IMOBILISASI SEL Lactobacillus plantarum PADA MEMBRAN
ZEOLIT/KAPPA-KARAGINAN UNTUK MENINGKATKAN
STABILITAS BIOSENSOR ASAM URAT
WAHYUNING LESTARI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Imobilisasi Sel
Lactobacillus plantarum pada Zeolit/Kappa-Karaginan untuk Meningkatkan
Stabilitas Biosensor Asam Urat adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, April 2016
Wahyuning Lestari
RINGKASAN
WAHYUNING LESTARI. Imobilisasi Sel Lactobacillus plantarum pada
Membran Zeolit/Kappa-Karaginan untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI, NOVIK NURHIDAYAT, dan ZAENAL ABIDIN.
Kadar asam urat di dalam tubuh perlu di ukur secara akurat dan cepat agar penyakit asam urat dapat dideteksi sejak dini sehingga tidak menimbulkan berbagai macam komplikasi penyakit. Pengukuran kadar asam urat secara klinis dilakukan dengan memeriksa sampel darah di laboratorium dengan metode spektrofotometri. Metode spektrofotometri memiliki kelemahan sehingga diperlukan suatu alat pendeteksi alternatif pengganti metode konvesional salah satunya adalah biosensor. Biosensor asam urat berbasis enzim urikase telah banyak dikembangkan akan tetapi, proses pemurnian enzim tergolong rumit serta mahal sehingga diperlukan sumber urikase lain diantaranya menggunakan sel
Lactobacillus plantarum yang lebih mudah penanganannya dan murah. Masalah
yang timbul pada biosensor adalah kestabilan,
Kestabilan biosensor asam urat erat kaitannya dengan metode imobilisasi yang digunakan untuk menjaga kelangsungan hidup bioreseptor sehingga waktu hidup dan aktivitas bioreseptor tetap terjaga. Adsorpsi merupakan metode imobilisasi sel yang paling sederhana. Namun, interaksi yang terjadi antara mikroorganisme dengan material pengimobilisasi pada proses adsorpsi merupakan ikatan yang lemah sehingga dengan mudah mikroorganisme yang terimobilisasi akan lepas dan secara langsung berdampak pada stabilitas biosensor. Metode lain yang dapat digunakan untuk imobilisasi mikroorganisme adalah entrapment atau
penjeratan. Metode mampu menjaga stabilitas bioreseptor dengan baik. Tujuan penelitian ini adalah meningkatkan stabilitas biosensor asam urat dengan mengimobilisasi L.plantarum pada membran zeolit/kappa-karaginan.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa nilai konstanta Michaeles-Menten (KM) dan Vmax pada penelitian ini berturut-turut 2.86 mM dan 0.0018 mA
Linearitas pengukuran 2-2.6 mM dengan nilai r2 = 0.9959. Limit deteksi dan limit kuantitas berturut-turut 0.478 mM dan 1.598 mM. Stabilitas biosensor asam urat adalah 23 hari dengan aktivitas sebesar 80.43%. Imobilisasi sel L.plantarum pada
membran zeolit/kappa-karaginan mampu meningkatkan kinerja biosensor asam urat.
Kata kunci: biosensor asam urat, Lactobacillus plantarum, zeolit,
SUMMARY
WAHYUNING LESTARI. Immobilization of Lactobacillus plantarum Cell on
Zeolite/Kappa-Carrageenan Membrane to Increase Uric Acid Biosensor Stability. Supervised by DYAH ISWANTINI, NOVIK NURHIDAYAT, and ZAENAL ABIDIN.
Levels of uric acid in the body need to be measured accurately and quickly to detect gout disease early. Measurement of uric acid levels is clinically done by examining a blood sample in a laboratory with spectrophotometric method. Spectrophotometric method has the disadvantage that needed alternative detector conventional methods one of which is a biosensor. Uric acid enzyme-based biosensors have been developed. However, the enzyme purification process is complex and expensive so we need other sources such uricase of Lactobacillus
plantarum cells are easier to handle and inexpensive. Although this biosensor is
known for its instability.
The stability of uric acid biosensor is closely related to immobilization method used to maintain the viability of bioreseptor so bioreseptor life time and activity is maintained. Adsorption is a cell immobilization method is the simplest. However, interaction between microorganisms with immobilization material. The adsorption process is weak bonds so easily immobilized microorganisms will be loose and have a direct impact on the stability of the biosensor. Another method that can be used for the immobilization of microorganisms is entrapment. This methods can maintain stability of bioreseptor. The purpose of this research is to improve the stability of uric acid biosensor by immobilized L.plantarum on
zeolite/ kappa-carrageenan membrane.
The results of this study indicate that the Michaeles-Menten constant (KM) and Vmax in this study successively 2.86 mM and 0.0018 mA. Linearity measurements at 2-2.6 mM with R2 = 0.9959. Limit of detection and limit of quantity respectively 0,478 mM and 1.598 mM. The stability of uric acid biosensor is 23 days with the activity of 80.43%. L.plantarum cell immobilized on
zeolite/ kappa-carrageenan membrane is able to improve the performance of the uric acid biosensor.
Keywords: uric acid biosensor, Lactobacillus plantarum, zeolite,
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
IMOBILISASI SEL Lactobacillus plantarum PADA MEMBRAN
ZEOLIT/KAPPA-KARAGINAN UNTUK MENINGKATKAN
STABILITAS BIOSENSOR ASAM URAT
WAHYUNING LESTARI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Penelitian : Imobilisasi Sel Lactobacillus Plantarum pada Membran
Zeolit/Kappa-Karaginan untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat
Nama : Wahyuning Lestari
NRP : G451130211
Disetujui oleh, Komisi Pembimbing
Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MSc. Agr Ketua
Tanggal Ujian: 5 April 2016 Tanggal Lulus: Dr Novik Nurhidayat
Anggota Dr Zaenal Abidin Anggota
Diketahui oleh
Ketua program studi Kimia
Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MSc. Agr
Dekan Sekolah Pascasarjana
Judul Penelitian Imobilisasi Sel Lactobacillus Plantarum pada Membran
Zeolit/Kappa-Karaginan untuk Meningkatkan Stabilitas Biosensor Asam Urat
Nama • Wahyuning Lestari
NRP
Disetujui oleh, Komisi Pembimbing
Prof Dr Dvah Iswantini Pradono. MSc. Agr Ketua
Dr No ik Nu Ida at Dr Zaenal Abidin
ggot Anggota
Diketahui oleh
Ketua program studi Kimia asarjana
4
Prof Dr Dyah Isw Pradono, MSc. Agr Dr Ir Dahrul Syah, MSc. Agr
Tanggal Ujian: 5 April 2016 Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2014 sampai September 2015 ini ialah biosensor asam urat, dengan judul Imobilisasi Sel Lactobacillus
plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan untuk Meningkatkan Stabilitas
Biosensor Asam Urat.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof Dr Dyah Iswantini Pradono MSc. Agr, Bapak Dr Novik Nurhidayat dan Bapak Dr Zaenal Abidin selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Acun Samsuri dan Mbak Lusianawati dari Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang telah membantu saya untuk menumbuhkan bakteri. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada bapak, ibu, teman-teman S2 Kimia angkatan 2013 serta seluruh keluarga atas doa dan dukungannya.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI) atas dana pendidikan yang telah diberikan kepada penulis melalui Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPPDN). Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, April 2016
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI viii
DAFTAR GAMBAR x
DAFTAR LAMPIRAN x
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Rumusan Masalah 3
Tujuan Penelitian 4
Hipotesis 4
Manfaat penelitian 4
2 METODE PENELITIAN 4
Waktu dan Tempat Penelitian 4
Bahan dan Alat 4
Lingkup Kerja 5
Aktivasi Zeolit 5
Prosedur Pengujian Nilai KTK Zeolit 5
Pembuatan Elektroda Pasta Karbon 6
Pembuatan Membran Zeolit/Kappa-Karaginan 6
Pembuatan Media GYP (Glucose Yeast Pepton) 6
Penumbuhan dan Pemanenan sel L. plantanum 6
Imobilisasi L. Plantanum Pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan 7
Pengukuran Elektrokimia 7
Optimasi Aktivitas Sel L. Plantarum yang Diimobilisasi pada Membran
Zeolit/Kappa-Karaginan 7
Penentuan Parameter Analitik 9
Penentuan Stabilitas Biosensor Asam Urat 9
3 HASIL DAN PEMBAHASAN 9
Aktivasi Zeolit 9
Pembuatan dan Pencirian Elektroda Pasta Karbon 11
Imobilisasi Sel L.plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan dan
Pengujian Aktivitas 12
Optimasi L. plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan 14
Analisis Parameter Kinetika Enzim Urikase dari Sel L.plantarum 16
Pengukuran Parameter Analitik Biosensor Asam Urat 17
Stabilitas Biosensor Asam Urat 18
4 SIMPULAN DAN SARAN 19
Simpulan 19
Saran 19
DAFTAR TABEL
Tabel 1 Kombinasi berat zeolit, konsentrasi karaginan, dan konsentrasi asam urat
untuk optimasi aktivitas sel L.plantarum 8
Tabel 2 Hasil uji nilai KTK zeolit alam Bayah 9
Tabel 3 Puncak arus dari aktivitas sel L.plantarum yang diimobilisasi pada
membran zeolit/kappa-karaginan dengan berbagai konsentrasi HCl 10 Tabel 4 Puncak arus oksidasi dari mediator K3[Fe(SCN)6],
2,3-dimetoksi-5-metil-1,4 benzoquinon (Q0) dan ferosena 11
Tabel 5 Hasil analisa pengaruh variabel terhadap arus 15
Tabel 6 Perkembangan Biosensor Asam Urat 19
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Voltamogram aktivitas sel L.plantarum yang diimobilisasi pada
membran dengan variasi konsentrasi HCl 10
Gambar 2 Voltamogram karakterisasi elektroda pasta karbon menggunakan
larutan K3[Fe(CN)6] 0.01 M 11
Gambar 3 Mekanisme pendeteksian biosensor asam urat 13 Gambar 4 Voltamogram sel L.plantarum yang terimobilisasi 14
Gambar 5 Kontur (a) pengaruh konsentrasi kappa-karaginan dan konsentrasi asam urat terhadap arus, (b) pengaruh berat zeolit dan konsentrasi asam urat terhadap arus, (c) pengaruh berat zeolit dan konsentrasi
kappa-karaginan terhadap arus 15
Gambar 6 Grafik hubungan 1/[S] dengan 1/I 16
Gambar 7 Linearitas biosensor asam urat 17
Gambar 8 Stabilitas biosensor asam urat 18
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Bagan Alir Penelitian 23
Lampiran 2 Hasil kombinasi Response Surface Methods 24
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Asam urat merupakan hasil akhir dari metabolisme purin pada sel tubuh. Asam urat berperan sebagai antioksidan apabila kadarnya di dalam darah tidak berlebih, namun apabila kadarnya berlebih asam urat akan berperan sebagai prooksidan. Kadar asam urat di dalam tubuh manusia dapat diketahui melalui pemeriksaan darah ataupun urin. Kadar asam urat normal pada laki-laki yaitu 3.6-8.2 mg/dL sedangkan pada perempuan yaitu 2.3-6.1 mg/dL. Kadar asam urat yang tidak normal akan berakibat munculnya berbagai macam penyakit antara lain hiperurisemia, gout, sindrom Lesch-Nyhan, dan gagal ginjal (Luo et al 2006).
Kadar asam urat di dalam tubuh perlu di ukur secara akurat dan cepat agar penyakit asam urat dapat dideteksi sejak dini sehingga tidak menimbulkan berbagai macam komplikasi penyakit. Pengukuran kadar asam urat secara klinis dilakukan dengan memeriksa sampel darah di laboratorium dengan metode spektrofotometri (Mateo et al. 2007).
Metode spektrofotometri memiliki kelemahan antara lain kurang spesifik, mahal, dan sangat peka terhadap cahaya untuk itu diperlukan suatu alat yang dapat mengatasi kelemahan tersebut. Biosensor merupakan alat pendeteksi alternatif pengganti metode konvensional karena memiliki banyak kelebihan yaitu sensitivitas tinggi, kecepatan waktu analisis, portabilitas dan efisiensi biaya. Biosensor asam urat berbasis enzim urikase telah banyak dikembangkan. Enzim urikase merupakan katalis oksidasi dari asam urat ketika berikatan dengan oksigen sebagai agen pengoksidasinya. Hasil inilah yang nantinya akan dideteksi oleh biosensor. Enzim urikase banyak ditemukan dari hewan vertebrata, namun enzim tersebut sulit diisolasi sehingga harga enzim urikase murni menjadi mahal, oleh sebab itu penggunaan mikroba yang dapat menghasilkan enzim tersebut digunakan sebagai solusi untuk menekan biaya (Attala et al. 2009). Mikroba
penghasil enzim urikase salah satunya adalah Lactobacillus plantarum yang
diketahui memiliki aktivitas yang baik terhadap asam urat, mudah diperoleh, memiliki ketahanan hidup yang tinggi, dan tidak sulit penanganannya (Rostini 2007).
Pengukuran aktivitas urikase dari protein L. plantarum pada berbagai
variasi suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat serta kestabilan telah dilakukan oleh Mardiah (2010) dengan metode spektrofotometri. Aktivitas dan kestabilan protein L. plantarum yang mengandung enzim urikase masih sangat
rendah. Kestabilan enzim urikase dari protein L. plantarum hanya bertahan
selama dua hari. Rendahnya aktivitas dan kestabilan tersebut dipengaruh oleh tidak adanya imobilisasi enzim. Enzim bebas bersifat tidak stabil untuk itu diperlukan suatu teknik imobilisasi enzim agar enzim mudah dikendalikan. Imobilisasi enzim merupakan suatu proses penahanan suatu enzim dalam suatu pori. Teknik yang digunakan untuk imobilisasi enzim bebas juga beragam antara lain entrapment, cross-linking, adsorpsi, enkapsulasi, ataupun penggabungan
antara beberapa teknik tersebut. Teknik yang digunakan tersebut bergantung pada material yang digunakan sebagai media pengimobilisasi (Elnashar et al. 2014).
2
adalah zeolit, selulosa, agar, karaginan, kitosan, polimer sintetik seperti polianilin dan polistirena (Bhatia et al. 2000).
Zeolit merupakan salah satu material yang dapat digunakan untuk media imobilisasi enzim. Zeolit memiliki struktur berpori yang dapat berfungsi sebagai adsorben ion maupun molekul. Molekul ataupun ion akan masuk ke dalam pori zeolit. Sifat inilah yang mendasari penggunaan zeolit sebagai media imobilisasi enzim (Xing et al. 2000). Terdapat dua jenis zeolit yaitu zeolit sintetik dan alam.
Zeolit sintetik memiliki nilai KTK diatas 100 cmol/kg, namun zeolit ini harganya mahal. Sedangkan, zeolit alam kelimpahannya sangat banyak dan harga relatif murah (Arif 2011).
Penelitian mengenai biosensor asam urat berbasis enzim dari sel
L. plantarum yang diimobilisasi pada zeolit alam telah dilaporkan oleh
Widyatmoko (2012) hasilnya stabilitas mampu bertahan selama 6 hari bila disimpan pada suhu 28ºC dan aktivitas urikase meningkat ketika enzim dari
L. plantarum diimobilisasi pada zeolit. Penelitian lain yang memanfaatkan zeolit
sebagai media pengimobilisasi telah dilakukan oleh Weniarti (2011) yang menggunakan zeolit sebagai media pengimobilisasi ekstrak enzim superoksida dismutase Deinococcus radiodurans yang digunakan untuk biosensor antioksidan
dan penelitian Liyonawati (2013) yang memanfaatkan zeolit alam sebagai media imobilisasi ekstrak Escherichia coli untuk biosensor antioksidan. Zeolit sebagai
media pengimobilisasi berinteraksi dengan bahan yang diimobilisasi melalui adsorpsi. Adsorpsi merupakan metode imobilisasi sel yang paling sederhana. Teknik ini didasarkan pada interaksi fisik antara mikroorganisme dengan permukaan material pengimobilisasi (Monsan et al. 1987, Krekeler et al. 1990).
Interaksi yang terjadi antara mikroorganisme dengan material pengimobilisasi merupakan ikatan yang lemah seperti gaya van der Walls, ikatan ionik, ikatan hidrogen maupun interaksi hidrofobik sehingga dengan mudah mikroorganisme yang terimobilisasi akan lepas dan secara langsung berdampak pada stabilitas biosensor yang dibuat (Hsu et al. 2004; Gorecka & Jastrzebska 2011). Metode
lain yang dapat digunakan untuk imobilisasi mikroorganisme adalah entrapment
atau penjeratan. Mikroorganisme akan dijerat di dalam suatu matrik sehingga akan tercipta suatu penghalang di sekitar ruang gerak mikroorganisme. Kombinasi antara metode imobilisasi penjeratan dengan adsoprsi fisik diharapkan mampu meningkatkan stabilitas dari biosensor asam urat yang akan dibuat. Matrik yang digunakan untuk menjerat mikroorganisme merupakan matrik berpori salah satunya adalah karaginan (Lopez et al. 1997; Ramakrishna & Prakasham 1999).
Karaginan adalah suatu hidrokoloid yang termasuk dalam senyawa polisakarida yang diekstrak dari alga merah. Terdapat berbagai jenis karaginan antara lain lambda, iota, dan kappa-karaginan. Kappa-karaginan merupakan jenis karaginan yang menghasilkan gel yang kuat. Struktur dari kappa-karaginan adalah D-galaktosa dan gugus 2-sulfat ester yang terdapat pada 3,6-anhidro-D-galaktosa. Kappa-karaginan akan berinteraksi dengan enzim melalui metode penjebakan
(entrapment). Kemampuan kappa-karaginan dalam membentuk gel inilah yang
dimanfaatkan untuk media imobilisasi. Kekuatan gel yang terbentuk dari kappa-karaginan menyebabkan enzim yang terjebak di dalamnya akan sulit untuk lepas. Dengan demikian diharapkan stabilitasnya akan lebih meningkat.
3
yang melakukan screening terhadap beberapa matrik untuk media imobilisasi
mikrobakteri. Hasil penelitian menyebutkan bahwa kappa-karaginan mempunyai kekuatan gel yang lebih tinggi dan aktivitas enzim yang tinggi dibanding polisakarida lain seperti alginat. Penelitian tersebut dilanjutkan oleh Tosa et al
(1979) yang melakukan imobilisasi enzim dan mikrobakteri pada matrik kappa-karaginan, hasilnya kappa-karaginan mampu meningkatkan aktivitas enzim
sebesar 69% dengan stabilitas mencapai 686 hari. Pada tahun 1991 Moon et al
melaporkan bahwa Bacillus firmus dapat diimobilisasi menggunakan
kappa-karaginan, Buyukgungor (1992) melaporkan bahwa Lactobacillus bulgaris yang
diimobilisasi pada gel kappa-karaginan mempunyai stabilitas yang tinggi dibanding dengan Ca-alginat, Cordoves et al (1993) menggunakan karaginan
untuk imobilisasi enzim horseradish peroksidase dan kolesterol oksidase yang diaplikasikan untuk biosensor kolesterol.
Penelitian lain dilakukan oleh Campanella et al (1999) yang menggunakan
kappa-karaginan untuk media imobilisasi enzim superoxidase dismutase yang diaplikasikan pada biosensor antioksidan, hasilnya stabilitas biosensor mampu
bertahan selama 30 hari. Elnashar et al (2014) melaporkan imobilisasi
β-galaktosidase menggunakan kappa-karaginan mampu meningkatkan aktivitas enzim sebesar 60% dan nilai KMyang dihasilkan 61.6 mM sedangkan enzim tanpa
imobilisasi menghasilkan nilai KM sebesar 22.9 mM. Rodriquez et al (2014) telah
mencoba memanfaatkan kappa-karaginan yang dikombinasikan dengan dadih untuk mengimobilisasi L. plantarum dengan hasil matriks yang dibentuk antara
kappa-karaginan/dadih memiliki ketahanan yang tinggi dan mempunyai viskoelastis yang tinggi sehingga L. plantarum terjerat kuat pada matrik tersebut.
Melihat keberhasilan kappa-karaginan sebagai media imobilisasi enzim maupun mikroorganisme, maka penelitian ini akan menggunakan kappa-karaginan yang akan dikombinasi dengan zeolit sebagai media imobilisasi L. plantarum dengan
harapan stabilitas dapat meningkat.
Rumusan Masalah
Dengan adanya latar belakang yang tersaji di atas dapat diambil suatu rumusan masalah yaitu stabilitas dan aktivitas biosensor asam urat berbasis mikroorganisme L. plantarum yang diimobilisasi dalam media zeolit alam masih
relatif rendah jika dibandingkan dengan media pengimobilisasi lain seperti gel kappa karaginan, sehingga diperlukan suatu media pengimobilisasi lain dan teknik imobilisasi yang berbeda yang nantinya dapat dikombinasikan dengan media zeolit. Jadi, permasalahannya adalah apakah imobilisasi L. plantarum pada
4
Tujuan Penelitian
1. Membuat zeolit-kappa karaginan sebagai media imobilisasi bakteri L. plantarum.
2. Menentukan parameter kinetik urikase sel L. plantarum yang diimobilasi
pada membran zeolit/kappa-karaginan, parameter analitik dan stabilitas biosensor asam urat.
Hipotesis
Media imobilisasi membran zeolit/kappa-karaginan mampu meningkatkan stabilitas dari L. plantarum.
Manfaat penelitian
Memberikan informasi mengenai stabilitas, parameter analitik, dan parameter kinetik L. plantarum yang diimobilisasi pada membran
zeolit/kappa-karaginan.
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan mulai bulan Oktober 2014 – September 2015 bertempat di Laboratorium Kimia Fisik dan Laboratorium Bersama Departemen Kimia FMIPA IPB, Laboratorium Ilmu Tanah Departemen Ilmu Tanah Fakultas Pertanian IPB, serta Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan Puslit Biologi LIPI Cibinong.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah bufer borat, sel L. plantarum Mar 8, NaCl
0,85 % (Himedia, India), grafit, minyak parafin, glukosa (Himedia, India), akuades, CH3COONa (Himedia, India), pepton (Himedia, India), larutan garam,
tween 80 (Applichem, Jerman), beef extract (Difco, USA), yeast extract
5
(Nacalaic tesque, Jepang), Kappa-karaginan, dan zeolit alam Bayah. Alat yang digunakan adalah eDAQ Potensiotat yang dilengkapi Echem v2.1.0 dengan sistem 3 elektroda, oven, tanur, inkubator, autoklaf (Hariyama), sentrifuga (Kokusann H-1500F), pH meter, spektrofotometer UV-Vis, pipet mikro, serta alat gelas lainnya.
Lingkup Kerja
Penelitian ini dimulai dengan aktivasi zeolit dan pengujian, pembuatan
media GYP (Glucose Yeast Pepton) sebagai media penanaman bakteri
L. plantarum, penumbuhan dan pemanenan bakteri L. plantarum, pembuatan
elektroda pasta karbon, imobilisasi L. plantanum pada membran, pengukuran
elektrokimia, optimasi, penentuan stabilitas biosensor, penetuan parameter analitik, dan penentuan kinetika enzim urikase dari bakteri L. plantarum.
Aktivasi Zeolit (Modifikasi Cordoves et al. 2008; Arif 2011)
Zeolit bayah berukuran 400 mesh sebanyak 50 g ditambahkan 250 mL HCl dengan konsentrasi masing-masing 0, 0.5, 1, dan 3 M dan diaduk selama 1 jam, didekantasi dan dicuci dengan akuades sampai pH netral. Larutan tersebut diuji kandungan klorin dengan AgNO3 dan dicuci kembali sampai tidak mengandung
klorin. Setelah pH netral dan bebas klorin dikeringkan pada suhu 300ºC selama 3 jam. Selanjunya zeolit ditentukan nilai KTK (Kapasitas Tukar Kation).
Prosedur Pengujian Nilai KTK Zeolit (SNI 13-3494-1994)
Penentuan pengujian KTK diawali dengan pencucian pasir silika dengan larutan HCl 0,1 N panas, kemudian dicuci dengan air distilasi sampai netral. Kolom penukar ion diisi dengan glass wool pada bagian bawah setinggi 2 cm dan
pasir silika pada bagian atas setinggi 0.2 cm. Larutan CH3COONH4 0.1 N
diteteskan pada pasir silika dan glass wool sampai ketinggian 1 cm, kemudian
serbuk zeolit sebanyak 0.2-0.3 g dimasukkan ke dalam kolom dan dinding kolom dibilas dengan larutan CH3COONH4 sampai ketinggian 5 cm. Kemudian Volume
hasil titrasi contoh dan blanko dicatat. Nilai KTK zeolit ditentukan dengan rumus:
��� � ⁄ � = � − � � �� �� �
Dimana:
V1 = volume NaOH yang dibutuhkan untuk titrasi sampel (mL)
V2 = volume NaOH yang dibutuhkan untuk titrasi blanko (mL)
6
Pembuatan Elektroda Pasta Karbon (Ikeda et al. 1998; Huang 2005)
Pembuatan pasta karbon diawali dengan pembuatan pasta karbon yang ditambahkan mediator didalamnya. Sebanyak 3 mg Q0 ditambahkan dengan 1 mL
DMSO, kemudian ditambahkan grafit sebanyak 100 mg. Campuran tersebut didiamkan selama 2 jam, kemudian dioven selama 2 jam dan ditambahkan parafin sebanyak 50 μL. Pasta karbon yang terbentuk siap digunakan untuk membuat eletroda dengan cara memasukkan pasta karbon ke dalam gelas kaca yang telah diberi kawat tembaga, selanjutnya permukaan elektroda pasta karbon tersebut dihaluskan dan dibersihkan dengan amplas dan kertas minyak. Elektroda yang telah siap dikarakterisasi menggunakan larutan KCl 0.1 M dan K3[Fe(CN)6]
0.01 M dalam larutan KCl 0.1 M.
Pembuatan Membran Zeolit/Kappa-Karaginan (Modifikasi Campanella et al. 1999)
Zeolit ditimbang sesuai dengan berat kemudian di larutkan dalam 10 mL akuades dengan cara di ultrasonikasi selama 10 menit. Kemudian ditambahkan karaginan sesuai dengan berat yang diperlukan dan diultrasonikasi kembali pada suhu 50°C-60°C selama 5 menit. Campuran yang berbentuk koloid tersebut kemudian dicetak di atas cetakan dengan diameter 10 cm. Kemudian membran di diamkan selama 5 jam, selanjutnya membran dipotong ukuran 3 mm. Membran kemudian didiamkan kembali pada suhu 4 °C.
Pembuatan Media GYP (Glucose Yeast Pepton) (Triana et al 2006)
Media GYP padat dibuat dengan mencampurkan 10 g glukosa, 10 g yeast
extract, 2 g beef extract, 5 g pepton, 1.4 g CH3COONa, 5 mL larutan garam (0.1
g MgSO4.7H2O, 0.1 g MnSO4.4H2O, 0.1 g FeSO4.7H2O, 0.1 g NaCl, 50 mL
akuades), 10 mL Tween 80, 20 g agar, dan 3.75 g CaCO3 dalam 1 liter akuades.
Selanjutnya, media dipanaskan dan disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada 121ºC. Media dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan membeku. Setelah dingin digunakan untuk menumbuhkan sel bakteri. Sedangkan media GYP cair dibuat sama dengan cara di atas tetapi tanpa penambahan agar dan CaCO3.
Penumbuhan dan Pemanenan sel L. plantanum
7
diinkubasi semalam hingga mencapai nilai OD600=1. Sebanyak 500 μL starter
diinokulasi kedalam 10 mL media GYP dan diinkubasi selama 3 jam. Sel bakteri tersebut dipanen dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 15 menit. Pelet yang terbentuk dicuci dengan akuades dan ditambahkan buffer borat pH 8.
Imobilisasi L. Plantanum Pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan (Modifikasi Campanella et al. 1999)
Membran direndam dalam 20 μL Lactobacillus plantarum yang
diresuspensi dengan buffer borat pH 8 selama 3 jam. Membran yang telah direndam kemudian diletakkan pada permukaan elektroda, dilapisi dengan dengan membran dialisis, dan diikat dengan O-Ring rubber. Apabila elektroda tidak
digunakan, elektroda direndam pada bufer borat pH 8 dan disimpan pada suhu 4°C.
Pengukuran Elektrokimia
Pengukuran elektrokimia dilakukan dengan metode voltametri siklik menggunakan eDAQ potensiostat (Ecorder 410) yang dilengkapi perangkat lunak Echem v2.1.0. Elektrode yang digunakan adalah elektrode Ag/AgCl, platina, dan pasta karbon yang berturut-turut sebagai elektrode pembanding, elektrode pembantu, dan elektrode kerja. Parameter pengukuran dibuat sebagai berikut:
Mode : Cyclic blanko. Setelah itu, ditambahkan 2 mL asam urat dan diukur kembali perubahan puncak arus anoda yang terjadi.
Optimasi Aktivitas Sel L. Plantarum yang Diimobilisasi pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan
Optimasi dilakukan untuk aktivitas urikase dari sel L.plantarum adalah
8
konsentrasi kappa-karaginan (1-3 %, w/v). Metode yang digunakan untuk pengoptimuman aktivitas urikase adalah Respon Surface Method. Metode ini
mengkombinasikan variabel bebas yang nantinya kombinasi tersebut digunakan untuk mendapatkan nilai aktivitas yang optimum. Kombinasi variabel bebas untuk optimasi aktivitas sel L.plantarum disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Kombinasi berat zeolit, konsentrasi karaginan, dan konsentrasi asam urat untuk optimasi aktivitas sel L.plantarum
No Berat zeolit (mg) Konsentrasi kappa-karaginan (%) Konsentrasi asam urat (mM)
1 30 2 1.55
Penentuan parameter kinetik enzim urikase yang berasal dari sel
Lactobacillus plantarum yang diimobilisasi ditentukan dengan menggunakan
persamaan Michealis-Menten, yaitu :
= �
��� [ ]
��+ [ ]
dengan ���� adalah respon arus maksimal yang terukur (apperent), �� adalah
9
Penentuan Parameter Analitik (Harmita 2004)
Penentuan parameter yang dilakukan pada percobaan ini antara lain linearitas, limit deteksi, dan limit kuantitas. Liniearitas ditentukan dengan melihat nilai koefisien korelasi. Limit deteksi dan limit kuantitas ditentukan dengan rumus:
� = .
Keterangan:
Q : LOD (Limit deteksi) atau LOQ (Limit Kuantitas) Sb : simpangan baku
k : 3 (LOD), k=10 (LOQ) b : kemiringan atau slope.
Penentuan Stabilitas Biosensor Asam Urat
Stabilitas diuji dengan melihat aktivitas relatifnya sampai terjadi penurunan stabilitas. Persen aktivitas urikase diukur dengan rumus:
� � � � = ℎ � � − �� �� %
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivasi Zeolit
Sampel yang diambil adalah zeolit alam dihaluskan hingga mencapai ukuran 400 mesh. Menurut Wennerstrum et al (2002), pengubahan ukuran sampel
dimaksudkan untuk meningkatkan luas permukaan bidang kontak, menghasilkan ukuran partikel yang sesuai untuk kegunaannya. Serbuk zeolit kemudian di aktivasi menggunakan metode kimia dengan penambahan HCl dengan konsentrasi bervariasi antara 0.5 M, 1M, dan 3 M. Zeolit teraktivasi kemudian dilakukan pengujian nilai KTK. Hasil uji nilai KTK dari beberapa sampel zeolit disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil uji nilai KTK zeolit alam Bayah
No Konsentrasi HCl (M) Nilai KTK (me/100g)
1 0 82.05
2 0.5 81.45
3 1 76.20
10
Pada penelitian ini digunakan zeolit dengan aktivasi HCl 0.5 M, hal ini dikarenakan zeolit tersebut memiliki nilai KTK tinggi meskipun nilai tersebut lebih rendah dibandingkan dengan nilai KTK zeolit tanpa aktivasi. Hal ini dikarenakan, perlakuan asam akan menurunkan nilai KTK namun disisi lain logam pengotor pada permukaan zeolit hilang sehingga kemurnian zeolit menjadi lebih tinggi. Zeolit yang teraktivasi dengan zeolit 0.5 M dipilih dibanding dengan zeolit teraktivasi lain karena nilai KTK yang lebih tinggi sehingga lebih bersifat hidrofilik dan daya adsorpsi lebih kuat sehingga cocok digunakan untuk media pengimobilisasi sel L.plantarum (Ozkan & Ulku, 2005).
Berdasarkan puncak arus yang dihasilkan, zeolit yang diaktivasi menggunakan HCl 0.5 M menunjukkan arus yang lebih tinggi dibanding dengan aktivasi menggunakan HCl dengan konsentrasi lain. Arus yang lebih tinggi menunjukkan bahwa aktivitas dari sel L.plantarum yang diimobilisasi pada
membran zeolit/kappa-karaginan tinggi. Tabel 3 dan Gambar 1 menunjukkan puncak arus dari aktivitas sel L.plantarum yang diimobilisasi pada membran
zeolit/kappa-karaginan dengan berbagai macam konsentrasi HCl yang digunakan untuk aktivasi zeolit.
Tabel 3 Puncak arus dari aktivitas sel L.plantarum yang diimobilisasi pada
membran zeolit/kappa-karaginan dengan berbagai konsentrasi HCl
No Konsentrasi HCl (M) I (mA)
1 0 0.0036
2 0.5 0.0126
3 1 0.0035
4 3 0.0061
Gambar 1 Voltamogram aktivitas sel L.plantarum yang diimobilisasi pada
membran dengan variasi konsentrasi HCl
11
Pembuatan dan Pencirian Elektroda Pasta Karbon
Elektroda pasta karbon difabrikasi dari serbuk grafit, Q0
(2,3-dimetoksi-5-metil-1,4-benzoquinon) sebagai mediator dan parafin sebagai agen pengikat dengan perbandingan antara grafit dan parafin adalah 2:1 (w/v). Q0 digunakan
sebagai mediator dikarenakan respon arus oksidasi yang dihasilkan Q0 paling
tinggi diantara mediator lain (Widyatmoko 2012). Mediator berperan dalam proses transfer elektron dari bioreseptor ke transduser sehingga arus yang dihasilkan menjadi lebih baik (Trivadila 2011). Hasil pengukuran respon arus oksidasi pada beberapa mediator ditunjukkan oleh Tabel 4.
Elektroda pasta karbon kemudian dikarakterisasi menggunakan larutan K3[Fe(CN)6] 0.01 M dalam larutan KCl 0.1 M. Pengukuran dilakukan
menggunakan metode voltametri siklik dengan rentang potensial 0-1000 mV sebanyak 5 siklik. Hasil karakterisasi ditunjukkan pada Gambar 2.
Tabel 4 Puncak arus oksidasi dari mediator K3[Fe(SCN)6],
2,3-dimetoksi-5-metil-1,4 benzoquinon (Q0) dan ferosena
Mediator Ipa(μA)
Q0 28,9267
Ferosena 5,3767
K3[Fe(SCN)6] 3,5700
(Widyatmoko 2012)
12
Voltamogram larutan blangko KCl 0.1 M tidak menunjukkan adanya puncak sedangkan voltamogram larutan K3[Fe(CN)6] 0.01 M menunjukkan
adanya puncak arus anodik dan pada tegangan sekitar 0.500 V dan puncak arus katodik pada tegangan sekitar 0.300 V. Puncak arus anodik dan katodik mengindikasikan bahwa elektroda tersebut mampu mengalirkan elektron dengan baik sehingga reaksi redoks dapat berlangsung.
Munculnya puncak anodik dan katodik terjadi karena di dalam sel elektrokimia terjadi reaksi redoks yang bersifat reversibel pada keadaan setimbang. Reaksi yang terjadi pada saat karakterisasi adalah:
Reaksi reduksi : [Fe(CN)6 ]3- + e →[Fe(CN)6 ]
4-Reaksi oksidasi : [Fe(CN)6 ]4-→[Fe(CN)6 ]3- + e
Penumbuhan dan Pemanenan Sel L. plantanum
Sel bakteri yang digunakan merupakan sel L.plantarum Mar 8 yang
merupakan bakteri yang menghasilkan enzim urikase dengan aktivitas yang lebih besar dari bakteri penghasil enzim urikase lain seperti Bacillus. Penelitian
mengenai bakteri penghasil enzim urikase telah dilakukan oleh Mardiah (2010) yang meneliti aktivitas urikase yang dihasilkan dari sel L.plantarum sedangkan
Nurjayati (2010) meneliti aktivitas urikase dari sel Bacillus. Hasilnya sel
L.plantarum memiliki aktivitas sebesar 0,0842-0,1073 U/mL sedangkan sel
Bacillus memiliki aktivitas sebesar 0,0322-0,0570 U/mL sehingga untuk
penelitian ini digunakan sel L.plantarum sebagai penghasil enzim urikase.
Imobilisasi Sel L.plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan dan Pengujian Aktivitas
Suatu sel atau mikroorganisme lain umumnya memilki sifat yang kurang stabil sehingga dibutuhkan suatu media yang berfungsi untuk menjaga agar sel tetap terjaga ketika diaplikasikan sebagai bioreseptor pada biosensor. Proses imobilisasi dapat dilakukan dengan berbagai teknik salah satunya adsorbsi menggunakan zeolit. Zeolit yang digunakan adalah zeolit jenis klinoptilolit yang memiliki luas permukaan 6.35 m2 dan jari-jari 16.23 Å (Ginting et al. 2007).
Jari-jari pori yang sangat kecil tersebut menyebabkan sel L.plantarum tidak mampu
masuk ke dalam pori, namun hanya teradsopsi pada permukaan zeolit.
Cara lain yang dapat ditempuh agar sel L.plantarum mampu teradsorpsi
13
Mekanisme pendeteksian biosensor asam urat menggunakan sel
L. plantarum yang telah diimobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan
ditunjukkan pada Gambar 3. Puncak arus yang keluar pada voltamogram terjadi karena adanya reaksi antara bioreseptor dengan substrat. Mula-mula sel L.
plantarum yang telah diimobilisasi pada membran zeolit/kapppa-karaginan akan
mensekresikan enzim urikase. Apabila ke dalam sel pengukuran ditambahkan dengan substrat dalam penelitian ini asam urat maka akan terjadi reaksi pemecahan cincin purin pada struktur asam urat sehingga akan diperoleh produk allantoin dan hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida tersebut yang akan mengalami reaksi redoks sehingga terjadi transfer elektron. Proses percepatan transfer elektron dibantu oleh mediator Q0. Sinyal yang keluar dari hasil reaksi
tersebut selanjutnya diubah oleh transduser menjadi sinyal yang bisa dibaca, dalam penelitian ini sinyal tersebut diubaah menjadi kuat arus yang terbaca pada puncak katoda maupun anoda. Berikut reaksi yang terjadi:
H
Voltamogram aktivitas sel yang telah terjerat pada membran zeolit-kappa karaginan dapat dilihat pada Gambar 4. Keberhasilan imobilisasi sel pada membran tersebut dapat dilihat adanya puncak oksidasi yang dihasilkan akibat adanyan reaksi antara sel dengan asam urat sebagai analitnya pada tegangan 0,4-0,7 volt (Widyatmoko 2012).
Sel + zeolit/kppa-karaginan
14
Gambar 4 Voltamogram sel L.plantarum yang terimobilisasi
Proses penjeratan dilakukan melalui proses penyerapan larutan sel
L.plantarum oleh membran. Membran akan mengembang ketika ditetesi sel, hal
ini dikarenakan adanya pori dan ketiadaan air pada membran. Membran yang mengembang mengindikasikan bahwa sel telah terjerat di dalamnya (Campanella
et al. 1999). Kekuatan gel dari karaginan menentukan proses imobilisasi sel. Gel
yang kuat mampu mempersempit pori-pori sehingga sel yang telah terjerat tidak akan mudah lepas. Hal ini diharapkan mampu meningkatkan aktivitas dari sel tersebut (Tosa et al. 1979).
Pada penelitian ini, imobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan menghasilkan arus puncak sebesar 0.0148 mA. Hasil ini tiga kali lebih tinggi dari puncak arus yang dihasilkan oleh penelitian sebelumnya yang hanya menggunakan zeolit sebagai media imobilisasi sel L.plantarum yang berkisar
antara 0.0042 mA (Widyatmoko 2012) dan 0.0051 mA (Kamal 2013) sehingga dapat dikatakan bahwa imobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan mampu meningkatkan arus puncak yang dihasilkan.
Optimasi L. plantarum pada Membran Zeolit/Kappa-Karaginan
Metode yang digunakan untuk optimasi adalah Respon Surface Method.
15
Tabel 5 Hasil analisa pengaruh variabel terhadap arus
Faktor Koefisien P
Konstanta 5.45 x 10-3 0.000
Berat zeolit 1.39 x 10-3 0.064
Konsentrasi karaginan -0.36 x 10-3 0.582
Konsentrasi asam urat 2.19 x 10-3 0.008
R-sq = 92.81 % R-sq (adj) = 82.02 %
Gambar 5 Kontur (a) pengaruh konsentrasi kappa-karaginan dan konsentrasi asam urat terhadap arus, (b) pengaruh berat zeolit dan konsentrasi asam urat terhadap arus, (c) pengaruh berat zeolit dan konsentrasi kappa-karaginan terhadap arus
Warna pada kontur menunjukkan besarnya arus pengukuran. Kontur dengan warna hijau tua menunjukkan bahwa arus yang terukur merupakan arus maksimum. Gambar 5 menunjukkan bahwa sel L.plantarum memberikan respon
arus optimum ketika diimobilisasi pada membran dengan komposisi zeolit 50 mg (Gambar 5b dan 5c) serta konsentrasi kappa karaginan 2% (Gambar 5a). Sedangkan konsentrasi asam urat optimum pada konsentrasi 3 mM (Gambar 5a dan 5b). Dengan menggunakan Response Optimizer pada software minitab
16
karaginan 2%, berat zeolit 50 mg, dan konsentrasi asam urat 3 mM. Pada proses optimasi digunakan pH 8 dan suhu 32.5°C ± 2.5 °C.
Analisis Parameter Kinetika Enzim Urikase dari Sel L.plantarum
Pengukuran kinetika enzim urikase dilakukan untuk melihat kespesifikan suatu enzim. Pengukuran kinetika enzim yang dilakukan adalah pengukuran konstanta Michaelis-Menten nyata (KM) dan kecepatan reaksi nyata (Vmax) yang
dianalogikan dengan arus maksimum nyata (Imaks) pada pengukuran ini. Metode
yang digunakan adalah Lineweaver-Burk. Besarnya nilai KM dan Vmax dalam hal
ini dianalogikan dengan Imax. Grafik hubungan antara 1/[asam urat] dengan 1/Ipa
ditunjukkan pada Gambar 6. Besarnya nilai KM dan Vmax berturut-turut adalah
2.86 mM dan 1.8 µA.
Besarnya nilai KM dan Vmax urikase dari sel L.plantarum yang digunakan
berbeda dengan hasil yang diperoleh dari pengukuran parameter kinetik urikase murni yang bersumber dari Candida utilitis. Pada penelitian sebelumnya nilai KM
dan Vmax yang diperoleh sebesar 3.1397 x 10-3 mM dan 7.4936 µA (Iswantini et
al. 2013). Nilai KM mengindikasikan kuat lemahnya suatu enzim dalam mengikat
substrat. Semakin besar nilai KM semakin lemah enzim mengikat substrat dan
sebaliknya. Pada penelitian ini, nilai KM yang diperoleh besar yang artinya enzim
kurang terikat kuat pada substrat. Hal ini dikarenakan bebrapa faktor antara lain perbedaan sumber enzim urikase yang digunakan. Enzim urikase yang digunakan pada penelitian ini merupakan urikase yang dihasilkan oleh sel L.plantarum tanpa
pemurnian, sedangkan enzim yang digunakan pada penelitian sebelumnya adalah enzim urikase murni yang diisolasi dari Candida utilitis. Selain itu, tidak
dilakukannya optimasi jumlah enzim urikase yang dihasilkan oleh sel L.plantarum
pada penelitian ini juga dimungkinkan berpengaruh terhadap jumlah enzim yang dihasilkan oleh sel, semakin sedikit jumlah urikase yang dihasilkan akan mempengaruhi kuat lemahnya ikatan dengan substrat.
Gambar 6 Grafik hubungan 1/[S] dengan 1/I
y = 157,22x + 54,782
0,30 0,50 0,70 0,90 1,10 1,30 1,50
17
Pengukuran Parameter Analitik Biosensor Asam Urat
Parameter analitik yang diukur dari biosensor asam urat meliputi linearitas, limit deteksi, dan limit kuantitas. Rentang linearitas biosensor asam urat pada penelitian ini sebesar 2-2.6 mM dengan linearitas 99.59%. Grafik yang terbentuk dapat dilihat pada Gambar 7. Sedangkan, limit deteksi dan limit kuantitas berturut-turut 0.478 mM dan 1.598 mM. Limit deteksi menunjukkan konsentrasi jumlah terkecil analit yang dapat dideteksi dan memberikan respon secara signifikan dibandingkan dengan blangko (Harmita 2004). Pada penelitian ini limit deteksi yang diperoleh lebih baik dari penelitian sebelumnya yang dilakukan Hamzah et al (2013) yang memperoleh nilai limit deteksi sebesar 0,58 mM untuk
biosensor asam urat dengan enzim urikase murni. Sedangkan limit kuantitas menunjukan jumlah terkecil analit yang masih memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita 2004).
Dalam penelitian ini, limit kuantitas yang diperoleh sebesar 1.598 mM artinya pada pengukuran asam urat sebesar 1.598 mM memberikan respon yang cermat dan seksama. Sensitivitas biosensor asam urat dari besarnya persamaan regresi adalah 0.8 μA mM-1 artinya setiap perubahan konsentrasi substrat 1 mM biosensor asam urat mampu memberikan perubahan respon arus sebesar 0.8 μA. Hasil ini masih jauh lebih rendah dibanding dengan hasil Kamal (2013) yang memperoleh nilai sensitivitas 3,47 μA mM-1. Masih rendahnya nilai sensitivitas
yang diperoleh pada penelitian ini dikarenakan teknik entrapment yang digunakan
pada penelitian ini memiliki kekurangan yaitu adanya hambatan difusi pada membran sehingga hal ini mempengaruhi respon sensor terhadap substrat yang diukur. Untuk memperkecil hambatan difusi sehbaiknya membran dibuat dalam bentuk thick layer.
Gambar 7 Linearitas biosensor asam urat
18
Stabilitas Biosensor Asam Urat
Pengukuran stabilitas dilakukan dengan cara membandingkan arus pada setiap waktu dengan arus awal pengukuran. Hasil pengukuran stabilitas biosensor ditampilkan pada Gambar 8. Gambar 8 menunjukkan bahwa sel L.plantarum yang
diimobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan mempunyai stabilitas yang jauh lebih lama jika dibandingkan dengan tanpa proses imobilisasi.
Sel yang diimobilisasi mampu bertahan hingga 23 hari dengan sisa aktivitas sebesar 80.43 %, sedangkan sel yang tidak diimobilisasi hanya mampu bertahan selama 7 hari dengan sisa aktivitas sebesar 54.17 %. Pada penelitian sebelumnya stabilitas biosensor asam urat mampu bertahan selama 22 hari dengan sisa aktivitas sebesar 45.26% (Widyatmoko 2012) dan 77.28% (Kamal 2013). Mulyasuryani dan Srihardiastutie (2011) melaporkan bahwa stabilitas biosensor asam urat menggunakan enzim urikase murni yang diimobilisasi pada membran
nata de coco hanya bertahan selama 3 hari. Ali et al (2011) melaporkan bahwa
biosensor asam urat yang menggunakan enzim urikase murni sebagai bioreseptor hanya bertahan selama 3 minggu dengan aktivitas sebesar 80%. Hal ini menunjukkan bahwa biosensor asam urat menggunakan sel L.plantarum yang
diimobilisasi pada membran zeolit/kappa-karaginan mampu meningkatkan stabilitas biosensor asam urat dibandingkan dengan penelitian sebelumnya.
19
Tabel 6 Perkembangan Biosensor Asam Urat
Widyatmoko 2012 Kamal 2013 Penelitian ini
Stabilitas 22 hari 22 hari >23 hari
Sisa aktivitas 45.26% 77.28% 80.43%
Rentang Linieritas
- 0.4-4 mM 2-2.6 mM
Linearitas - 97% 99%
LOD - - 0.478 mM
LOQ - - 1.598 mM
%RSD - - 3.44 %
Sensitivitas 3.47 μA mM-1 0.80 μA mM-1
Pengimobilisasi zeolit zeolit zeolit/κ-karaginan
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Imobilisasi urikase dari sel L.plantarum pada membran
zeolit/kappa-karaginan terbukti mampu meningkatkan aktivitas dan stabilitas dari biosensor asam urat. Pada penelitian ini nilai konstanta Michaeles-Menten (KM) dan Vmax
pada penelitian ini berturut-turut 2.86 mM dan 0.0018 mA. Linearitas, limit deteksi, dan limit kuantitas berturut-turut 0.9959, 0.478 dan 1.598 mM. Stabilitas biosensor mampu bertahan selama 23 hari dengan sisa aktivitas sekitar 80%.
Saran
Imobilisasi urikase dari sel L.plantarum pada membran
20
DAFTAR PUSTAKA
Ali SMU, Alvi NH, Ibupoto Z, Nur O, Willander M, Danielsson, B. 2011. Selective potentiometric determination of uric acid with uricase immobilized on ZnO nanowires. Sensors and Actuators B. 152: 241-247.
doi:10.1016/j.snb.2010.12.015.
Arif Z. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bahan media pendeteksi studi kasus: kromium heksavalen [Tesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Attala MM et al. 2009. Optimum conditions uricase enzyme production by Gliomastix gueg. J Microbiol. 5:45-50.
Bhatia R, Gupta AK, Anup KS, Brinker CJ. 2000. Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation. Chem Mater. 12: 2434-2441. doi: 10.1021/cm000260f
CCC.
Buyukgungor H. 1992. Stability of Lactobacillus bulgaricus Immobilized in rc-carrageenan bels. J Chem Tech Biotechnol.53: 173-175.
Campanella L, Favero G, Tomasetti M. 1999. Superoxide Dismutase biosensors for superoxide radical analysis. Analytical Letters. 32 (13): 2559-2581. doi:
10.1080/00032719908542988.
Cordoves AIP, Valdes MG, Fernandes JCT, Luis GP, Garcia-Calzon JA, Garcia Crumbliss AL, Stonehuerner JG, Henkens RW. 1993. A carrageenan 2014. Optimal immobilization of �-galactosidase onto �-carrageenan gel beads using response surface methodology and its applications. The Scientific
World Journal. 2014: 7. doi: 10.1155/2014/571682.
Ginting AB, Anggraini D, Indaryati S, Kriswa R. 2007. Karakterisasi komposisi kimia, luas permukaan pori dan sifat termal dari zeolit Bayah, Tasikmalaya, dan Lampung. J Tek Bhn Nukl. 3(1): 1-48.
Gorecka E, Jastrzębska M . 2011. Immobilization techniques and biopolymer carriers. Biotechnol. Food Sci. 75: 65-86
Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya.
Majalah Ilmu Kefarmasian. I (3): 117 – 135.
Hsu CH, Chu YF, Argin-Soysal S, Hahm TS, Lo YM. 2004. Effect of surface characteristics and xanthan polymers on the immobilization of Xanthomonas campestris to fibrous matrices. J. Food Sci. 69: 441-448. doi:
10.1111/j.1365-2621.2004.tb09928.x.
Huang W. 2005. Voltammetric Determination of Bisphenol A Using a CarbonPaste Electrode Based on the Enhancement Effect of Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB). Bull. Korean Chem. Soc.
26(10): 1560-1564.
Ikeda T, Hiroshige Matsubara, Kan Kato, Dyah Iswantini, Kenji Kano, Mamoru Yamada. 1998. Electrochemical monitoring of in vivo reconstitution of
glucose dehydrogenase in Escherichia coli cells with externally added
21
Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila, Widiyatmoko O. 2013. Activity and stability of uricase from Lactobacillus plantarum immobilizated on natural
zeolite for uric acid biosensor. Pakistan Journal of Biological Science. 17(2):
277-281. doi: 10.3923/pjbs.2013.
Kamal F. 2014. penentuan kestabilan dan linearitas pada biosensor asam urat menggunakan urikase Lactobacillus plantarum termodifikasi zeolit secara
elektrokimia. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Liyonawati. 2013. Aktivitas dan stabilitas superoksida dismutase dari ekstrak
Escherichia coli diimobilisasi pada zeolit alam sebagai biosensor
Lactobaciilus plantarum dan parameter kinetiknya [skripsi]. Bogor (ID) :
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Mateo C, Palomo JM, Lorente GF, Guisan JM. 2007. Improvement of enzyme
activity, stability and selectivity via immobilization techniques. Enzyme and
Microbial Technology. 40: 1451–1463.doi:10.1016/j.enzmictec.2007.01.018.
Monsan P, Durand G, Navarro JM. 1987. Immobilization of microbial cells by adsorption to solid supports. Methods Enzymol. 135: 307-318.
Moon SH, Parulekar SJ. 1991. Characterization of kappa-carrageenan gels used for immobilization of Bacillus firmus. Biotechnol. Prog. 7: 516-525.
Mulyasuryani A, Srihardiastutie A. 2011. Conductimetric biosensor for the detection of uric acid by immobilization uricase on nata de coco membrane-Pt electrode. Analytical Chemistry Insights, 6:47-51. doi: 10.4137/ACI.S7346
Nurjayati A. 2010. Penentuan kinetika urikase dari sel Bacillus subtilis, B.
megaterium, dan B. cereus. [Skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Ozkan FC, Ulku S. 2005. The effect of HCl treatment on water vapor adsorption characteristics of clinoptilolite rich natural zeolite. Microporous and
Mesoporous Materials. 77: 47-53.
Ramakrishna SV, Prakasha RS. 1999. Microbial fermentations with immobilized cells. Curr Sci. 77:87-100.
Rodriguez LH, Calleros CL, Gonzales DJP, Carter EJV. 2014. Lactobacillus
plantarum protection by entrapment in whey protein isolate: κ-carrageenan
complex coacervates. Food Hydrocolloids. 36: 181-188.
Rostini I. 2007. Peranan bakteri asam laktat (Lactobacillus plantarum) terhadap
masa simpan filet nila merah pada suhu rendah [tesis]. Jatinangor (ID) : Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Padjajaran.
Takata I, Tosa T, Chibata I. 1977. Screening of matrix suitable for immobilization of microbial cells. Journal of Solid-Phase Biochemistry.
22
Tosa T, Sato T, Mori T, Yamamoto K, Tanaka I, Nishida Y, Chibata I. 1979. Immobilization of enzymes and microbial cells using carrageenan as matrix.
Biotech and Bioenginerring. 21: 1697-1709.
Triana E, Yulianto E, Nurhidayat N. 2006. Uji Viabilitas Lactobacillus sp. Mar 8
Terenkapsulasi. Biodiversitas. 7(2): 114-117.
Trivadila. 2011. Biosensor antioksidan menggunakan superoksida dismutase
Deinococus radiodurans diimobilisasi pada permukaan elektrode pasta
karbon dan parameter kinetikanya. [Tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Weniarti. 2011. Biosensor antioksidan berbasis superoksida dismutase
Deinococcus radiodurans diimobilisasi pada nanokomposit zeolit alam
Indonesia. [tesis]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Wennerstrum S, Kendrick T, Tomaka J, Cain J. 2002. Size reduction solutions for hard-to-reduce materials. Powderand Bulk Enggineering (1): 1-5.
Widyatmoko O. 2012. Aktivitas dan stabilitas urikase Lactobacillus plantarum
yang diimobilisasikan pada zeolit alam untuk biosensor asam urat. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Xing GW, Li XW, Tian GL, Ye YH. 2000. Enzymatic peptide synthesis in organic solvent with different zeolites as immobilization matrixes.
23
24
Lampiran 2 Hasil kombinasi Response Surface Methods
berat zeolit
Lampiran 3 Stabilitas Biosensor Asam Urat
25
RIWAYAT HIDUP
![Tabel 4 Puncak arus oksidasi dari mediator K3[Fe(SCN)6], 2,3-dimetoksi-5-metil-1,4 benzoquinon (Q) dan ferosena](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123dok/652886.446579/28.595.98.504.239.825/tabel-puncak-oksidasi-mediator-dimetoksi-metil-benzoquinon-ferosena.webp)
![Gambar 6 Grafik hubungan 1/[S] dengan 1/I](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123dok/652886.446579/33.595.103.461.535.752/gambar-grafik-hubungan-s-dengan-i.webp)
