daun melinjo memberikan efek yang baik sebagai pengawet makanan, dari inhibitor rasa dan peningkat rasa (Santoso, 2008).

Menurut Singh (2008), Glodokan tiang atau yang disebut Ashok adalah tumbuhan asli India dan Srilanka. Pohon ini dapat mencapai tinggi hingga 25 kaki dan membentuk bangun kolumnar. Daunnya glossy berwarna hijau, panjang, dengan tepi daun bergelombang. Ashok umumnya terlihat seperti pohon yang dipenuhi daun sehingga sulit terlihat batangnya, tetapi kadang-kadang cabangnya tidak terumbai ke bawah melainkan horizontal sehingga batangnya dapat terlihat dengan jelas.

Menurut Anonim (2010), Polyalthia longifolia merupakan tumbuhan evergreen yang berasal dari India, umumnya ditanam karena keefektifannya dalam mengurangi polusi udara. Daunnya bagus untuk dijadikan dekorasi ornamental dan digunakan pada perayaan festival. Pohonnya dapat dipotong menjadi berbagai bentuk. Daunnya mengandung 22 senyawa kimia yang bersifat toksik (Anonim, 2010).

Gaharu (Gyrinops versteegii (Gilg) Domke) merupakan salah satu tumbuhan hutan yang bernilai ekonomi tinggi yang mampu menghasilkan gubal berupa kayu yang mengalami pelapukan akibat serangan beberapa spesies jamur. Gubal gaharu mengandung damar wangi (aromatic resin) yang beraroma harum dan telah lama diperdagangkan sebagai komoditi mahal untuk keperluan industri parfum, hio, dan dupa(Zubaidi dan Farida, 2008).

Gaharu juga dikenal memiliki beberapa khasiat pengobatan. Dalam pengobatan tradisional di India (Ayurveda), tanaman gaharu bermanfaat membantu penyembuhan luka yang membusuk (Snelder and Lasco, 2008). Dalam pengobatan tradisional Cina (TCM), gaharu digunakan untuk mengobati gangguan pada sistem pernafasan, perut dan ginjal. Gaharu juga dibuat sebagai kosmetik, obat rematik, obat gosok, penyembuh perut kembung, dan obat sakit jantung (Setyowati dan Wardah, 2007). Ekstrak daun gaharu telah diteliti memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi (Mega dan Swastini, 2010).

yang tinggi terdapat pada daun yang tumbuh pada urutan ke-3 sampai urutan ke-5 dari pangkal batang daun dan dipetik pukul 5-6 pagi (Zuhud, 2011). Daun sirsak mengandung senyawa flavonoid, tanin, fitosterol, kalsium oksalat, dan alkaloid (Adjie, 2011). Senyawa flavonoid berfungsi sebagai antioksidan, antimikroba, anti virus, pengatur fotosintesis, dan pengatur tumbuh (Ardiansyah, 2007). Tanaman ini memiliki bentuk daun lonjong agak memanjang, panjang 6-8 cm, lebar 3-4 cm, bagian ujung meruncing. Daun yang kering berwarna abu-abu kehijaun, agak bergelombang, melengkung, permukaan daun atas-bawah licin dan mengkilap, tulang daun sekunder 12-16 pasang. (Tarigan, 2004).

Daun kembang telang termasuk daun tidak lengkap karena tidak memiliki upih daun, hanya memiliki tangkai daun (petiolus) dan helai daun (lamina). Akar pada tumbuhan kembang telang termasuk akar tunggang dan warnanya putih kotor. . Habitat kembang telang adalah tumbuhan tropika dataran rendah lembab dan agak lembab. 2.2. Pertumbuhan Tanaman Pertumbuhan dipengaruhi oleh faktor internal dan eksternal. Faktor internal yang mempengaruhi pertumbuhan antara lain: umur, keadaan tanaman, faktor hereditas, dan zat pengatur tumbuh. Faktor eksternal yang mempengaruhi pertumbuhan adalah iklim, tanah, dan kondisi biologis dari lingkungan (Gardner et al., 1991).

Pohon Mangga yang berasal dari biji pada umumnya tegak, kuat dan tinggi sedangkan yang berasal dari sambungan atau tempel lebih pendek dan cabang membentang. Daun yang masih muda biasanya berwarna kemerahan, keunguan, atau kekuningan yang kemudian hari akan berubah pada bagian permukaan sebelah atas menjadi hijau mengkilat, sedangkan bagian permukaan bawah berwarna hijau muda. Biji berwarna putih, gepeng memanjang tertutup endokrap yang tebal, mengayu dan berserat. Biji ini terdiri dari,

ada yang monoembrional dan ada pula yang poliembrional (Rukmana,1997).

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). Pada sel-sel tanaman DNA ekstrakromosal ini dapat ditemukan di mitokondria dan kloroplas (Farrel, 2004).

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Donata, 2007).

Isolasi DNA tanaman diawali dengan penghancuran dinding sel tanaman. Kegagalan dalam memecah dinding sel akan mempengaruhi hasil akhir isolasi. Proses inilah yang membuat isolasi DNA tanaman lebih sulit dibandingkan isolasi DNA bakteri karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan tebal. Penghancuran dinding sel dapat dilakukan secara kimiawi dan mekanik. Secara mekanik dapat dilakukan dengan cara penggerusan menggunakan mortar dingin dan bantuan nitrogen cair. Penggunaan nitrogen cair membuat daun menjadi kering dan mudah untuk dihancurkan. Nitrogen cair juga menjaga suhu tetap dingin sehingga DNA tidak rusak. Nitrogen cair memiliki suhu minus 196°C. Selain itu, dengan menggunakan nitrogen cair maka hasil penggerusan berupa serbuk sehingga mengurangi peluang berkurangnya sampel dibandingkan bila hasilnya berupa ekstrak cair yang mudah lengket pada mortar.Selain nitrogen cair, penggerusan sampel daun ditambahkan juga Polivynilpolipirolidon (PVPP). PVPP berfungsi sebagai antioksidan untuk mencegah terbentuknya warna coklat (browning) pada DNA. PVPP menghambat enzim polifenol oksidase yang dapat mendegradasi rantai DNA dan menyebabkan teroksidasinya senyawa fenol (Prana & Hartati, 2003).

kloroform:isoamilalkohol (24:1) untuk menghilangkan lemak,protein, polisakarida, dan pengotor lainnya karena keberadaan senyawa-senyawa tersebut dapat mempengaruhi kualitas dan kuantitas DNA yang diisolasi. Larutan tersebut juga berfungsi memisahkan DNA dari membran sel yang memiliki bobot molekul lebih besar. Kloroform:isoamilalkohol yang memiliki densitas paling tinggi akan berada di dasar tabung sentrifus. Larutan yang berada di bagian tengah merupakan protein yang telah larut dalam kloroform:isoamilalkohol. Supernatan yang dihasilkan mengandung DNA, RNA, dan sebagian protein (Sudjadi, 2008). Selain itu, penambahan isoamilalkohol mengurangi busa yang muncul saat ekstraksi DNA. Penggunaan larutan NaCl pada konsentrasi tinggi untuk mengatasi keberadaan polisakarida pada konsentrasi yang tinggi (Khanuja et al., 1999). Penambahan isopropanol bertujuan mengendapkan DNA. Penambahan alkohol absolut bertujuan memekatkan larutan DNA dan menghilangkan residu kloroform yang digunakan pada proses deproteinase (Ausubel et al., 1990). DNA yang diperoleh dicuci dengan alkohol 70% untuk menghilangkan sisa-sisa pengotor. DNA yang diperoleh dilarutkan dengan bufer TE sehingga dapat disimpan dan digunakan untuk analisis lebih lanjut.

Elektroforesis adalah teknik untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran molekul. Teknik ini merupakan teknik yang paling banyak dipakai dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Fairbanks, 1999). Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu

Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994; Fairbanks and Andersen, 1999).

Bahan yang digunakan dalam elektroforesis adalah Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Penggunaan Etidium Bromida berfungsi untuk meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993).

METODELOGI

A. Tempat dan Waktu 1. Isolasi DNA

Hari : Selasa

Tanggal : 08 november 2016 2. Elektroforesis

Hari : Selasa

Tanggal : 22 November 2016 Tempat:Laboratorium Dasar Biologi

B. Metode

a. Isolasi DNA Tanaman Alat :

- Tabung Eppendorf 15ml - Mikropipet

- Tissue

1) Sampel daun mangga dicuci kemudian dikeringkan dengan tissue 2) 0,5 gram sampel daun mangga ditimbang menggunakan neraca analitik 3) Kemudian dimasukkan kedalam mortar

4) Ditambahkan dengan 0,1 PVP dan 5 ml CTAB dan digerus sampai halus 5) Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 15 ml dan dikocok

bolak-balik

6) Dipanaskan di waterbath selama 30 menit

7) Didinginkan selama 5 menit kemudian ditambah dengan 5 ml CI dan disentrifugasi selama 10 menit 3500 rpm

8) Diambil lapisan atas dan dipindah ke tabung baru

9) Ditambah 5 ml isopropanol kemudian dimasukkan ke dalam kulkas 10) Disentrifugasi 15 menit 3500 rpm

11) Cairan dibuang, pellet dibilas dengan alkohol 70% 12) Disentrifugasi 10 menit 3500 rpm

13) Cairan / supernatan diambil dengan pipet

14) DNA dikeringanginkan dengan cara membalikkan tabung 15) Pellet DNA dilarutkan dalam 1 ml aquadest

Bahan :

- Sampel DNA

- Larutan penyangga / buffer elektroforesis :  Tris-base

 Boric Acid

 EDTA 0,5 M pH 8  Aquades

Cara kerja :

Pembuatan Gel Agarose 1,2 %

1. Agarose ditimbang sebanyak 0,3 gram, disukkan kedalam erlenmeyer 25ml 2. ditambahkan 25 ml TBE 0,5 X, panaskan dalam microwave

3. diangkat dan dibiarkan sampai suhu ± 70°C. Siapkan cetakan gel elektroforesis. 4. ditmbahkan 5 µlfluorosafe dan dihomogenkan

5. Larutan agarose dituang ke dalam cetakan, tunggu sampai padat ± 30 menit Running Gel Elektroforesis :

1. Tray/bak elektroforesis disiapkan, diisi dengan buffer TBE 0,5 X 300 ml. 2. Cetakan gel yang sudah kering dimasukkan ke dalam tray, pastikan terendam

dalam buffer.

3. Loading buffer disiapkan dalam parafin dan campurkan dengan sampel. 4. Sampel dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis.

5. Alat elektroforesis dijalankan dengan menghubungkannya dengan power supply.

Pengukuran Konsentrasi DNA :

1. 4,0 µl diencerkan menjadi 400 µl dengan aquabidest (pengenceran 1000 X). 2. Aquabidest digunakan sebagai blanko.

3. Absorban diukur pada panjang gelombang 230, 2600, dan 280 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

ditambahkan 0,1 gram PVP dan 6 ml CTAB sedikit demi sedikit. Penambahan PVP pada proses isolasi DNA tumbuhan ini berfungsi untuk mencegah oksidasi fenol karena fenol dapat mengganggu proses isolasi DNA. Penambahan CTAB berfungsi untuk mencegah bekerjanya

enzim-dibiarkan dingin pada suhu kamar, kemudian ditambahkan 6 ml larutan Chloroform:Isamilalkohol(CI) lalu dihomogenkan(dikocok bolak balik selama 5 menit). Penambahan larutan CI berfungsi untuk mendeproteinisasi lemak dan protein yang mungkin masih terikat dengan DNA, agar DNA terpisah dari molekul lain serta menghilangkan kompleks CTAB. Kemudian ekstrak daun melinjo, glodogan, gaharu, sirsak, telang, dan mangga disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3.500 rpm. Lapisan atas hasil sentrifugasi dimasukkan ke dalam tabung yang baru, kemudian ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 1 volume cairan. Penambahan isopropanol berfungsi untuk mempresipitasi DNA pada fase aquoeus (DNA menjadi fiber), menghilangkan residu kloroform oleh tahap ekstraksi, mengganti fungsi ethanol absolute yang digunakan, dan memisahkan DNA dan RNA dengan cara presipitasi RNA. Langkah selanjutnya yaitu mengocok perlahan larutan yang telah diberi isopropanol hingga homogen kemudian menyimpan larutan pada suhu 4o_C

selama 30 menit, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 3.500 rpm selama 15 menit. Pada proses sentrifugasi ini berfungsi untuk memisahkan cairan dengan pelet DNA. Cairan yang dihasilkan dibuang dengan menggunakan pipet mikro, kemudian pellet DNA dicuci dengan cara menambahkan 2 ml ethanol 70% (lewat tabung) dan disentrifugasi dengan kecepatan 3.500 rpm selama 10 menit. Setelah dihasilkan cairan dan pellet DNA, cairan dibuang dengan menggunakan mikropipet dan pellet dikeringkan dengan cara disimpan pada suhu 37o_{C selama 15 menit. Dihasilkan DNA yang}

beku, lalu pelet DNA dilarutkan dalam 1 ml aquades steril.

Pada proses elektroforesis, langkah pertama ialah pembuatan gel agarose yang dilakukan dengan menimbang 0,3 gram agarose dan memasukkannya ke dalam 100 ml erlemeyer. Kemudian menambahkan 25 ml TBE 0,5 X dan memanaskan dalam mikrowave, lalu diangkat dan dibiarkan hingga suhu kurang lebih 70 o_{C. Selanjutnya menyiapkan}

TBE 0,5X. Selanjutnya memasukkan cetakan gel yang sudah kering kedalam bak dan pastikan terendam dalam buffer. Langkah selanjutnya adalah menyiapkan loading buffer dalam parafilem dan mencampurkan dengan sampel DNA tumbuhan. Memasukkan sample kedalam sumur-sumur elektroforesis dan menyambungkan alat elektroforesis dengan power supply.

Berdasarkan praktikum isolasi DNA sel ini dapat diketahui bahwa DNA tumbuhan berbentuk benang-benang, hal ini dapat diamati pada gambar berikut:

Pada praktikum

elektroforesis menunjukkan

adanya migrasi DNA dari

kutub negatif menuju kutub positif. Migrasi ini dikarenakan DNA yang bermuatan negatif. Akan tetapi terjadi perbedaan kecepatan migrasi pada sampel daun yang digunakan, hal ini disebabkan karena perbedaan ukuran DNA.

KESIMPULAN

Albert, B,et al. 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Utama

Ausubel, et al. (2003). Current protocols in Molecular Biology. United Kingdom:John Wiley & Sons Ltd Baig M.M.V., Big M.L.B., Yasmaen M. (2004). Saccharification of banana agrowaste by cellulolytic enzymes. Afr J. Biotechnol. 3, hlm. 447-450.

Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. San Diego: Academic Press Inc.

Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. San Diego: Academic Press Inc.

Columbus.

Donata. 2007. Komunikasi pribadi. Ciri-ciri DNA murni dan penyebab keberhasilan serta kegagalan dalam PCR dan elektroforesis.Erlangga. Jakarta.

Elrod, S, Stansfield, W. 2007. Genetika Edisi Keempat. Jakarta : Erlangga

Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. New York: Brooks/Cole

Farrel, R.E. 2004. RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization. Third Edition. Elsevier Academis Press. London. Hal. 693-705.

Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry.

Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).

Khanuja, S., et., al. 1999. Rapid Isolation of DNA from Dry and Fresh Samples of Plants Producing Large Amounts of Secondary Metabolites and Essential Oils. Plant Molecular Biology Reporter 17: 1–7, 1999

Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4th ed. Ohio: Merrill Publishing Co

Muladno. (2002). Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pusataka Wirausaha Muda. Bogor

Prana, T. K., dan N. S. Hartati. (2003). Identifikasi Sidik Jari DNA Talas (Colocasia esculenta L. Schott) Indonesia dengan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) : Skrining Primer dan Optimalisasi Kondisi PCR. Jurnal Natur Indonesia 5(2): 107-112 (2003). (Diakses tanggal 8 Desember 2009)

Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. New York: Harper Collins College Publishers.

Sujadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius.

Surzycki, S. 1936. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.