KORELASI EKSPRESI
MicroRNA-21
DENGAN
GRADE HISTOPATOLOGIS DI JARINGAN KANKER
PAYUDARA TIPE DUKTAL
TESIS
OLEH JUWITA 127008003
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOMEDIK
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
TESIS
Diajukan untuk Melengkapi Persyaratan Memperoleh Gelar
Magister Biomedik dalam Program Studi Magister Ilmu Biomedik
pada Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
JUWITA
127008003
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOMEDIK
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
Judul Tesis :KORELASI EKSPRESI MicroRNA-21 DENGAN GRADE HISTOPATOLOGIS DI JARINGAN KANKER PAYUDARA TIPE DUKTAL
Nama Mahasiswa : Juwita Nomor Induk Mahasiswa : 127008003
Program Studi : Magister Ilmu Biomedik
Menyetujui Komisi Pembimbing
dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D dr. Sumondang M. Pardede, Sp.PA Ketua Anggota
Ketua Program Studi Dekan
dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D Prof. dr. Gontar A. Siregar, Sp.PD(KGEH) NIP. 19550807 198503 2 001 NIP. 19540220 198011 1 001
PANITIA PENGUJI TESIS
Ketua : dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D
Anggota :1. dr. Sumondang M. Pardede, Sp.PA
i ABSTRAK
Pendahuluan: Kanker payudara sampai saat ini masih menempati peringkat kedua jenis kanker terbanyak di dunia. Penegakan diagnosa didasarkan atas pemeriksaan jaringan payudara secara histopatologis. Selain diagnosa, juga dapat diperoleh informasi grade histopatologis untuk memperkirakan prognosis penderita. Akan tetapi pemeriksaan grade ini masih terdapat kekurangan yaitu bersifat semikuantitatif dan rendahnya reproduksibilitas. MicroRNA (miRNA) merupakan RNA-non coding yang dapat meregulasi ekspresi gen pada manusia, berperan pada kondisi fisiologis maupun patologis. Salah satu miRNA yaitu miR-21 dianggap sebagai oncomiR pada jaringan kanker payudara melalui targetnya pada mRNA tumorsupresor, sehingga dapat meregulasi proliferasi, transformasi neoplastik, dan apoptosis. Adanya kemungkinan korelasi antara ekspresi miR-21 dengan grade histopatologis di jaringan kanker payudara tipe duktal, menjadi tujuan dilakukannya penelitian ini.
Metode: Sampel yang digunakan adalah blok parafin (FFPE) jaringan kanker payudara tipe duktal dari perempuan penderita kanker payudara, sebanyak 64 sampel yang diperoleh dari Instalasi Patologi Anatomi RSUP H. Adam Malik Medan. Dilakukan proses isolasi RNA total, sintesis cDNA, dan pemeriksaan ekspresi miR-21 menggunakan Real-Time qPCR.
Hasil: Berdasarkan grade histopatologis, ekspresi miR-21 paling tinggi pada grade II, kemudian menurun pada grade III, dan paling rendah pada grade I.
Kesimpulan: Ditemukan korelasi positif yang sangat lemah dan tidak signifikan antara ekspresi miR-21 dengan grade histopatologis di jaringan kanker payudara (r < 0,2; p > 0,05).
Breast cancer was diagnosed based on histopathological examination. Prognosis of breast cancer could be predicted through histopathological grading. This grading showed semiquantitave result but hardly to reproduced. MicroRNA (miRNA) is a short non-coding RNA that regulates gene expression in human and has a role in physiological and pathological conditions. MiR-21 is one of the oncomiR involved in breast cancer by suppression of its tumorsuppressor mRNAs. Therefore miR-21 has been impicated in proliferation, neoplastic transformation, and apoptosis. Here we investigate a possible correlation between expression of miR-21 and histopathological grade in ductal type breast cancer.
Method: 64 female ductal type breast cancer paraffin blocks (FFPE) were used as samples obtained from the Anatomical Pathology tissue bank of Adam Malik Hospital Medan. Total RNA was isolated from the samples followed by cDNA synthesis and miR-21 expression were analyzed using Real-Time qPCR.
Result: The highest expression of miR-21 was in grade II, followed by grade III and the lowest was in grade I.
Conclusion: Positive correlation between miR-21 expression and histopathological grade in breast cancer was very weak and non-significant (r < 0,2; p > 0,05).
.
iii
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas berkah dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian yang berjudul ”Korelasi Ekspresi
MicroRNA-21 Dengan Grade Histopatologis di Jaringan Kanker Payudara Tipe Duktal”. Tesis ini merupakan syarat yang harus dilaksanakan penulis untuk memenuhi persyaratan meraih gelar Magister di Sekolah Pascasarjana Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan sebesar-besarnya kepada :
1. Rektor Universitas Sumatera Utara Prof.Dr.dr.Syahril Pasaribu, DTM&H, M.Sc (CTM), Sp.A(K), dan seluruh jajarannya atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan pada Program Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
penulis untuk mengikuti pendidikan Magister di Sekolah Pascasarjana.
4. dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D yang pada kesempatan ini juga sebagai Ketua Komisi Pembimbing penulis, atas bimbingan, motivasi, arahan, dan kesabaran dalam membantu penulis menyelesaikan penelitian ini.
5. dr. Sumondang M. Pardede, Sp.PA, yang telah banyak memberikan bimbingan dan masukan yang bermanfaat sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini.
6. Prof.Dr.dr. Hadyanto Lim, M.Kes,Sp.FK,FESC,FIBA,FAHA, dan dr. Jessy Chrestella, M.Ked (PA),Sp.PA, selaku pembanding yang telah meluangkan waktunya untuk dapat memberikan saran dan masukan serta ilmu pengetahuan yang bermanfaat bagi penulis.
7. dr. Putri C. Eyanoer, MS.Epi.Ph.D., atas saran dan bantuan dalam hal metodologi dan statistika penelitan.
8. dr.Kamal Basri Siregar, Sp.B(K) Onk., atas arahan yang diberikan untuk penelitian ini.
v
10.Ahli Patologi Anatomi beserta staf di Instalasi Patologi Anatomi RSUP HAM Medan, yang sangat membantu dalam pemilihan sampel penelitian ini.
11.Prof.Dr.dr.Sofia Mubarika, MMedSC., Ph.D, Risky Oktriani, S.Si, M.Biotech, teman-teman Tim GenomiR, seluruh staf dan laboran Bagian Biologi Molekular FK UGM Yogyakarta atas izin, pelatihan, pembelajaran, serta pengalaman yang diberikan agar penulis dapat melakukan penelitian dengan baik.
12.dr. Henny Erina Saurmauli Ompusunggu, sahabat dan teman sekerja dalam melaksanakan penelitian.
13.Kedua orangtua penulis yaitu ibunda Iriany Hasan Saleh dan ayahanda Ridhwan Ibrahim, serta mertua yaitu ibunda Yisraida Nasution dan ayahanda M. Adnan Azis, serta seluruh keluarga yang telah memberikan dukungan moril dan materiil selama penulis menjalani pendidikan di Sekolah Pascasarjana.
14.Kepada suami tercinta, Syafriyadi Adnan, ST, yang telah memberikan izin, restu, semangat, dan motivasi, serta anak-anak (Mifzal Attaya, Faris Zafran) atas cinta kasih dan kesabaran yang demikian besar sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan dan penelitian ini.
penelitian ini.
Semoga segenap bantuan, bimbingan dan arahan yang telah diberikan kepada penulis mendapat imbalan yang setimpal dari Allah SWT. Penulis menyadari bahwa penelitian ini masih perlu mendapat koreksi dan masukan untuk kesempurnan. Oleh karena itu penulis berharap adanya kritik dan saran untuk penyempurnaan tulisan ini. Semoga penelitian ini bermanfaat bagi kita semua. Aamiin...
Medan, Desember 2014
Penulis
vii
RIWAYAT HIDUP
1. Nama : Juwita
2. Tempat/Tanggal Lahir : Banda Aceh/27 Juni 1983 3. Jenis Kelamin : Perempuan
SD Pocut Meuligoi Banda Aceh, Aceh : 1989-1995
SMPN 1 Banda Aceh, Aceh : 1995-1998
SMAN 3 Banda Aceh, Aceh : 1998-1999
SMAN 3 Jakarta : 1999-2001
Sarjana (S1) Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya : 2002-2006 Profesi Dokter, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya: 2006-2008 9. Riwayat Pekerjaan :
Staf Pengajar Tetap di Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Syiah Kuala Banda Aceh (2010 – sekarang).
10. Riwayat Penelitian:
ABSTRAK ………... i
ABSTRACT ………... ii
KATA PENGANTAR ………. .. iii
RIWAYAT HIDUP………... .. vii
DAFTAR ISI ………... viii
DAFTAR GAMBAR ………... xi
DAFTAR TABEL ………... .. xii
DAFTAR SINGKATAN ……… xiii
BAB I PENDAHULUAN ……… 1
1.1 Latar Belakang ……… ... 1
1.2 Rumusan Masalah ………... ... 9
1.3 Hipotesa Penelitian ………. ... 9
1.4 Tujuan Penelitian ………... 9
1.4.1 Tujuan Umum ………. ... 9
1.4.2 Tujuan Khusus ………. ... 9
1.5 Manfaat Penelitian ……….. ... 10
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ……… ... 11
2.1 Kanker Payudara ………. ... 11
2.1.1 Definisi ………. 11
ix
3.4.2 Variabel Dependen ……… 45
3.5 Definisi Operasional ……… 45
3.6 Kerangka Operasional ………. ... 46
3.7 Alat dan Bahan Penelitian ………... ... 46
3.7.1 Alat ………... 46
3.7.2 Bahan ………... 47
3.8 Prosedur Kerja ……… .. 47
3.9 Jadwal Penelitian ……… ... 56
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ………. ... 57
4.1. Hasil Penelitian ………... 57
4.2 Pembahasan ……… ... 61
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ……… ... 72
5.1 Kesimpulan ………. ... 72
5.2 Saran ……… .. 72
DAFTAR PUSTAKA ………. .. 74
xi
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 2.1. Model Multi-Step Progression pada Kanker Payudara dan Gen yang
Terlibat... 17
Gambar 2.2. Profil Grade Histopatologis I, II, dan III Kanker Payudara... 29
Gambar 2.3. Biogenesis MicroRNA... 34
Gambar 2.4. Lokasi Gen MiR-21... 37
Gambar 2.5. Kerangka Teori... 41
Gambar 2.6. Kerangka Konsep... 42
Gambar 3.1. Kerangka Operasional... 46
Gambar 3.2. Tahapan Siklus Real Time qPCR... 55
Gambar 4.1. Proporsi Grade Histopatologis dari Subjek Penelitian... 58
Gambar 4.2. Perbandingan Ekspresi miR-21 Berdasarkan Grade Histopatologis Jaringan Kanker Payudara... 60
Tabel 2.1. Klasifikasi Kanker Payudara Berdasarkan Sistem TNM dari AJCC
Edisi Keenam... 27
Tabel 2.2. Kombinasi TNM ke dalam Stage Grouping... 28
Tabel 2.3. Metode Penilaian Grade Histopatologis Semikuantitatif pada Kanker Payudara... 29
Tabel 2.4. MiRNA yang Terkait dengan Keganasan pada Manusia... 35
Tabel 3.1. Definisi Operasional Penelitian... 45
Tabel 4.1. Distribusi Subjek Penelitian Berdasarkan Kelompok Usia... 57
Tabel 4.2. Distribusi Ekspresi MiR-21 Berdasarkan Grade Histopatologis Sampel Penelitian... 59
xiii
DAFTAR SINGKATAN
AJCC = The American Joint Committee on Cancer Bak = Bcl-2 homologous antagonist killer
Bax = Bcl-2-associated X protein Bcl2 = B-cell lymphoma 2
Bcl-xL = B-cell lymphoma-extra large
Bid = BH3 Interacting Domain Death Agonist Bim = BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) BMP = Bone morphogenetic protein
BRCA1 = Breast Cancer Gene A1
BRCA2 = Breast Cancer Gene A2
CA 15-3 = Carcinoma Antigen 15-3 CA 27-29 = Carcinoma Antigen 27-29 cDNA = complementary DNA C. elegans = Caenorhabditis elegans
CEA = Carcino Embryonic Antigen CHEK2 = Checkpoint Kinase 2
CLL = Chronic Lymphocytic Leukemia
EGF = Epidermal Growth Factor ERα = Estrogen receptor α
ErbB2 = v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2
ERE = Estrogen Response Elements FGF = Fibroblast Growth Factor
FFPE = Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded
HER-2 = Human Epidermal Growth Factor Receptor 2
hsa-miR-21 = homo sapiens – miR-21 mRNA = messenger RNA
MRI = Magnetic Resonance Imaging MiR-21 = MicroRNA-21
MiRNA = MicroRNA
miRISC = miRNA-associated RNA-Induced Silencing Complex MYC = Myelocytomatosis
NR = Nuclear Receptor
PDCD4 = Programmed Cell Death 4
PET = Positron Emission Tomographic Screening
xv pri-miRNA = primary transcript microRNA RNA = Rybonucleic Acid
RT-qPCR = Real Time – quantitative Polymerase Chain Reaction TGFβ = Transforming growth factor-ß
TMEM49 = Transmembrane Protein 49 TP53 = Tumor Protein p53
TPM1 = Tropomyosin 1
TRBP = Transactivator RNA-Binding Protein UTR = Untranslated Regions
i ABSTRAK
Pendahuluan: Kanker payudara sampai saat ini masih menempati peringkat kedua jenis kanker terbanyak di dunia. Penegakan diagnosa didasarkan atas pemeriksaan jaringan payudara secara histopatologis. Selain diagnosa, juga dapat diperoleh informasi grade histopatologis untuk memperkirakan prognosis penderita. Akan tetapi pemeriksaan grade ini masih terdapat kekurangan yaitu bersifat semikuantitatif dan rendahnya reproduksibilitas. MicroRNA (miRNA) merupakan RNA-non coding yang dapat meregulasi ekspresi gen pada manusia, berperan pada kondisi fisiologis maupun patologis. Salah satu miRNA yaitu miR-21 dianggap sebagai oncomiR pada jaringan kanker payudara melalui targetnya pada mRNA tumorsupresor, sehingga dapat meregulasi proliferasi, transformasi neoplastik, dan apoptosis. Adanya kemungkinan korelasi antara ekspresi miR-21 dengan grade histopatologis di jaringan kanker payudara tipe duktal, menjadi tujuan dilakukannya penelitian ini.
Metode: Sampel yang digunakan adalah blok parafin (FFPE) jaringan kanker payudara tipe duktal dari perempuan penderita kanker payudara, sebanyak 64 sampel yang diperoleh dari Instalasi Patologi Anatomi RSUP H. Adam Malik Medan. Dilakukan proses isolasi RNA total, sintesis cDNA, dan pemeriksaan ekspresi miR-21 menggunakan Real-Time qPCR.
Hasil: Berdasarkan grade histopatologis, ekspresi miR-21 paling tinggi pada grade II, kemudian menurun pada grade III, dan paling rendah pada grade I.
Kesimpulan: Ditemukan korelasi positif yang sangat lemah dan tidak signifikan antara ekspresi miR-21 dengan grade histopatologis di jaringan kanker payudara (r < 0,2; p > 0,05).
Breast cancer was diagnosed based on histopathological examination. Prognosis of breast cancer could be predicted through histopathological grading. This grading showed semiquantitave result but hardly to reproduced. MicroRNA (miRNA) is a short non-coding RNA that regulates gene expression in human and has a role in physiological and pathological conditions. MiR-21 is one of the oncomiR involved in breast cancer by suppression of its tumorsuppressor mRNAs. Therefore miR-21 has been impicated in proliferation, neoplastic transformation, and apoptosis. Here we investigate a possible correlation between expression of miR-21 and histopathological grade in ductal type breast cancer.
Method: 64 female ductal type breast cancer paraffin blocks (FFPE) were used as samples obtained from the Anatomical Pathology tissue bank of Adam Malik Hospital Medan. Total RNA was isolated from the samples followed by cDNA synthesis and miR-21 expression were analyzed using Real-Time qPCR.
Result: The highest expression of miR-21 was in grade II, followed by grade III and the lowest was in grade I.
Conclusion: Positive correlation between miR-21 expression and histopathological grade in breast cancer was very weak and non-significant (r < 0,2; p > 0,05).
.
1 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kanker payudara merupakan kanker yang sangat banyak dialami perempuan dan juga termasuk penyebab kematian, baik di negara maju maupun di negara berkembang. Diperkirakan 519.000 perempuan di seluruh dunia meninggal di tahun 2004 akibat kanker payudara (WHO, 2011). Sementara itu berdasar hasil penelitian Ferlay et al (2008) mengenai insiden dan mortalitas terhadap 27 jenis kanker di 182 negara, tercatat kanker payudara adalah jenis kanker kedua terbanyak di dunia (1,38 juta kasus), dan menempati peringkat kelima sebagai penyebab kematian (458 ribu kasus). Penelitian mengenai statistik kanker di United States yang dilakukan oleh Siegel et al (2013), tercatat jumlah kasus kanker payudara pada perempuan mencapai 232.340 kasus (29%), dan kasus kematian akibat kanker payudara sebesar 39.620 kasus (14%).
Malik Medan pada tahun 2012 menunjukkan, terdapat sekitar 200 penderita yang baru didiagnosa kanker payudara dalam 1 tahun.
Adanya kelainan genetik dalam jaringan dapat menyebabkan kanker
(Nagahata et al, 2002). Mutasi onkogen dan gen tumorsupressor dianggap sebagai elemen potensial timbulnya kanker payudara. Amplifikasi DNA (terutama pada onkogen, faktor pertumbuhan dan reseptornya) dan delesi DNA (pada gen tumorsupresor) seringkali ditemukan pada kanker payudara. Selain mutasi, kelainan pada regulasi siklus sel juga dapat menyebabkan sel-sel ganas berproliferasi (Ostad and Parsa, 2011).
Isolasi 2 gen yang rentan mengalami kelainan pada kanker payudara yaitu
BRCA1 dan BRCA2, diidentifikasi sebagai gen tumorsupresor yang terkait dengan
kejadian kanker payudara dalam riwayat keluarga. Selain itu mutasi pada gen
tumorsupresor p53, TPM1, PDCD4 juga berperan dalam perkembangan kanker
payudara (Nagahata et al, 2002; Prasad, 2004; Wen et al, 2007). Akibat ditemukannya sejumlah gen yang terlibat dalam perkembangan kanker payudara, maka kanker ini disebut sebagai penyakit heterogen baik secara genetik maupun histopatologis (Hedenfalk et al, 2002).
3
payudara, ultrasonografi, dan pemeriksaan sampel jaringan payudara (Bevers et al, 2009).
Pemeriksaan sampel jaringan payudara secara histopatologis sampai saat ini masih merupakan Gold Standard dalam penegakan diagnosa tumor (Khatib and Modjtabai, 2006; Strumfa et al, 2012). Selain informasi diagnosis, dari pemeriksaan tersebut juga dapat diperoleh informasi prognosis penderita (O’Leary et al, 2004), antara lain melalui penilaian grade histopatologis. Grade histopatologis merupakan penilaian terhadap 3 karakteristik tumor yaitu formasi tubulus, pleiomorfisme inti sel, dan penghitungan mitosis yang ditujukan pada kanker payudara invasif (Tavassoli and Devilee, 2003). Khususnya pada kanker payudara invasif tipe duktal (jenis kanker invasif terbesar), penggolongan kanker dapat dibagi ke dalam 3 kategori berdasar grade histopatologis menjadi karsinoma duktal invasif grade I (diferensiasi baik), grade II (diferensiasi sedang), dan grade III (diferensiasi buruk) (Tavassoli and Devilee, 2003; Malhotra et al, 2010).
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk melihat korelasi antara grade histopatologis kanker payudara dengan prognosis. Hasilnya adalah penderita kanker payudara dengan grade I (diferensiasi baik) memiliki prognosis yang lebih baik dibanding grade II (diferensiasi sedang) atau grade III (diferensiasi buruk) (Elston and Ellis, 1991; Daglar et al, 2010). Di samping itu, berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan oleh Rakha et al di tahun 2008 dan di tahun 2010 menyatakan bahwa grade juga dapat dikombinasikan dengan sistem staging, kemudian disusun dalam bentuk algoritma, untuk keperluan pemilihan terapi yang sesuai.
Meskipun grade histopatologis sering digunakan sebagai parameter prognosis, tetapi pada kenyataannya memiliki keterbatasan yaitu metode penilaian bersifat semikuantitatif dan terdapat masalah reproduksibilitas. Verderio di tahun 2005 menemukan rendahnya kesepakatan dalam hal penentuan grade di antara observer, baik di dalam 1 institusi maupun antar institusi sehingga tingkat reproduksibilitas rendah. Diperlukan kemampuan analisa yang baik untuk dapat menginterpretasi perubahan yang terjadi pada sampel jaringan. Oleh karenanya dibutuhkan parameter lain dalam menilai prognosis yang bersifat kuantitatif dan memiliki reproduksibilitas cukup tinggi sehingga dapat melengkapi pemeriksaan grade histopatologis.
5
diagnosis, prognosis, maupun target terapi (Heneghan, 2012). Salah satu hasil penelitian di bidang molekular adalah ditemukannya microRNA (miRNA).
Gen miRNA ditemukan oleh Lee et al di tahun 1993, dan awalnya diidentifikasi sebagai gen lin-4 pada C. elegans, akibat adanya mutasi berupa hilangnya fungsi yang menyebabkan defek pada tahap perkembangan larva cacing. Dua transkrip lin-4 yang pendek, terdiri dari 22-61 nukleotida, berhasil diidentifikasi pada C. elegans. Kedua transkrip ini ternyata memiliki sekuensi komplementer dengan sekuensi 3’ UTR (untranslated regions) mRNA lin-14. Muncul dugaan bahwa
lin-4 dapat meregulasi lin-14 (regulasi negatif) melalui interaksi RNA-antisense RNA. Sehingga protein lin-14 menurun dan mengganggu perkembangan larva cacing (Lee et al, 1993).
MicroRNA merupakan kelompok RNA endogen non-coding, pendek (± 22 nukleotida), yang memiliki peran penting sebagai regulator, melalui targetnya pada mRNA dengan cara degradasi atau menghambat translasi. MiRNA bekerja pada targetnya secara spesifik terhadap sekuensi mRNA, melalui interaksi komplementer antisense di daerah 3’ UTR (Bartel, 2004). Satu miRNA dapat memiliki sejumlah
besar target sehingga mempengaruhi ratusan ekspresi protein (Calin and Groce, 2006; Cho, 2007; Ostad and Parsa, 2011).
peningkatan ekspresi, atau penurunan ekspresi dapat mengakibatkan berbagai penyakit (Lu et al, 2008). MiRNA berperan penting dalam hal ekspresi mRNA di jaringan normal dan di jaringan yang mengalami kelainan, termasuk kanker (Cho, 2007).
Pemeriksaan ekspresi miRNA dapat dilakukan dari beberapa jenis sampel antara lain dari sel, jaringan, sirkulasi, atau cairan tubuh. Analisis ekspresi miRNA menunjukkan hasil yang cukup baik dan akurat pada penelitian (terutama penelitian retrospektif) yang menggunakan sampel jaringan dalam bentuk blok parafin atau FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) (Doleshal et al, 2008; Hoefig et al, 2008; Szafranska et al, 2008), bahkan setelah sampel FFPE disimpan lebih dari 10 tahun (Xi et al, 2007).
Kaitan antara ekspresi miRNA dengan kanker pertama kali ditemukan oleh Calin dan kawan-kawan di tahun 2002 yang melaporkan bahwa terjadi delesi satu kelompok miR-15a/16-1 di sebagian besar kasus keganasan CLL (Calin et al, 2002), sehingga fungsi miRNA ini sebagai supresor menurun. Akibatnya terjadi overekspresi gen Bcl2 dan gen lain yang berperan dalam proses tumorigenesis (Calin and Croce, 2006).
7
mengalami deregulasi pada kanker payudara. Dua miRNA di antaranya yaitu miR-21 dan miR-155 mengalami peningkatan ekspresi. Sementara tiga miRNA lainnya yaitu miR-10b, miR-125b, dan miR-145 mengalami penurunan ekspresi. Hal ini menunjukkan bahwa miRNA tersebut dapat berperan sebagai gen tumorsupresor atau onkogen.
Yan et al pada tahun 2008 menginvestigasi profil miRNA di jaringan kanker payudara dibandingkan jaringan payudara normal. Ditemukan 9 miRNA yang mengalami peningkatan ekspresi, dan miR-21 merupakan miRNA yang peningkatannya sangat signifikan. Selanjutnya diteliti hubungan antara miR-21 dengan beberapa parameter klinikopatologis terkait prognosis, hasilnya adalah peningkatan ekspresi miR-21 pada kanker payudara berhubungan signifikan dengan prognosis yang buruk. Kemudian Qian et al di tahun 2009 melakukan penelitian mengenai pengaruh ekspresi miR-21 terhadap perkembangan kanker payudara, dimana salah satu parameter yang diteliti adalah grade histopatologis. Hasil menunjukkan bahwa ekspresi miR-21 memiliki korelasi signifikan dengan grade tumor, dan tingginya ekspresi miR-21 diduga memfasilitasi progresi kanker payudara. Selain itu, Qian et al juga menemukan ekspresi miR-21 berhubungan signifikan dengan jenis jaringan tumor, yaitu ekspresi miR-21 paling tinggi pada jenis duktal, dibanding pada jenis lainnya (lobular, mix, dan lain-lain).
pada kanker payudara (Calin and Croce, 2006). MiR-21 dianggap sebagai oncomiR dan dapat meregulasi tumorigenesis (Si et al, 2007; Selcuklu et al, 2009). Gen targetnya diduga merupakan kelompok gen tumorsupresor (Iorio et al, 2005). Target miR-21 yang telah diidentifikasi adalah tumorsupresor Tropomyosin 1 (TPM1), Network ofp53, Maspin, dan PDCD4 (Programmed Cell Death 4) (Zhu et al, 2007; Frankel et al, 2008; Zhu et al, 2008). Baik TPM1, Network of p53, Maspin maupun PDCD4 berperan dalam mengendalikan proses proliferasi, apoptosis, transformasi neoplastik, invasi, dan metastasis (Lankat-Buttgereit and Göke, 2003; Zhu et al, 2008). Regulasi miR-21 terhadap mRNA target tumor supresor berdampak pada proses proliferasi sel, transformasi neoplastik, migrasi, invasi, dan apoptosis (Zhu et al, 2008; Selcuklu et al, 2009; Findlay, 2010). Beberapa penelitian menunjukkan bila miR-21 dihambat, maka akan terjadi penurunan proliferasi sel (akibat menurunnya sel yang bermitosis), invasi, metastasis serta peningkatan apoptosis (Si et al, 2007; Zhu et al, 2008; Yan et al, 2011).
9
dapat meregulasi proses proliferasi sel (melalui mitosis), sehingga diduga miR-21 memiliki korelasi dengan grade histopatologis.
Berdasarkan uraian di atas, maka peneliti tertarik melakukan penelitian mengenai kemungkinan adanya korelasi antara ekspresi miR-21 di jaringan dengan grade histopatologis di jaringan kanker payudara.
1.2 Rumusan Masalah
Bagaimana korelasi antara ekspresi miR-21 dengan grade histopatologis di jaringan kanker payudara?
1.3. Hipotesa Penelitian
Ekspresi miR-21 berkorelasi positif dengan grade histopatologis di jaringan kanker payudara.
1.4 Tujuan Penelitian 1.4.1 Tujuan Umum
Mengetahui bagaimana korelasi antara ekspresi miR-21 dengan grade histopatologis di jaringan kanker payudara.
1.4.2 Tujuan Khusus
1. Mendata karakteristik sampel penelitian.
2. Mendata grade histopatologis I, II, dan III serta proporsinya dari sampel penelitian.
4. Menganalisa korelasi antara ekspresi miR-21 dengan grade histopatologis di jaringan kanker payudara.
1.5 Manfaat Penelitian
1. Bila dari hasil penelitian didapatkan korelasi yang signifikan antara ekspresi miR-21 dengan grade histopatologis di jaringan kanker payudara, maka ekspresi miR-21 kemungkinan dapat dijadikan sebagai biomarker untuk kanker payudara.
2. Korelasi antara ekspresi miR-21 dengan grade histopatologis ini dapat digunakan untuk menilai prognosis penderita kanker payudara.
11 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kanker Payudara
2.1.1 Definisi
Kanker payudara adalah suatu penyakit dimana sel-sel payudara berproliferasi secara abnormal (Culver et al, 2000). Sementara itu Nelson et al pada tahun 2009 menyatakan bahwa kanker payudara adalah suatu kondisi terjadinya proliferasi sel-sel ganas di jaringan payudara, khususnya di unit duktus atau lobulus.
2.1.2 Epidemiologi
mencapai 232.340 kasus (29%), dan kasus kematian akibat kanker payudara relatif turun sebesar 39.620 kasus (14%) (Siegel et al, 2013).
Sementara itu di Indonesia, kanker payudara termasuk jenis kanker kedua terbanyak setelah kanker leher rahim (Kementerian Kesehatan Indonesia, 2013). Sebagian besar penderita kanker payudara datang berobat ke RS ketika kanker sudah mencapai stadium lanjut, dimana hal ini akan sangat mempengaruhi prognosis dan kesembuhan penderita (Rumah Sakit Dharmais Pusat Kanker Nasional, 2011). Menurut hasil penelitian Siahaan di tahun 2011 mengenai prevalensi kanker payudara di RS Hasan Sadikin Bandung, terdapat 275 kasus kanker payudara dalam rentang waktu Januari hingga Desember 2009. Data yang diperoleh dari Instalasi Rekam Medis RSUP Haji Adam Malik Medan pada tahun 2012 menunjukkan, terdapat sekitar 200 penderita yang baru didiagnosa kanker payudara dalam 1 tahun.
2.1.3 Etiologi dan Faktor Resiko
Kanker payudara disebabkan oleh banyak faktor, antara lain usia, genetik, riwayat keluarga, endokrin, diet, gaya hidup, aktifitas fisik, dan obesitas. Faktor lain yang mungkin terkait adalah densitas mammografi dan riwayat tumor jinak sebelumnya (Abdulkareem, 2013).
a. Usia
Penelitian Siegel et al (2013) menunjukkan bahwa semakin tinggi angka probabilitas kanker payudara seiring meningkatnya usia. Pada usia ≤ 39 tahun
13
probabilitas 3,78%, pada usia 60-69 tahun angka probabilitas 3,56%, dan pada usia ≥ 70 tahun angka probabilitas meningkat mencapai 6,65%.
b. Genetik
Akumulasi kelainan genetik dalam jaringan dapat menyebabkan kanker,
sehingga kanker disebut sebagai penyakit yang kompleks (Nagahata et al,
2002). Mutasi onkogen dan gen tumorsupressor dianggap sebagai elemen potensial timbulnya kanker payudara. Selain mutasi, apabila regulasi siklus sel mengalami kelainan, juga dapat menyebabkan sel ganas berproliferasi (Ostad and Parsa, 2011). Isolasi 2 gen yang rentan mengalami kelainan pada kanker payudara yaitu BRCA1 dan BRCA2, diidentifikasi sebagai gen
tumorsupresor yang terkait dengan kejadian kanker payudara dalam riwayat
keluarga. Selain itu mutasi gen tumorsupresor p53, TPM1, PDCD4 juga
berperan dalam perkembangan kanker payudara (Nagahata et al, 2002;
Prasad, 2004; Wen et al, 2007). c. Riwayat Keluarga
Penelitian meta-analisis dengan kolaborasi 52 studi epidemiologi di tahun 2001 menunjukkan bahwa 12% perempuan penderita kanker payudara memiliki riwayat salah satu anggota keluarganya menderita penyakit ini. Dan 1% memiliki 2 atau lebih anggota keluarga penderita kanker payudara (Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer, 2001).
Asupan lemak dan jenis lemak yang dikonsumsi mempengaruhi kejadian kanker payudara. Asupan tinggi lemak sekitar 35-40% kalori lemak dapat memicu pertumbuhan tumor payudara. Serat dalam makanan dapat menurunkan insiden kanker payudara melalui inhibisi absorbsi kolesterol sebagai bahan baku sintesis hormon estrogen (Aguas et al, 2005), sebagaimana diketahui bahwa estrogen dapat memicu pertumbuhan sel kanker. Baik diet maupun aktifitas dapat mempengaruhi level hormon plasma dan juga sebagai faktor resiko kanker payudara. Kedua faktor ini bersama dengan obesitas, meningkatkan resiko kanker payudara pada perempuan post-menopause. Salah satu kemungkinan mekanisme tingginya resiko kanker payudara pada perempuan obesitas post-menopause adalah sumber utama hormon estrogen berasal dari konversi androstenedion menjadi estrone di jaringan adiposa, sehingga terjadi peningkatan produksi hormon estrogen (Feigelson and Henderson, 1996; McTiernan et al, 2003).
e. Endokrin
15
keteraturan siklus menstruasi, disebutkan dapat menurunkan resiko kanker payudara (Ernstoff et al, 1998).
Hormon estrogen endogen berperan penting dalam proses karsinogenesis pada payudara. Bentuk biologis aktif estrogen yaitu estradiol (E2), bekerja
pada epitel payudara melalui interaksi dengan reseptor estrogen (RE). Interaksi ini dapat meregulasi laju transkripsi gen-gen tertentu melalui ikatan antara kompleks hormon-reseptor dengan sekuensi DNA spesifik yang disebut Hormone Response Element (HRE). Ikatan ini menyebabkan peningkatan atau penurunan transkripsi (Feigelson and Henderson, 1996).
f. Densitas mamografi
Ziv et al di tahun 2004 melakukan penelitian mengenai kaitan densitas mamografi dengan status reseptor estrogen pada kanker payudara, diperoleh bahwa densitas mammografi sangat terkait dengan kanker payudara status ER positif maupun ER negatif. Perempuan dengan densitas lebih rendah memiliki resiko rendah mengalami kanker payudara status ER positif maupun ER negatif. Sebaliknya, perempuan dengan densitas lebih tinggi memiliki resiko tinggi mengalami kanker payudara.
g. Riwayat Tumor Jinak Payudara
Lesi jinak dengan hiperplasia atipikal memiliki resiko relatif paling tinggi sebesar 4,24 dibanding jenis lainnya.
2.1.4 Patogenesis
Kanker payudara merupakan penyakit genetik, akibat akumulasi kelainan genetik dalam jaringan. Pada penderita kanker payudara yang baru terdiagnosa dapat ditemukan adanya mutasi. Mutasi ini dapat melibatkan sedikitnya 4-6 gen regulator utama, yang berada di kromosom sel kanker payudara. Gen-gen ini berperan menjaga keseimbangan fisiologis antara proliferasi, apoptosis dan diferensiasi (Nagahata et al, 2002; Kenemans et al, 2004).
17
Gambar 2.1. Model Multi-Step Progression pada Kanker Payudara dan Gen yang Terlibat (Beckmann et al, 1997).
Gen yang terlibat dalam proses karsinogenesis: 1. Onkogen.
a. C-myc
Gen c-myc berlokasi di kromosom 8p24.3, dan akan mengkode faktor
transkripsi yang berperan dalam ekspresi protein (Nagahata et al, 2002).
Terjadi amplifikasi gen c-myc sebesar 28% dari 279 penderita kanker
payudara di Jepang, dan secara signifikan berhubungan dengan resiko
kekambuhan dan kematian (Harada et al, 1994; Deming et al, 2000). b. ErbB2
Gen ErbB2 berlokasi di kromosom17q22.1 dan mengkode protein HER-2
(human epidermal growth factor receptor 2). HER-2 merupakan reseptor
EGF2 yang menggunakan jalur tirosin kinase yang terdapat di sel. Fungsinya
adalah meregulasi pertumbuhan sel. Jika terjadi overekspresi HER-2, maka
reseptor HER-2 juga akan banyak ditemukan. Kondisi ini menimbulkan
peningkatan pertumbuhan sel dan reproduksi, serta munculnya sel-sel kanker
payudara yang agresif (Nagahata et al, 2002).
Selain kedua gen ini, terdapat juga onkogen penting lainnya yaitu EMS1
19
2. Gen tumorsupressor
Gen ini berfungsi mengendalikan proliferasi atau diferensiasi sel.
Pertumbuhan sel yang tidak normal dapat terjadi bila 1 atau beberapa gen ini
mengalami mutasi (Nagahata et al, 2002).
a. BRCA1 dan BRCA2
Mutasi kedua gen ini dijumpai di sebagian besar kasus kanker payudara terkait riwayat keluarga (Ostad and Parsa, 2011). Gen BRCA1 berlokasi di kromosom 17q21 (Hall et al, 1990), dan berperan menjaga stabilitas genomik
dan juga apoptosis (Kenemans et al, 2004). Wooster et al di tahun 1995
menemukan gen BRCA2 yang berlokasi di kromosom 13q12–13. Gen ini
mengkode beberapa protein yang terlibat dalam kontrol siklus sel, transkripsi,
dan reparasi DNA (Wooster et al, 1995; Kerr and Ashworth, 2001).
b. p53
Gen p53 mengkode protein yaitu protein p53 yang berperan di sejumlah proses seluler yaitu transkripsi gen, reparasi DNA, siklus sel, stabilitas genomik, dan apoptosis (Harris, 1996). Gen tumorsupressor p53 (TP53) terletak di kromosom 17p13.1, sangat sering ditemukan mengalami mutasi pada kanker payudara, terutama sporadis (Lerebours and Lidereau, 2002). Diperkirakan 40% kanker payudara terjadi salah satunya akibat mutasi gen
c. TPM1
Gen TPM1 terletak di kromosom 15q22.2, berperan menjaga pertumbuhan normal sel epitel payudara. Pada kanker payudara, terjadi penurunan ekspresi TPM1 (Prasad, 2004).
d. PDCD4
Gen PDCD4 terletak di kromosom 10q24. Fungsinya antara lain menekan proliferasi sel dan invasi sel, menekan transformasi neoplastik, menghambat
pertumbuhan sel tumor (Zhu et al, 2008; Lankat-Buttgereit and Goke, 2009). Ditemukan penurunan ekpresi PDCD4 pada kanker payudara ketika
dibandingkan dengan jaringan payudara normal (Wen et al, 2007).
3. Gen apoptosis
Ketidakseimbangan antara pertumbuhan sel dengan kematian sel dapat menyebabkan kanker. Sel yang seharusnya dimatikan, tidak menerima sinyal yang seharusnya. Apoptosis tidak berlangsung normal atau bahkan dihambat (Kenemans et al, 2004; Wong, 2011). Gangguan regulasi apoptosis antara lain akibat ketidakseimbangan antara protein pro-apoptosis (Bax, Bak, Bid, Bim) dengan protein anti-apoptosis (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1) (Wong, 2011).
4. Gen reseptor steroid
ERα yang berasal dari gen reseptor estrogen α (ERα), merupakan reseptor
21
anggota dari NR (Nuclear Receptor) Superfamily, dan berperan memperantarai efek hormon estrogen di berbagai proses fisiologis seperti regulasi pertumbuhan, diferensiasi, dan homeostasis (Giacinti et al, 2006). Reseptor estrogen meregulasi ekspresi gen baik melalui mekanisme dependen maupun independen estrogen, sehingga mengaktifkan transkripsi gen. Proses ini selanjutnya dapat menyebabkan sel berproliferasi (Kenemans et al, 2004). Sementara itu secara patologis, estrogen dan reseptornya memiliki peranan sangat penting dalam pembentukan dan perkembangan kanker payudara (Feigelson and Henderson, 1996; Hayashi et al, 2003). ERα meregulasi sejumlah gen (sebagai faktor transkripsi), yang akan berinteraksi dengan estrogen response elements (ERE) di sekuensi DNA. Overekspresi reseptor estrogen sering ditemukan pada kanker payudara stadium awal (Hayashi et al, 2003).
5. Gen invasi dan perlekatan sel
Dalam proses penyebaran sel-sel kanker, melibatkan sejumlah gen yang berperan untuk invasi, perlekatan sel, dan angiogenesis. Gen tersebut antara lain uPA, cathepsin D dan B, collagenase I-IV, N-CAM, integrins, E-Cadherin, FGF, dan APF (Beckman et al, 1997).
6. Faktor Pertumbuhan.
(Bhowmick et al, 2001; Lebrun, 2012). Kelompok TGF-β (dan BMP) penting dalam proses biologis antara lain pada perkembangan dan homeostasis jaringan (Davis et al, 2008). TGF-β khususnya memiliki peranan dalam regulasi proliferasi sel epitel payudara, perkembangan dan fungsi kelenjar payudara (Jhappan et al, 1993). Serta sebagai regulator penting untuk proliferasi sel, perlekatan sel, motilitas dan matriks ekstraseluler (Elliott and Blobe, 2005). TGF-ß merupakan sitokin yang disekresi, dan dapat memacu pertumbuhan epitel normal. Di sisi lain, TGF-β juga termasuk faktor yang berperan dalam proliferasi dan pertumbuhan kanker payudara, sehingga ikut berkontribusi terhadap proses karsinogenesis payudara (Bhowmick et al, 2001; Kaminska et al, 2005; Elliott and Blobe, 2005; Lebrun, 2012). Disebutkan bahwa TGF-β memiliki peran ganda yaitu dapat menekan pertumbuhan tumor atau memperantarai invasi dan metastasis sel kanker (Pardali and Moustakas, 2007).
2.1.5 Penegakan Diagnosis a. Manifestasi Klinis
Gejala dan tanda kanker payudara adalah sebagai berikut:
1. Benjolan yang baru teraba di payudara (paling sering ditemukan, dan biasanya tidak disertai rasa nyeri) atau di bawah lengan.
23
3. Perubahan di payudara dari segi ukuran, bentuk, atau kesimetrisan. 4. Kulit payudara tertarik ke dalam, kerutan, atau terdapat lekukan. 5. Iritasi di kulit payudara atau di puting.
6. Kemerahan atau bersisik di puting atau di kulit payudara.
7. Keluar cairan dari puting (selain air susu payudara)
8. Nyeri di puting payudara
9. Retraksi puting payudara (Khatib and Modjtabai, 2006; Giuliano, 2008;
Bevers et al, 2009).
b. Pemeriksaan Fisik
Pemeriksaan fisik payudara meliputi inspeksi dan palpasi:
1. Inspeksi
Inspeksi payudara meliputi ukuran dan kontur payudara, retraksi puting,
edema, kemerahan atau retraksi kulit payudara, dan kesimetrisan
payudara.
2. Palpasi
Palpasi di daerah payudara untuk memeriksa benjolan atau perubahan
lainnya, serta palpasi di daerah aksilla dan supraklavikula untuk
mengetahui ada atau tidaknya pembesaran lymph node (Giuliano, 2008).
c. Pemeriksaan Penunjang
pemeriksaan petanda atau biomarker keganasan, dan pemeriksaan secara histopatologis. Pemeriksaan pencitraan antara lain mamografi diagnostik, ultrasonografi, Computed Tomography (CT), Magnetic Resonance Imaging
(MRI), Nuclear Medicine Breast Imaging, Positron emission tomographic
screening (PET) (Khatib and Modjtabai, 2006; Giuliano, 2008; Bevers et al,
2009). Pemeriksaan sampel jaringan payudara secara histopatologis sampai saat ini masih merupakan Gold Standard dalam penegakan diagnosa tumor (Khatib and Modjtabai, 2006 ; Strumfa et al, 2012).
25
Melalui studi literatur, Duffy (2006) menyatakan bahwa biomarker di serum untuk kanker payudara hanya dapat digunakan untuk memantau respon penderita terhadap terapi dengan stadium lanjut yang tidak dapat dievaluasi menggunakan kriteria konvensional. Dengan berbagai keterbatasan biomarker yang telah ada, dibutuhkan biomarker lain yang diharapkan dapat menjadi marker untuk diagnosis, prognosis, maupun terapi.
2.1.6 Klasifikasi Kanker Payudara
Karsinoma musinus (mucinous)
Tumor neuroendokrin
Glycogen-rich clear cell carcinoma
b. Stadium
Stadium kanker payudara dapat ditentukan berdasar hasil pemeriksaan klinis dan patologis. Sistem yang umum digunakan untuk menentukan stadium kanker payudara adalah sistem TNM dari The American Joint Committee on Cancer (AJCC), yaitu berdasarkan tingkatan T, N, dan M: 1. Huruf T yang disertai angka 0-4 menyatakan ukuran tumor dan penyebaran ke
kulit atau dinding dada. T dengan angka yang besar menyatakan ukuran tumor yang besar dan atau penyebaran yang meluas ke jaringan di sekitar payudara. 2. Huruf N disertai angka 0-3 menyatakan ada tidaknya penyebaran kanker ke
kelenjar limfe dekat payudara. Bila sudah menyebar, seberapa banyak kelenjar limfe yang terkena.
3. Huruf M yang disertai angka 0 atau 1 menyatakan ada tidaknya penyebaran kanker ke organ-organ lain seperti paru atau tulang (American Cancer Society, 2013).
27
Tabel 2.1.Klasifikasi Kanker Payudara Berdasarkan Sistem TNM dari AJCC Edisi Keenam (Singletary and Connolly, 2006).
Tabel 2.2. Kombinasi TNM ke dalam Stage Grouping (Giuliano, 2008).
29
Tabel 2.3. Metode Penilaian Grading Histopatologis Semikuantitatif pada Kanker Payudara Menurut Elston dan Ellis (Tavassoli and Devilee, 2003).
Masing-masing komponen dinilai terpisah dan diberi skor 1-3. Kemudian skor dari setiap komponen dijumlahkan sehingga diperoleh skor total 3–9. Selanjutnya skor total dimasukkan ke dalam kategori grade untuk diketahui potensi keganasannya:
a. Grade I (derajat keganasan rendah) : skor 3-5; b. Grade II (derajat keganasan sedang) : skor 6-7; c. Grade III (derajat keganasan tinggi) : skor 8-9.
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk melihat korelasi antara grade histopatologis kanker payudara dengan prognosis. Sebagaimana diketahui bahwa penilaian prognosis penting untuk memperkirakan tingkat kelangsungan hidup (survival) penderita. Hasilnya adalah penderita kanker payudara dengan grade I (diferensiasi baik) memiliki prognosis yang lebih baik dibanding grade II (diferensiasi sedang) atau grade III (diferensiasi buruk) (Bloom and Richardson, 1957; Elston and Ellis, 1991; Daglar et al, 2010). Kombinasi grade histopatologis dengan ukuran tumor dan lymph node stage, yang disebut Nottingham Prognostic Index, digunakan untuk pemilihan terapi kanker sesuai kondisi penderita atau per individu (Elston and Ellis, 1991; Daglar et al di tahun 2010; Rakha et al, 2010). Sementara itu dalam hal penentuan prognosis menurut Daglar et al di tahun 2010, nilai prognosis dari komponen grade histopatologis lebih tinggi dibanding 2 komponen lain yaitu ukuran tumor dan keterlibatan lymph node (Daglar et al, 2010).
31
lain dalam menilai prognosis yang bersifat kuantitatif dan memiliki reproduksibilitas cukup tinggi sehingga dapat melengkapi pemeriksaan grade histopatologis.
Berbagai penelitian saat ini mengenai mekanisme molekular yang mendasari atau mempengaruhi terjadinya kanker payudara, telah memberikan petunjuk adanya molekular baru yang mungkin berpotensi sebagai biomarker baik untuk diagnosis awal, prognosis, maupun untuk target terapi (Heneghan, 2012). Fokus penelitian semakin berkembang mengarah pada RNA non coding, sebagai regulator utama genom manusia dan berperan di banyak jenis penyakit pada manusia (Ardekani and Naeini, 2010). Salah satu jenis RNAnon coding adalah miRNA.
2.2 MicroRNA (MiRNA) 2.2.1 Definisi
lin-14 (regulasi negatif) melalui interaksi RNA-antisense RNA. Sehingga protein lin-14 menurun dan mengganggu perkembangan larva cacing (Lee et al, 1993).
Lagos-Quintana et al di tahun 2001 berhasil mengidentifikasi 21 miRNA pada manusia, dan berbagai miRNA ini disingkat sebagai miR-1 sampai miR-33. Agar dapat berfungsi, miRNA harus diko-ekspresikan dengan targetnya yaitu mRNA (Lagos-Quintana et al, 2001).
2.2.2 Fungsi
MiRNA bekerja pada target mRNA secara spesifik, melalui interaksi komplementer antisense di daerah 3’ UTR (untranslated regions) (Bartel, 2004). Satu miRNA dapat meregulasi beberapa mRNA, dan satu mRNA dapat menjadi target beberapa miRNA yang berbeda-beda (Fu et al, 2011). Satu miRNA dapat memiliki sejumlah besar target sehingga mempengaruhi ratusan ekspresi protein (Calin and Croce, 2006; Cho, 2007; Ostad and Parsa, 2011).
33
2.2.3 Biogenesis
Penelitian Lagos-Quintana et al (2001) menyatakan bahwa RNA yang lebih panjang (70 nukleotida) merupakan prekursor untuk RNA yang lebih pendek (22 nukleotida), dimana RNA yg lebih pendek ini kemudian diketahui termasuk anggota kelompok miRNA. Pembentukan miRNA meliputi beberapa tahapan dan spesifik di tingkat seluler (Hastings and Krainer, 2001).
Gambar 2.3. Biogenesis MicroRNA (Pal and Pal, 2013).
2.2.4 Disregulasi Fungsi
Adanya kelainan atau disfungsi pada miRNA berupa mutasi, delesi, peningkatan ekspresi, atau penurunan ekspresi dapat mengakibatkan berbagai penyakit (Lu et al, 2008), terutama penyakit jantung dan kanker (Naeini and Ardekani, 2009; Ikeda and Pu, 2010). Selain itu, miRNA juga terkait penyakit lainnya yaitu inflamasi, gangguan perkembangan saraf, autoimun, liver, kulit, dan otot rangka (Ardekani and Naeini, 2010).
2.2.5 Peranan MiRNA dalam Keganasan
35
sehingga fungsi miRNA ini sebagai supresor menurun. Akibatnya terjadi overekspresi gen Bcl2 dan gen lain yang berperan dalam proses tumorigenesis (Calin and Croce, 2006).
Zhang et al di tahun 2009 menyatakan bahwa miRNA memiliki peran regulator penting dalam proses pembentukan tumor. Penemuan perubahan profil ekspresi miRNA menimbulkan dugaan bahwa miRNA memainkan peran sebagai onkogen atau gen tumorsupressor (Iorio et al, 2005; Naeini and Ardekani, 2009). Berdasarkan studi literatur yang dilakukan Naeini dan Ardekani di tahun 2009, diperoleh beberapa miRNA yang terkait dengan keganasan pada manusia seperti terlihat pada tabel 2.4.
Tabel 2.4. MiRNA yang Terkait dengan Keganasan pada Manusia (Naeini and Ardekani, 2009).
2.2.6 Bahan Pemeriksaan Ekspresi miRNA
Berbagai penelitian yang telah dilakukan untuk identifikasi dan analisis ekspresi miRNA, menggunakan beberapa jenis bahan atau sampel penelitian antara lain dari jaringan (baik jaringan yang dibekukan maupun yang diawetkan dengan formalin), sel, sirkulasi, dan cairan tubuh. Khususnya pada sampel jaringan yang diawetkan menggunakan formalin dan dibenamkan dalam parafin (FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded) merupakan sampel yang sangat bagus untuk digunakan dalam penelitian retrospektif (Doleshal et al, 2008; Hoefig et al, 2008). Menurut Szafranska et al (2008), analisis ekspresi miRNA dari sampel FFPE memiliki reprodusibilitas dan akurasi yang baik, bahkan dari sampel yang berusia di atas 11 tahun. Perbedaan waktu dilakukannya fiksasi menggunakan formalin tidak mengubah stabilitas miRNA (Xi et al, 2007).
2.3MicroRNA-21 (MiR-21) 2.3.1Lokasi Gen MiR-21
37
Gambar 2.4. Lokasi Gen MiR-21 (Kumarswamy et al, 2010).
2.3.1 Fungsi
MiR-21 berperan dalam proses proliferasi sel, migrasi, invasi, mencegah apoptosis sel-sel kanker (Iorio et al, 2005; Cho, 2007; Jazbutyte and Thum, 2010). Gen targetnya diduga merupakan kelompok gen tumorsupresor (Iorio et al, 2005).
2.3.2Regulasi Ekspresi
Berdasar hasil penelitian Davis et al (2008), sinyal TGF-β dapat menyebabkan peningkatan ekspresi miR-21 pada sel kanker payudara. Sinyal TGF-β memicu peningkatan ekspresi miR-21 matur di tahap post-transkripsi, dengan memacu pemrosesan transkrip primer (pri-miR-21) menjadi prekursor miR-21 (pre-miR-21) oleh enzim Drosha. Terjadi peningkatan ekspresi pre-miR-21, sementara ekspresi pri-miR-21 tidak berubah. TGF-β mampu meningkatkan ekspresi miR-21 melalui jalur transduksi sinyal SMAD yang merangsang perubahan pri-miR-21 menjadi pre-miR-21, dan selanjutnya menghasilkan miR-21 matur (Davis et al, 2008; Davis et al, 2010).
2.3.2Disregulasi Ekspresi
Kelainan ekspresi miR-21 yang bersifat onkogenik, disebabkan oleh lokasi gen miR-21 di regio genomik yang mengalami amplifikasi sehingga terjadi overekspresi pada kanker payudara (Calin and Croce, 2006). Selain itu, akibat sinyal TGF-β yang dapat memicu invasi dan metastasis sel kanker melalui regulasi sintesis miR-21, sehingga miR-21 akan bekerja pada targetnya yang merupakan gen tumorsupresor yaitu PDCD4, Maspin, dan TPM1 (Frankel et al, 2008; Lu et al, 2008; Zhu et al, 2008).
2.4 Korelasi MiR-21 dengan Grade Histopatologis Kanker Payudara
39
sampel normal. Hasil penelitian mereka adalah sebagian miRNA sangat konsisten mengalami deregulasi pada kanker payudara, 2 miRNA di antaranya yaitu miR-21 dan miR-155 mengalami peningkatan ekspresi. Di tahun 2008, Yan et al menginvestigasi profil ekspresi miRNA secara global pada jaringan kanker payudara dibandingkan dengan jaringan payudara normal. Ditemukan 9 miRNA yang mengalami peningkatan ekspresi, dan miR-21 merupakan miRNA yang peningkatan ekspresinya sangat signifikan. Kemudian Qian et al di tahun 2009 melakukan penelitian mengenai pengaruh ekspresi miR-21 terhadap perkembangan kanker payudara, dan salah satu parameter yang diteliti adalah grade histopatologis. Hasil menunjukkan bahwa ekspresi miR-21 memiliki korelasi signifikan dengan grade tumor, dan tingginya ekspresi miR-21 diduga memfasilitasi progresi kanker payudara. Selain itu, Qian et al juga menemukan ekspresi miR-21 berhubungan signifikan dengan jenis histologis tumor, yaitu ekspresi miR-21 paling tinggi pada jenis duktal, dibanding pada jenis lainnya (lobular, mix, dan lain-lain).
banyak gen, maka miR-21 disebut sebagai Oncomir yang memiliki peran tidak hanya untuk pertumbuhan tumor tetapi juga dalam hal invasi dan metastasis tumor.
Terkait dengan peranan miR-21 terhadap pertumbuhan tumor, invasi, dan metastasis, dilakukan penelitian mengenai hubungan antara miR-21 dengan parameter klinikopatologis dan prognosis. Salah satu dari parameter tersebut adalah grade histopatologis. Lee et al di tahun 2011 menemukan bahwa peningkatan ekspresi miR-21 terkait dengan grade histopatologis yang lebih tinggi (high grade). Kemudian Hafez et al (2012) meneliti hubungan antara ekspresi miR-21 dengan ekspresi gen terkait metastasis pada penderita kanker payudara, hasilnya antara lain menunjukkan bahwa miR-21 berhubungan signifikan dengan meningkatnya grade histopatologis. Pada sampel kanker payudara dengan grade III, level ekspresi miR-21 sebesar 2 kali lipat dibanding sampel kanker grade I atau grade II.
MiR-21 berperan dalam proses proliferasi sel, migrasi, invasi, mencegah apoptosis sel-sel kanker (Iorio et al, 2005; Jazbutyte and Thum, 2010). MiR-21 dapat memicu proliferasi dan transformasi sel payudara melalui penekanan translasi protein tumorsupressor PDCD4, sehingga peran PDCD4 dalam mengendalikan proliferasi dan transformasi sel neoplasia menurun (Cmarik et al, 1999; Lu et al, 2008).
41
2.6 Kerangka Konsep
Gambar 2.6. Kerangka Konsep
Keterangan : *yang diteliti PDCD4 ↓
Aktifitas Transkripsi Gen miR-21 ↑
43 BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Desain penelitian yang digunakan adalah cross-sectional dengan jenis analitik korelatif.
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Pengambilan data subjek penelitian, data hasil operasi mastektomi, dan pemeriksaan imaging (foto rontgen, USG, dan hasil lainnya) dari rekam medik, serta pengambilan sampel blok parafin (FFPE) dari hasil operasi mastektomi dilakukan di Rumah Sakit Haji Adam Malik Medan. Pemeriksaan ekspresi miR-21 dengan metode Real Time qPCR dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler FK UGM. Penelitian dilakukan dari bulan Mei hingga Agustus 2014.
3.3 Populasi dan Sampel Penelitian
berasal dari 1 subjek penderita kanker payudara tipe duktal invasif. Proses pemilihan ini dilakukan terhadap seluruh sampel penelitian dari subjek lainnya.
Kriteria Inklusi :
Blok parafin jaringan kanker payudara dari perempuan yang terdiagnosa
kanker payudara tipe duktal invasif.
Jaringan kanker payudara diperoleh dari hasil operasi mastektomi.
Penghitungan besar sampel dalam penelitian ini menggunakan rumus besar sampel untuk penelitian analitik korelatif. Rumusnya adalah:
(Dahlan, 2013) n= 50,51 sampel ~ 51 sampel
Keterangan :
α : kesalahan tipe I = 5% = 0,05
Zα : nilai distribusi normal baku α (tabel Z) pada α = 5% adalah Zα 1 arah = 1,645. β : kesalahan tipe II = 10% = 0,1
Zβ : nilai distribusi normal baku β (tabel Z) pada β = 10% adalah Zβ 1 arah = 1,28.
45
3.4 Variabel yang Diamati
3.4.1 Variabel Independen:
1. MiR-21 di jaringan kanker payudara. 3.4.2 Variabel Dependen:
1. Grade histopatologis jaringan kanker payudara.
Penelitian dilakukan setelah mendapat persetujuan Majelis Komite Etik Penelitian (Ethical Clearance)
Penentuan sampel penelitian secara purposive sampling (n = 51)
Pengumpulan data melalui pencatatan data subjek penelitian, hasil pemeriksaan penunjang, serta data lainnya yang diperlukan dari rekam medik.
Isolasi RNA total dari sampel FFPE
Sintesis cDNA dari RNA hasil isolasi
Analisis miR-21 menggunakan qRT-PCR
Analisis data selanjutnya dilakukan dengan menggunakan Biorad CFX Manager TM Software yang disediakan oleh alat Real-Time qPCR untuk
mendapatkan nilai Cq. Spektrofotometri 3.6 Kerangka Operasional
Gambar 3.1. Kerangka Operasional
3.7 Alat dan Bahan Penelitian 3.7.1 Alat
47
3.7.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah blok parafin (FFPE) jaringan kanker payudara hasil operasi mastektomi, tabung sentrifuga 1,5 mL, xylene, tips filter, ethanol 96-100%, buffer RF, Proteinase K, buffer RB, spin column CR3, collection tubes (1,5 mL), DNAse I, buffer RDD, buffer RW1, buffer RW, RNAse-free ddH2O, dH2O, 5 x reaction buffer, nuclease-free water, spike in sintetik
(UniSp6), mixed enzyme, alumunium foil, PCR tube, SYBR Green master mix, primer hsa-miR-21, primer UniSp6, qPCR tube, masker, sarung tangan, dan tissue.
3.8 Prosedur Kerja
a. Isolasi RNA Total dari Blok Parafin (FFPE) hasil operasi mastektomi (berdasarkan protokol Tiangen RNAprep Pure FFPE Kit):
1. Iris blok parafin (FFPE) jaringan kanker payudara dengan ketebalan 7 μm sebanyak 2-8 irisan menggunakan mikrotom, kemudian irisan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga 1,5 mL.
2. Tambahkan Xylene 1 mL, vortex selama 10 detik, kemudian sentrifuga dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit pada suhu ruang (20-250 C). 3. Supernatan diaspirasi secara perlahan dengan pipet (jangan sampai pellet
ikut teraspirasi).
5. Supernatan diaspirasi secara perlahan dengan pipet (jangan sampai pellet ikut teraspirasi).
6. Biarkan tutup tabung terbuka, inkubasi pellet dalam tabung selama 10 menit pada suhu ruang sampai sisa etanol menguap seluruhnya.
7. Tambahkan Buffer RF 200 μL dan Proteinase K 10 μL ke dalam tabung berisi pellet, kemudian vortex.
8. Inkubasi tabung dalam waterbath pada suhu 550 C selama 15 menit, kemudian pada suhu 800 C selama 15 menit.
9. Sentrifuga dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang, kemudian supernatan dipindahkan ke tabung sentrifuga baru (RNAse-free). 10. Tambahkan Buffer RB 220 μL ke dalam tabung berisi supernatan tersebut,
kemudian vortex.
11.Tambahkan Ethanol 96-100% sebanyak 660 μL, kemudian vortex.
12. Pindahkan campuran tersebut sebanyak 700 μL ke dalam Spin Column CR3 (Spin Column CR3 dipasang di dalam tabung koleksi), sentrifuga selama 1 menit pada kecepatan 12.000 rpm, buang cairan yang ada dalam tabung koleksi, kemudian pasang kembali Spin Column CR3 ke dalam tabung koleksi.
49
dalam tabung koleksi, kemudian pasang kembali Spin Column CR3 ke dalam tabung koleksi.
14.Siapkan larutan kerja DNAse I dengan cara masukkan 10 μL larutan stok DNAse I ke dalam tabung RNAse-free centrifuge yang baru, kemudian tambahkan 70 μL Buffer RDD, campurkan perlahan.
15. Masukkan 80 μL larutan kerja DNAse I ini ke bagian tengah Spin Column CR3, inkubasi pada suhu ruang selama 15 menit.
16.Tambahkan Buffer R→1 sebanyak 500 μL ke dalam Spin Column CR3, sentrifuga dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit, kemudian buang cairan yang ada di dalam tabung koleksi, dan pasang kembali Spin Column CR3 ke dalam tabung koleksi.
17.Tambahkan Buffer RW sebanyak 500 μL ke dalam Spin Column CR3, inkubasi dahulu selama 2 menit pada suhu ruang, kemudian sentrifuga selama 1 menit pada kecepatan 12.000 rpm.
18.Buang cairan di dalam tabung koleksi, dan pasang Spin Column CR3 ke dalam tabung koleksi.
19.Ulangi tahap 17-18.
beberapa menit untuk mengeringkan membran, sampai membran benar-benar kering.
21.Tempatkan Spin Column CR3 ke dalam tabung sentrifuga 1,5 mL yang baru, kemudian tambahkan 50 μL RNAse-free ddH2O ke bagian tengah
membran. Tutup tabung, inkubasi pada suhu ruang selama 2 menit, kemudian sentrifuga dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit sehingga diperoleh RNA Total.
22.Buang Spin Column CR3.
23.Tutup tabung sentrifuga 1,5 mL yang berisi RNA Total, dan simpan dalam lemari pendingin suhu -800.
b. Spektrofotometri
1. Masukkan dH2O sebanyak 100 μL ke dalam kuvet RNA untuk
membersihkan kuvet.
2. Pilih mode RNA, kalibrasi alat dengan memasukkan kuvet RNA berisi dH2O, tekan “Set Ref”.
51
7. Ambil tabung baru sentrifuga 1,5 mL, masukkan dH2O sebanyak 98 μL,
dan tambahkan sampel RNAsebanyak 2 μL.
8. Masukkan campuran tersebut sebanyak 100 μL ke dalam kuvet RNA. 9. Masukkan kuvet RNA tersebut, tekan “Sample”.
10.Tunggu bunyi pertama, masukkan kuvet. 11.Tunggu hingga bunyi kedua, keluarkan kuvet. 12. Untuk menilai absorbansi, tekan “abs”.
13.Untuk menilai rasio, tekan “ratio”.
14.Untuk menilai konsentrasi RNA dari sampel, tekan “Conc”. 15.Keluarkan sampel dari kuvet RNA hingga bersih.
16.Lakukan kalibrasi alat dengan memasukkan dH2O sebanyak 100 μL ke
dalam kuvet RNA, tekan “Set Ref”. 17.Tunggu bunyi pertama, masukkan kuvet. 18.Tunggu hingga bunyi kedua, keluarkan kuvet. 19.Matikan alat.
c. Sintesis cDNA dari RNA hasil isolasi dengan RT-PCR (menggunakan Kit Sintesis cDNA dari miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR):
3. Biarkan mencair secara perlahan, kemudian homogenisasi dengan vortex dan spindown.
4. Ambil 5x Reaction Buffer, Nuclease-free water, dan Spike in (UniSp6, sebagai kontrol internal terhadap miRNA yang menjadi target) dari lemari pendingin suhu -200 C.
5. Cairkan 5x Reaction Buffer, Nuclease-free water, dan Spike in (UniSp6) pada suhu ruang.
6. Homogenisasi dengan vortex, kemudian spindown. 7. Letakkan dalam wadah tabung yang dialasi icepack.
8. Ambil enzyme mix dari lemari pendingin suhu -200 C, homogenisasi dengan ketuk tabungnya secara perlahan, kemudian spindown.
9. Pembuatan dan pembagian Master Mix dilakukan dengan mencampur bahan-bahan seperti tabel di bawah:
Bahan Volume (μL)
5x Reaction Buffer 2
Nuclease-free water 4,5
Spike in (UniSp6) 0,5
Enzyme mix 1
Total 8
53
11.Masukkan Master Mix ke dalam tabung PCRsebanyak 8 μL (per reaksi). 12.Masukkan sampel RNA sebanyak 2 μL ke dalam tabung PCR (yang berisi
Master Mix), kemudian spindown.
13.Masukkan tabung tersebut ke dalam Thermal Cycler Biorad C1000, dan jalankan sesuai program:
Suhu Waktu
420 C 60 menit
950 C 5 menit
40 C ~
14.Hasil sintesis cDNA disimpan dalam lemari pendingin suhu -800 C.
d. Analisis miR-21 dengan qRT-PCR
Analisis miR-21 dilakukan dengan menggunakan alat real time-PCR dan kit miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR, LNATM PCR primers set
dan SYBR Green master mix. Digunakan primer miR-21 (hsa-miR-21), dan primer UniSp6 (sebagai kontrol internal terhadap miR-target).
1. Keluarkan cDNA dari lemari pendingin.
5. Encerkan cDNA dengan RNAse-free water yaitu 5 μL cDNA dengan 395 μL RNAse-free water di dalam tabung sentrifuga 1,5 mL.
6. Homogenisasi dengan vortex kemudian spindown. 7. Letakkan tabung dalam wadah yang dialasi icepack.
8. Ambil SYBR Green Master Mix, Primer set miR-21, dan Primer Spike in (Sp6) dari lemari pendingin suhu -200 C.
9. Homogenisasi SYBR Green dengan mengetuk tabungnya perlahan (tabung SYBR Green harus tetap dialasi dengan aluminium foil, dan tidak boleh terpapar lama dengan sinar matahari).
10.Homogenisasi primer miR-21 dan primer Spike in (Sp6) dengan Thawing, vortex, kemudian spindown.
11.Buat campuran Master Mix untuk hsa-miR-21 dan kontrol Spike in (Sp6).
12. Campurkan 5 μL SYBR GreenMaster Mix dengan 1 μL PCR Primer Mix
(untuk 1 reaksi, dan untuk masing-masing campuran dibedakan). 13.Homogenisasi dengan vortex dan spindown.
14.Masukkan campuran tersebut ke dalam masing-masing tabung qPCR sebanyak 6 μL.
55
Denaturasi 95 0C, 10 menit Amplifikasi 40 siklus 95 0C, 10 detik
60 0C, 1 menit Ramp. Rate 1,6 0C/s Optical Read
Analisis kurva leleh pilih “Ya”
16.Tutup tabung qPCR, beri identitas pada tabung, kemudian masukkan tabung qPCR ke dalam alat Biorad CFX 96, atur program Real-Time qPCR sebagai berikut:
3.9 Jadwal Penelitian
No Kegiatan Jan-Feb Mar Apr Mei-Agt Sept Okt Nov
1 Persiapan V V
2 Seminar proposal V
3 Pelaksanaan penelitian
V V
4 Analisa hasil V
5 Penulisan laporan tesis
V
