• Tidak ada hasil yang ditemukan

BAHAN DAN METODE. Tempat dan Waktu Penelitian. Metode Penelitian

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Membagikan "BAHAN DAN METODE. Tempat dan Waktu Penelitian. Metode Penelitian"

Copied!
9
0
0

Teks penuh

(1)

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian

Pengambilan sampel dilakukan pada 3 lokasi yang berbeda, yaitu: Dusun Sidomukti, Desa Kopeng, Kecamatan Getasan, Kabupaten Semarang pada ketinggian 1200-1400 m dpl (07˚23′26″ S, 110˚24′42″ E dan 07˚24′16″ S, 110˚22′19″ E); dan Dusun Deles, Desa Jogonayan, Kecamatan Ngablak, Kabupaten Magelang pada ketinggian 1400-1600 m dpl (07˚24′ 34″ S, 110˚24′ 37″ E dan 07˚23′47″ S, 110˚24′53″E) dan >1600 m dpl ( 07˚25″ S dan 110˚24′50″ E). Identifikasi spesies Meloidogyne spp. dilakukan di Laboratorium Nematologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari bulan April hingga November 2012.

Metode Penelitian

Penelitian dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu: survei dan pendataan, identifikasi gejala penyakit di lapangan, identifikasi spesies Meloidogyne spp. berdasarkan morfologi sidik pantat dan teknik Polymerace Chain Reaction (PCR), dan analisis distribusi spesies Meloidogyne spp.

Survei dan Pendataan

Survei

Survei dilakukan secara acak di beberapa lahan pertanaman wortel milik petani di daerah sentra pertanaman wortel di Kabupaten Semarang dan Magelang. Lokasi penelitian tersebut dipilih dikarenakan kedua daerah tersebut merupakan sentra pertanaman wortel di Jawa Tengah dan belum adanya penelitian yang sama

(2)

di daerah tersebut. Survei lokasi berdasarkan keberadaan tanaman, gejala penyakit, dan ketinggian tempat. Berdasarkan hasil survei dilakukan pengambilan sampel di 3 lokasi yang berbeda, yaitu: lokasi 1 di Dusun Sidomukti, Desa Kopeng, Kecamatan Getasan, Kabupaten Semarang pada ketinggian 1200-1400 m dpl; lokasi 2 dan 3 di Dusun Deles, Desa Jogonayan, Kecamatan Ngablak, Kabupaten Magelang dengan ketinggian 1400-1600 m dpl dan >1600 m dpl. Metode pengambilan sampel tanaman/tanah yang digunakan adalah pola zig-zag, diagonal, dan tidak menutup kemungkinan menggunakan metode lain sesuai dengan kondisi di lapangan (Barker & Campbell 1981). Sampel yang diambil berupa umbi wortel yang sakit dan tanah dari setiap lokasi . Sampel wortel yang sakit sebagai bahan untuk mengetahui keberadaan nematoda dalam jaringan atau bagian dari umbi yang sakit tersebut. Sampel tanah diukur tingkat pH atau derajat keasaman tanah dan diidentifikasi jenis tanahnya. Sampel dibawa dalam keadaan lembab, sampel tanah dan umbi wortel dimasukkan ke dalam kantong plastik secara terpisah. Bagian atas tumbuhan biasanya lebih cepat membusuk sehingga harus ditempatkan di dalam kantong khusus jika ingin disimpan dalam beberapa hari (Trigiano et al. 2004).

Pendataan

Pendataan dilakukan untuk mengetahui informasi mengenai keadaan atau kondisi tanaman di lapangan. Pendataan yang dilakukan meliputi wilayah lahan, ketinggian tempat, luas kebun, varietas wortel yang ditanam, produksi, kehilangan hasil, jumlah dan tipe puru, keberadaan wortel bercabang, adanya hairy root, teknik pengolahan tanah, intensitas dan asal irigasi, jenis tanah, dosis pupuk kandang, penggunaan pupuk kimia dan nematisida. Hasil pendataan digunakan untuk mengidentifikasi faktor-faktor yang menyebabkan terjadinya infeksi, keragaman gejala yang muncul, populasi, dan distribusi setiap spesies

(3)

Pengambilan Sampel Wortel Sakit

Penentuan lokasi untuk pengambilan sampel dilakukan berdasarkan keberadaan tanaman, gejala penyakit, dan ketinggian tempat. Metode pengambilan sampel yang digunakan adalah pola zig-zag, diagonal, dan metode lain sesuai dengan kondisi di lapangan (Barker & Campbell 1981). Sampel yang diambil berupa umbi wortel yang sakit dan tanah dari setiap lokasi pengambilan sampel. Sampel dimasukkan ke dalam kantong plastik dan ditata dalam cooling

box.

Penghitungan Tingkat Kejadian Penyakit oleh Meloidogyne spp.

Penghitungan persentase kejadian penyakit dilakukan saat sedang melakukan panen wortel. Hal tersebut memudahkan dalam melihat gejala dan menentukan jumlah sampel yang diamati. Sampel wortel sakit yang digunakan sebanyak 100 umbi. Pengambilan sampel dari setiap guludan secara acak sistematis. Perhitungan kejadian penyakit menggunakan rumus sebagi berikut:

Kejadian penyakit (%) : Σ

Σ x 100%

Identifikasi Spesies NPA Berdasarkan Morfologi Sidik Pantat

Nematoda di dalam jaringan tumbuhan dapat dicat setempat atau dipisahkan dari jaringan. Nematoda yang telah dipisahkan dari jaringan tumbuhan dan tanah harus segera dipersiapkan untuk diamati dengan mikroskop stereo. Nematoda mempunyai kandungan air yang tinggi di dalam jaringan tubuhnya, sehingga dibutuhkan metode khusus untuk membuat preparat permanen. Nematoda cenderung mengkerut dan distorsi, untuk tidak demikian maka secara bertahap air harus diganti dengan gliserin (Dropkin 1989). Pembuatan sidik pantat dapat disiapkan dari bahan akar yang telah disimpan dalam beberapa minggu di lemari

(4)

es. Pembu Hartman &

uatan prepar & Sasser (19

rat sidik pan 985) (gamb

ntat berdasa bar 4).

arkan metodde yang telaah dilakukann oleh

Gambar 4 Nem tersebut d tunggal ak Jaringan a jarum bed leher betin hingga isi dalam caw melekat p dipotong bagian dep Bag obyek. B 4 Teknik p Meloidog matoda betin diletakkan d kan lebih m akar yang m dah untuk m na nematod i tubuhnya wan petri. A pada kulit s dengan pis pan dan bag ian pantat Bagian sam pembuatan gyne spp. (S na dewasa dalam cawa mudah dari menutupi n mengeluarka da dipotong keluar. Bag Asam laktat setelah dike sau bedah. gian pantat n nematoda mping dari preparat pe umber: Saa diambil da an sirakus y pada puru ematoda be an nematoda g dan tubuh gian tubuh t membantu eluarkan isi Pisau beda nematoda d ditempatkan pantat nem ermanen sid avendra et a ari puru pad

yang telah yang bany etina disobe a betina dew betina nem yang tersis u menghilan tubuhnya. ah harus da diangkat dar n pada tem matoda yan dik pantat n al. 1997 ) nematoda bbetina da jaringan diisi sediki yak isi nem ek dengan p wasa. Kutik matoda ditek sa ditetesi a ngkan isi tu Bagian pe alam keada ri tetesan as atau akar. it air. Puru atoda betin pisau bedah kula pada b kan dengan asam laktat ubuh yang m ertengahan t aan tajam. am laktat. Puru yang nanya. h dan bagian n kuat 45% masih tubuh Kulit mpat yang ng terlalu datar atau lebar dipo gelas otong

(5)

keseluruhan hingga menyisakan bagian sidik pantatnya. Sidik pantat di pindahkan ke gelas obyek yang telah ditetesi dengan gliserin. Bagian muka sidik pantat diarahkan menghadap ke atas. Gelas obyek ditutup dengan cover glass secara perlahan. Gliserin sebaiknya ditetesi dengan tetesan yang sedikit saja. Gliserin yang terlalu banyak dapat diserap dengan kertas penyerap. Bagian sisi cover glass ditutup dengan perekat dan preparat diberi label. Preparat permanen sidik pantat nematoda dilihat dibawah mikroskop stereo untuk diamati ciri morfologinya untuk menetukan spesies nematoda. Spesies Meloidogyne spp. ditentukan berdasarkan kunci identifikasi yang telah dibuat oleh Eisenback et al. (1981).

Identifikasi Spesies Meloidogyne spp. dengan Teknik PCR

Ekstraksi DNA Nematoda Betina

Nematoda betina sebanyak 10-20 ekor dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml. Buffer ekstrak (200 mM Tris HCl pH 8.5, 250 mM Na Cl, 25 mM EDTA pH 8.0 dan 0.5% SDS) sebanyak 150 µl ditambahkan ke dalam tabung dan nematoda digerus sampai halus dengan menggunakan “cornical grinder steril”. Larutan C:I = 24:1 sebanyak 150 µl ditambahkan ke dalam tabung, kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 11000 rpm. Hasil sentrifugasi akan terbentuk endapan dan supernatan, supernatan diambil sebanyak 100 µl dan dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru. Larutan sodium asetat (CH3COONa 3M: pH 5.2) sebanyak 0.5 volume (50 µl) ditambahkan ke dalam tabung dan disimpan dalam suhu -20˚C selama 10 menit. Suspensi disentrifugasi selama 20 menit pada kecepatan 12000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil sebanyak 100 µl dan dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru. Sebanyak 1 volume (100 µl) isopropanol ditambahkan ke dalam tabung (larutan dibolak-balik hingga homogen) dan disimpan dalam suhu ruang selama 30 menit. Suspensi disentrifugasi selama 20 menit pada kecepatan 12000 rpm. Cairan isopropanol atau suspensi di dalam tabung dibuang dan ditambahkan 1 volume (100 µl) ethanol 80%. Suspensi disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 12000 rpm.

(6)

Cairan ethanol dibuang dan endapan dikeringkan. Buffer TE pH 8 ditambahkan pada tabung mikro sebanyak 30-100 µl sesuai ketebalan endapan DNA. DNA disimpan pada suhu -20˚C hingga digunakan.

Amplifikasi DNA Nematoda

Amplifikasi DNA menggunakan mesin Thermo Cycle PCR. Primer yang digunakan dalam amplifikasi DNA berbeda untuk setiap spesies. M. incognita, M.

javanica, dan M. arenaria menggunakan primer spesifik. M. hapla, M. chitwoodi,

dan M. fallax menggunakan primer multipleks (tabel 2).

Tabel 2 Primer yang digunakan untuk mendiagnosa keberadaan spesies

Meloidogyne spp. pada deteksi dengan PCR

Spesies NPA Tipe primer

Sequence 5’-3’ Fragmen

DNA (bp)

Sumber

M. incognita Spesifik MI-F 5’- GTG AGG ATT

CAG TCT CCC AG-3’ MI-R 5’- ACG AGG AAC ATA CTT CTC CGT CC-3’

1000 Meng et al.

2004

M. arenaria Spesifik Far 5’-TCG GCG ATA

GAG GTA AAT GAC-3’ Rar 5’-TCG GCG ATA GAC ACT ACA ACT-3’

420 Zijlstra et al.

2000

M. javanica Spesifik Fjav 5′-GGT GCG CGA

TTG AAC TGA GC-3′ Rjav 5′-CAG GCC CTT CAG TGG AAC TAT AC-3′

720 Zijlstra et al.

2000

(7)

Spesies NPA Tipe primer Sequence 5’-3’ Fragmen DNA (bp) Sumber M. hapla M. chitwoodi M. fallax Multipleks JMV 1 F 5’-GGA TGG CGT GCT TTC AAC-3’ JMV hapla R 5’- AAA AAT CCC CTC GAA AAA TCC ACC-3’ JMV 1 F 5’-GGA TGG CGT GCT TTC AAC-3’ JMV 2 R 5’-TTT CCC CTT ATG ATG TTT ACC C-3’ 440 540 670 Wishart et al. 2002

PCR reagen yang digunakan terdiri dari ddH2O, Taq buffer 10x Mg2+, sukrosa, dNTP, primer F (forward), primer R (reverse), dan Taq DNA

polymerase. Komposisi bahan yang dibuat untuk 18 kali kali reaksi yaitu untuk

masing-masing spesies Meloidogyne yang akan dideteksi (M. incognita, M.

javanica, M. arenaria, M. hapla, M. chitwoodi, dan M. fallax). Keenam spesies

tersebut akan dideteksi pada ketiga sampel nematoda betina yang diperoleh dari ketiga lokasi ketinggian pengambilan sampel yang berbeda. Komposisi bahan dibuat untuk mendeteksi enam spesies dari masing-masing lokasi ketinggian, sehingga dibutuhkan 12 komposisi reaksi. M. incognita, M. javanica, M. arenaria dideteksi dengan menggunakan primer spesifik untuk setiap spesies Meloidogyne spp. M. hapla, M. chitwoodi, M. fallax dideteksi dengan menggunakan primer multipleks. Primer ini dapat sekaligus mendeteksi ketiga spesies tersebut. Komposisi PCR reagen yang digunakan ditunjukkan pada tabel 3.

(8)

Tabel 3 Komposisi bahan PCR reagen yang digunakan

Bahan 1 kali reaksi (µl) 12 kali reaksi (µl)

ddH2O 16.25 195 Taqbuffer 10x Mg2+ 2.5 30 Sukrosa 2.5 30 dNTP 0.5 6 Primer F 1 12 Primer R 1 12

Taq DNA polymerase 0.25 3

DNA nematoda 1 12

Total 25 300

Mesin PCR (thermo cycle) diprogram sesuai dengan primer yang digunakan dan spesies yang akan dideteksi. Amplifikasi DNA melalui lima tahapan yaitu denaturasi, annealing, extension/elongation, final elongation, final hold. Proses denaturasi, extension/elongation, final elongation, final hold pada proses thermo

cycle setiap spesies umumnya sama, yang berbeda yaitu pada proses annealing.

Proses amplifikasi DNA spesies M. incognita, yaitu proses denaturasi pada suhu 94˚C selama 4 menit, annealing 57˚C selama 45 detik, extension/elongation pada suhu 72˚C selama 1.30 menit, siklus tersebut diulang sebanyak 45 kali. Setelah 45 siklus dilanjutkan proses final elongation pada suhu 72˚C selama 7 menit dan proses final hold pada suhu 4˚C.

Perbedaan proses annealing pada setiap spesies dikarenakan perbedaan

primer yang digunakan pada deteksi setiap spesies. Proses penempelan “annealing” setiap primer pada cetakan memerlukan suhu yang berbeda pada setiap prosesnya. Proses annealing M. javanica membutuhkan suhu 55 ˚C selama 45 detik, M. arenaria 56˚C selama 45 detik, dan M. hapla 50˚C selama 30 detik.

(9)

Elektroforesis DNA Nematoda Betina

Proses elektroforesis memerlukan empat komponen yaitu, 1) buffer, 2) zat padat atau medium “gel”. 3) arus listrik, ) dan 4) cara untuk memvisualisasikan molekul pada medium setelah elektroforesis. TAE dan TBE adalah buffer standar yang cukup membuffer daya untuk banyak aplikasi. Gel agarose murni dari agar dan digunakan biasanya pada konsentrasi 1% sampai 3%. Gel agarose digunakan untuk memisahkan asam nukleat (DNA dan RNA) dan kelas lain dari molekul, tetapi umumnya bukan untuk protein. Gel agarose dilelehkan dengan pemanasan di dalam microwave atau sumber lain, dan kemudian dituangkan secara horisontal atau dalam papan cetakan. Proses elektroforesis memerlukan muatan kutub (kutub positif dan negatif) untuk menggerakan sampel melalui gel, sehingga arus DC dibutuhkan sebagai tenaga elektromotor yang mendorong beban partikel negatif melalui gel menuju kutub negatif. Tegangan yang digunakan diantaranya 50 dan 300 V, walaupun tegangan 100 V juga digunakan dalam banyak aplikasi. Molekul DNA yang dipisahkan dalam gel agarose mudah divisualisasikan melalui pewarnaan zat warna yang berpengaruh seperti methylene blue atau melalui pewarnaan fluorescent seperti ethidium bromide (Trigiano et al. 2008).

DNA nematoda hasil amplifikasi dianalisis untuk melihat visualisasi DNA melalui proses elektroforesis. Bahan yang digunakan yaitu gel agarose 1% sebanyak 25 g yang dilarutkan di dalam larutan buffer TBE (Tris-HCl 45 mM, asam borat 45 mM, EDTA 1 mM). Larutan gel agarose dipanaskan pada

microwafe selama 2 kali 1 menit, kemudian didinginkan. Larutan gel agarose

yang telah dingin ditambahkan EtBr 0.7 µl, kemudian dituangkan ke dalam wadah cetakan dan dibiarkan hingga mengeras. Pengukuran DNA menggunkan penanda 100 bp ladder. Setiap sampel DNA disiapkan sebanyak 10 µl dan dimasukan ke dalam sumuran yang telah terbentuk pada gel agarose dengan mikro pipet. Elektroforesis dilakukan menggunakan tegangan 50 V DC selama 60 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan transluminator UV dan direkam dengan kamera.

Gambar

Gambar  4 Nem tersebut  d tunggal ak Jaringan  a jarum bed leher betin hingga isi dalam caw melekat  p dipotong  bagian dep Bag obyek
Tabel 2  Primer yang digunakan untuk mendiagnosa keberadaan spesies  Meloidogyne spp. pada deteksi dengan PCR
Tabel 3  Komposisi bahan PCR reagen yang digunakan

Referensi

Dokumen terkait

Kecamatan Kepadatan Penduduk (Jiwa/KM 2 ) Sawah ke Industri Sawah ke Kebun Sawah ke Padang Sawah ke Perairan darat Sawah ke Permukiman Sawah ke Tegalan/L adang Jumlah (Ha)

Arah Kebijakan Pembangunan Flores Timur adalah meningkatkan akses dan pelayanan pendidikan bermutu, meningkatkan upaya revitalisasi nilai- nilai budaya Lamaholot dan

ditindaklanjuti Ruang Rapat Biro Organisasi Setda Provinsi Jawa Tengah, Gedung A Lantai 9 LS : SEKDA Prov... Gajah

Gejala serangan Xcv (Xanthomonas campetris vesicatoris)pada daun berupa bercak-bercak coklat; bercak menyatu menjadi lebih besar dengan warna pinggiran berwarna jerami (Black et

Pandangan terhadap revolusi yang digambarkan oleh Orwell dalam novel ini merupakan suatu yang pesimistik, karena menurutnya sebuah revolusi yang dilakukan dengan cara

Kapal sebagai mode transportasi bagi rakyat Indonesia yang terdiri dari pulau-pulau, menjadikan kapal sebagai pilihan yang wajib untuk bepergian guna memenuhi kebutuhan sehari-hari

Lalu teknik cetak offset ini kerap digunakan untuk produksi masal karena lebih cepat dan murah, dan menggunakan kertas art paper 260gsm, karena kertas berbahan

CBC (Cipher Block Chaining) sebagai salah satu metode dasar kriptografi modern yang bekerja dalam block telah banyak dikaji untuk meningkatkan kemanan data. Penggunaan