PERBANDINGAN METODE PENGUJIAN
E. coli
SECARA
KONVENSIONAL DAN CEPAT PADA SAMPEL AIR
DWI KUSUMA INDRIANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TUGAS AKHIR
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa Tugas Akhir yang berjudul: “Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkann dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Tugas Akhir ini.
Bogor, Januari 2010
ABSTRACT
DWI KUSUMA INDRIANI. Comparison of Conventional and Rapid Methods for E.coli Testing in Water Sample. Under direction of RATIH DEWANTI-HARIYADI and SUTRISNO KOSWARA.
Water is very important in food production, either as raw material for food processing, ice production, or for sanitation purposes. Water for food processing should meet the existing regulation for drinking water quality. According to the Guidelines for Drinking Water Quality World Health Organization and Keputusan Menteri Kesehatan No. 907/2002 the number of Escherichia coli and fecal coliform should be negative per 100 ml sample, consecutively. E. coli testing with conventional MPN methods needs 5-7 days thus it is not appropriate for food products with short expiry date. The aims of this study were to compare the performance of conventional and rapid methods used for testing of E.coli in process water and evaluate the implication of the application of rapid methods in a yogurt industry.
The sample used in this study was process water from PT Yummy Food Utama, a yogurt and cheese industry. Total 30 samples of one litre each was taken from the process water tank outlet from 3 different days as a replication. The culture media used for the conventional methods were according to MPN of FDA/BAM and SNI methods. The culture media used for the rapid methods were Fluorocult LMX Broth (MPN), Chromocult Coliform Agar (TVC), and Readycult Coliform 100 (P/A).
The result of this study showed that rapid methods reduced the testing time of E.coli from 5-7 days to 1-2 days only with an equal performance to conventional method but more convenience to do since it reduce of tubes and petridishes needed from 195 to 2-15 only. Even the rapid media Fluorocult LMX Broth showed the best recovery rate among other medias tested. Besides, rapid methods application saved the total cost by 71% with Readycult® Coliform 100 and Fluorocult® LMX Broth; 82% with Chromocult® Coliform Agar; and the possibility to increase the production capacity per month by 22%.
ABSTRAK
DWI KUSUMA INDRIANI. Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air. Dibimbing oleh RATIH DEWANTI-HARIYADI dan SUTRISNO KOSWARA
Air sangat penting dalam industri pangan, baik untuk bahan baku, pembuat es, maupun untuk fungsi pembersihan. Air untuk proses pengolahan pangan harus sesuai dengan kualitas air minum sesuai dengan peraturan yang berlaku. Menurut Guidelines for Drinking Water Quality World Health Organization and Keputusan Menteri Kesehatan No. 907/2002 jumlah Escherichia coli dan koli fekal harus negatif per 100 ml sampel secara bersama-sama. Pengujian E. coli dengan metode APM konvensional memerlukan waktu 5-7 hari karena itu tidak sesuai untuk produk pangan dengan masa pakai yang pendek. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan performa dari metode konvensional dan cepat dalam pengujian E.coli di sampel air; dan mengevaluasi pengaruh dari penerapan metode cepat tersebut di industri yogurt.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah air proses dari PT Yummy Food Utama, suatu pabrik yogurt dan keju. Total 30 sampel masing-masing satu liter diambil dari kran tanki air proses dari 3 hari yang berbeda sebagai ulangan. Media kultur yang digunakan adalah media sesuai dengan metode APM dari FDA/BAM dan SNI. Media kultur yang digunakan untuk metode cepat adalah Fluorocult LMX Broth (APM), Chromocult Coliform Agar (ALT), Readycult Coliform 100 (P/A).
Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa metode cepat mengurangi waktu pengujian E.coli dari 5-7 hari menjadi hanya 1-2 hari, dengan hasil yang sebanding tetapi lebih mudah dikerjakan karena penggunaan tabung dan cawan petri yang semula 195 buah menjadi hanya 2-15 buah saja. Bahkan media cepat Fluorocult LMX Broth memperlihatkan hasil recovery rate terbaik diantara media yang diuji. Selain itu, penerapan metode cepat dapat menghemat biaya total sampai 71% dengan media Readycult® Coliform 100 dan Fluorocult® LMX Broth; 82% dengan Chromocult® Coliform Agar; dan kemungkinan meningkatkan kapasitas produksi per bulan 22%.
Kata Kunci : Escherichia coli, kromogenik fluorogenik, metode cepat
RINGKASAN
DWI KUSUMA INDRIANI. Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air. Dibimbing oleh RATIH DEWANTI-HARIYADI dan SUTRISNO KOSWARA
Air sangat penting untuk industri pangan, baik untuk bahan baku, bahan pembuat es, maupun untuk fungsi pembersihan. Air untuk proses pengolahan pangan harus sesuai dengan kualitas air minum menurut peraturan yang berlaku. Menurut Guidelines for Drinking Water Quality World Health Organization and Keputusan Menteri Kesehatan No. 907/2002 jumlah Escherichia coli dan koli fekal harus negatif per 100 ml sampel secara bersama-sama. E.coli adalah indikator keberadaan patogen enterik maupun tingkat sanitasi suatu proses/produk. Pengujian E.coli secara konvensional menggunakan metode Angka Paling Mungkin memerlukan waktu 5-7 hari. Kebanyakan industri pangan terutama untuk produk pangan dengan masa pakai pendek, memerlukan prosedur pengujian yang cepat dan mudah dilakukan karena jumlah sampel yang sangat banyak. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan performa dari metode konvensional dan cepat dalam pengujian E.coli di sampel air; dan mengevaluasi pengaruh dari penerapan metode cepat tersebut di industri yogurt.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah air proses dari PT Yummy Food Utama dengan produk yogurt dan keju. Total 30 buah sampel masing-masing satu liter diambil dari kran tanki air proses pada tiga hari yang berbeda sebagai ulangan. Media kultur yang digunakan untuk metode konvensional sesuai dengan metode APM dari FDA/BAM dan SNI. Metode cepat menggunakan Fluorocult LMX Broth (APM), Chromocult Coliform Agar (ALT), dan Readycult Coliform 100 (P/A). Biakan murni Escherichia coli ATCC 25922 digunakan untuk kontrol positif dan perlakuan cemaran. Penelitian ini menggunakan tiga konsentrasi cemaran bakteri dengan konsentrasi akhir pada sampel adalah 4 cfu/ml (cemaran rendah), 40 cfu/ml (cemaran sedang), dan 80 cfu/ml (cemaran tinggi).
Penelitian ini membandingkan kinerja antara metode APM konvensional dengan tiga metode cepat untuk parameter hasil pertumbuhan (recovery rate), total waktu pengujian, dan biaya biaya investasi media awal, biaya laboratorium (dari komponen biaya media per test, tenaga kerja, depresiasi, dan operasional lab), biaya gudang (dari komponen biaya tenaga kerja, depresiasi, dan operasional gudang), dan penghematan yang bisa dilakukan (biaya media, biaya gudang, bunga pinjaman bank, biaya laboratorium). Uji anova dilakukan untuk melihat perbandingan hasil pertumbuhan antara ketiga ulangan yang dilakukan pada hari yang berbeda, antara kedua metode APM dan antara metode APM konvensional dengan ALT cepat.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa dengan metode APM, kontrol negatif dan sampel yang tidak dicemari mengandung <1.8 per 100 ml sementara standar air bersih untuk koliform maupun E.coli adalah negatif per 100 ml sampel (EC, 1998; Depkes, 2007; WHO, 2004). Dengan konsentrasi bakteri yang sedang dan tinggi metode ini memberikan hasil APM >1600 sehingga tidak mencerminkan nilai sebenarnya. Hasil di kedua metode APM (LST dan LMX) sebanding kecuali konsentrasi bakteri rendah dimana LMX memberikan hasil lebih tinggi, akan tetapi hasil analisis dengan anova menunjukkan tidak ada beda nyata baik antar ulangan dalam perlakuan yang sama maupun antar APM konvensional dan cepat. Kedua metode cepat lainnya yaitu ALT cepat dan P/A cepat juga memberikan hasil yang sama dengan APM konvensional maupun APM cepat. Perhitungan nilai recovery rate untuk ketiga metode kuantitif dari urutan tertinggi adalah media LMX, LST dan CCA dengan nilai 122%, 70%, dan 89%. Readycult tidak dihitung karena memberikan hasil kualitatif, akan tetapi pada dasarnya media yang digunakan adalah LMX.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa total waktu pengujian metode APM konvensional 5-7 hari, memerlukan 195 buah tabung, dan memerlukan dua suhu inkubasi yang berbeda yaitu 35oC dan 44.5oC. Ketiga metode cepat jauh lebih sederhana karena memerlukan total waktu 1-2 hari, memerlukan 15 tabung untuk APM dan 2 cawan untuk ALT, dan inkubasi hanya dilakukan di 35oC.
Hasil perhitungan biaya investasi untuk pembelian media awal uji E.coli yang terbesar adalah metode APM konvensional Rp 10.813.000 sedangkan untuk uji koliform dan E.coli sebesar Rp 11.899.000 karena perlu tambahan media BGLB. Ketiga metode cepat yang bisa menguji koliform dan E.coli sekaligus memerlukan investasi media lebih rendah yaitu metode APM cepat Rp 8.119.000, metode ALT cepat Rp 4.978.000 dan investasi terkecil adalah metode P/A cepat Rp 1.309.000. Dari perhitungan biaya media per test maka yang terbesar adalah metode APM konvensional Rp 200.763, metode P/A cepat Rp 60.570, metode APM cepat Rp 57.218, dan yang terkecil metode ALT cepat Rp 7.530. Apabila dilakukan duplo maka biaya per test menjadi dua kali lipat. Apabila hasilnya koliform negatif maka biaya media terendah adalah ALT CCA kemudian APM konvensional, APM cepat dan P/A cepat.
Hasil perhitungan biaya laboratorium menunjukkan bahwa ketiga metode cepat memerlukan biaya Rp 84.309 (inkubasi 24 jam) atau Rp 168.619 (inkubasi 48 jam). Metode APM konvensional memerlukan biaya Rp 421.545 (5 hari) atau Rp 590.166 (7 hari). Total biaya gudang pada ketiga metode cepat Rp 186.803 (24 jam) atau Rp 373.607 (48 jam) sementara metode APM konvensional Rp 934.015 (5 hari) atau Rp 1.307.624 (7 hari). Penghematan total biaya yang diperoleh dengan mengganti metode konvensional dengan metode cepat untuk pengujian E.coli dalam air proses di PT Yummy Food Utama dengan model biaya produksi yogurt buah 25 adalah Rp 2.764.778 untuk Readycult®, Rp 2.791.593 untuk Fluorocult® LMX Broth dan Rp 3.189.102 untuk Chromocult® Coliform Agar, sementara kenaikan kapasitas produksi per bulan dengan pemakaian metode cepat adalah 22% atau 22 batch dari 18 batch dengan lima hari kerja seminggu.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2010
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
PERBANDINGAN METODE PENGUJIAN
E. coli
SECARA
KONVENSIONAL DAN CEPAT PADA SAMPEL AIR
DWI KUSUMA INDRIANI
Tugas Akhir
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Profesi Teknologi Pangan
Pada Program Magister Profesi Teknologi Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Tugas Akhir : Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air
Nama : Dwi Kusuma Indriani NIM : F252050045
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir Ratih Dewanti-Hariyadi, MSc. Ir. Sutrisno Koswara, MSi Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Magister Profesi Teknologi Pangan
Dr. Ir. Lilis Nuraida, MSc Prof. Dr Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas berkat rakhmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan mulai bulan Mei 2008 ini adalah ”Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Ir Ratih Dewanti-Hariyadi, MSc. selaku ketua komisi pembimbing dan Ir. Sutrisno Koswara, MSi. sebagai anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan saran. Ucapan terima kasih juga penulis berikan kepada Ibu Dra. Sumaria Sudian Apt. Beserta seluruh staff Bagian Mikrobiologi Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional atas izin penggunaan laboratorium, masukan dan bimbingan yang diberikan. Disamping itu penghargaan penulis berikan kepada Ibu Ir. Eny Zulaichah, Ibu Ir. Sri Nurfiani, Bapak Zainul Ichwan dan seluruh staff PT Yummy Food Utama atas ijin dalam pengambilan sampel, penggunaan laboratorium dan data pendukung lainnya.
Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Direktur Chemical Division PT Merck Tbk. yang telah memberikan beasiswa serta kelonggaran waktu selama penulis menempuh pendidikan. Yang terakhir ucapan terima kasih kepada ayah serta seluruh keluarga atas segala doa dan dorongannya.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini jauh dari sempurna, sehingga pada kesempatan ini juga penulis mengharapkan kritik dan saran membangun demi menyempurnaannya. Jauh dalam lubuk hati yang paling dalam, penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pati (Jawa Tengah) tanggal 21 Desember 1966 dari Ayah Drs. Soegono dan Ibu S. Haryati BA (Almarhumah). Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara.
Tahun 1985 penulis lulus dari SMA Negeri Pati dan pada tahun yang sama pula masuk UGM melalui jalur Penelusuran Minat dan Kemampuan (PMDK). Penulis memilih Program Studi Mikrobiologi Hasil Pertanian, Jurusan Ilmu Tanah, Fakultas Pertanian dan lulus pada tahun 1991. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mikrobiologi dasar (1988-1990) dan praktikum mikrobiologi pangan (1989-1990). Kesempatan untuk melanjutkan ke program Magister Profesi Teknologi Pangan Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor diperoleh pada tahun 2006 dengan beasiswa dari PT Merck Tbk.
Penulis bekerja sebagai marketing di PT Merck Tbk. Chemical Division sejak tahun 1994 dengan jabatan terakhir Business Segment Manager for Food and Beverages setelah sebelumnya menjabat sebagai Product Manager for Microbiology Hygiene and Microscopy. Selama bekerja di Merck penulis mendapat banyak pelatihan tentang mikrobiologi, monitoring higiene, HACCP dan mikroskopi baik di dalam maupun di luar negeri. Selain itu terkait dengan posisi di kantor, penulis bertugas memberikan pelatihan, presentasi dan seminar di bidang mikrobiologi.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... xiv
DAFTAR GAMBAR ... xv
DAFTAR LAMPIRAN ... xvi
1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Tujuan Penelitian ... 6
1.3 Manfaat Penelitian ... 6
1.4 Hipotesis Penelitian ... 7
2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Definisi Air dalam Proses Pengolahan Pangan ... 8
2.2 Standar Kualitas Mikrobiologis Air Minum ... 10
2.3 Standar Kualitas Mikrobiologis Air Minum ... 17
2.4 Media untuk Pengujian Bakteri koliform dan E. coli ... 19
2.5 Metode Pengujian Koliform dan E. coli ... 27
3 BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ... 34
3.2 Bahan dan Alat ... 34
3.3 Metode Penelitian ... 35
3.4 Analisa data... 39
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Persiapan inokulum bakteri dan sampel ... 41
4.2 Pengukuran Angka Paling Mungkin dengan metode konvensional 41
4.3 Metode Angka Lempeng Total... 55
4.4 Metode Presence Absence ... ... 63
4.5 Perbandingan antara APM, ALT, dan PA ... 68
4.6 Analisa Ekonomis ... 72
5 SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan... 81
5.2 Saran ... 83
DAFTAR PUSTAKA ... 84
DAFTAR TABEL
Halaman 1. Berbagai media dan metode referensi untuk analisa koliform, E.coli
dan koli fekal ... 3 2. Persyaratan kualitas bakteriologis air minum menurut Keputusan Menteri
Kesehatan Republik Indonesia No. 907/MENKES/SK/VII/2002 ... 17 3. Penggunaan berbagai substrat kromogenik dan fluorogenik dalam untuk
media deteksi E.coli dan koliform ... 26 4. Metode dan media yang digunakan dalam dalam beberapa metode
referensi untuk pengujian koliform, E.coli dan koli fekal ... 28 5. Perbandingan jumlah mikroba ter-recover pada metode Angka Paling
Mungkin (Lauryl Sulphate Tryptose & LMX) ... 46 6. Recovery rate E.coli pada tiga macam media pada konsentrasi awal
bakteri 400 cfu/100 ml (rendah) ... ... 50 7. Perkembangan dari Lauryl Sulfate Tryptose Broth ke LMX Broth dan
Readycult® Coliform ... 53 8. Perbandingan antara komposisi media VRBA, CCA dan TBX Agar ... 56 9. Hasil pengujian dengan media Chromocult® Coliform Agar ... 58 10.Karakteristik beberapa bakteri dalam media Chromocult® Coliform
Agar ... 58 11.Recovery rate Escherichia coli di media Chromocult® Coliform Agar
dibandingkan dengan konsentrasi awal bakteri sampel ... 62 12.Hasil pengujian Escherichia coli dengan metode Presence Absence
pada media Readycult® Coliform 100 ... 65 13.Perbandingan jumlah mikroba ter-recover pada metode Angka Paling
Mungkin (LST & LMX), Angka Lempeng Total (CCA) dan Presence Absence (RC) ... 70 14.Perhitungan biaya dan lama pengujian lengkap E.coli pada metode
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1. Skema umum reaksi enzim-substrat Methyl-umbelliferon pada media
fluorogenik menghasilkan fluoresensi pada media cair dan koloni
dibawah lampu UV 366 nm ... 21
2. Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik menghasilkan warna tertentu pada koloni ... 23
3. Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik dengan dua macam kromogen ... 24
4. Pertumbuhan E.coli dalam media Lauryl Sulfate Broth dan Fluorocult® LMX Broth pada metode Angka Paling Mungkin... 28
5. Pertumbuhan E.coli dalam mediaChromocult® Coliform Agar (A), Violet Red Bile Agar (B), ENDO Agar (C), MacConkey Agar (D) pada metode Angka Lempeng Total... 30
6. Pertumbuhan koloni pada metode pengujian Membran Filtrasi ... 31
7. Metode Presence Absence menggunakan Readycult Coliform 100 ... 32
8. Skema penelitian ... 38
9. Pertumbuhan bakteri E.coli dalam media Lauryl Sulfate Tryptose Broth yang ditunjukkan dari kekeruhan dan gas pada tabung durham ... 42
10.Koloni bakteri E.coli di Media LEMBA (Levine EMB Agar) ... 44
11.Hasil uji IMViC untuk bakteri E. coli ... 45
12.Pertumbuhan bakteri E.coli (warna hijau) dalam media Fluorocult LMX Broth ... 48
13.Pembacaan fluoresensi pada media Fluorocult® LMX dengan lampu UV .. 49
14.Pembacaan Indol (cincin merah) pada media LMX dengan penambahan reagen KOVAC’s ... 51
15.Pertumbuhan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media VRBA ... 55
16.Pertumbuhan Citrobacter freundii ATCC 8090 dan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media Chromocult Coliform Agar ... 59
17.Pembentukan warna cerry red pada koloni Escherichia coli setelah ditetesi reagen KOVAC’s ... 61
18.Pertumbuhan koloni Escherichia coli atypical di media Chromocult Coliform Agar... 63
19.Cara penggunaan media cepat siap pakai Readycult® Coliform 100 ... 64
20.Pertumbuhan bakteri koliform di media Readycult® Coliform 100 ... 67
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Rancangan percobaan perbandingan metode APM dengan metode cepat
untuk pengujian E. coli di sampel air proses ... 89 2. Cara perhitungan konsentrasi awal suspensi bakteri standar dengan
metode Angka Lempeng Total ... 90 3. Skema Pengujian Angka Paling Mungkin Konvensional ... 91 4. Skema Pengujian Angka Paling Mungkin cepat dengan media Fluorocult
LMX Broth ... 92 5. Skema Pengujian Angka Lempeng Total Chromocult® Coliform Agar ... 93 6. Skema Pengujian Presence Absence Readycult® Coliform 100 ... 94 7. Jumlah mikroba ter-recover dalam air proses yang dicemari bakteri E.coli,
pada media Lauryl Sulfate Tryptose Broth dan LMX Broth ... 95 8. Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl
Sulfate Tryptose Broth (LST)... 96 9. Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Fluorocult
LMX Broth ... 96 10. Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl
Sulfate Tryptose Broth dan Fluorocult LMX Broth ... 97 11. Perhitungan Anova Metode Angka Lempeng Total dengan media
Chromocult® Coliform Agar ... 98 12.Tabel Angka Paling Mungkin Bakteri 100 g (ml) Seri 5 Tabung dengan
10, 1 dan 0.1 g (ml) material uji ... 99 13 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian,
Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian E.coli dengan Metode Angka Paling Mungkin ... 100 14 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian,
Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian koliform negatif dengan Metode Angka Paling Mungkin ... 101 15 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian,
Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian E.coli dengan Metode Cepat Angka Lempeng Total, dan Presence Absence ... 101 16 Persyaratan Mikrobiologis Kualitas Air Minum Peraturan Menteri Kesehatan
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Air sangat penting bagi kehidupan manusia sehari-hari maupun dalam industri pangan. Fungsi utama dari air di industri pangan adalah sebagai bahan baku, untuk pembuatan es, dan untuk fungsi pembersihan (BPOM, 1996; Codex, 2003). Dalam beberapa standar Internasional (Codex, EC dan WHO) maupun standar Nasional (BPOM, Depkes) tentang kualitas air disebutkan bahwa standar kualitas air untuk kebutuhan proses pengolahan pangan harus sesuai dengan kualitas air minum menurut peraturan yang masih berlaku (BPOM, 1996; Codex, 2003; Depkes, 2002; EC, 1998; WHO, 2004). Codex mengacu pada persyaratan air minum yang dikeluarkan oleh WHO sedangkan CPMB mengacu pada persyaratan air minum sesuai Keputusan Menteri Kesehatan RI No. 907/2002 yang meliputi persyaratan kimiawi, radioaktifitas, fisik, dan bakteriologis. Persyaratan kimiawi meliputi bahan kimia yang memiliki pengaruh langsung pada kesehatan dan bahan kimia yang kemungkinan dapat menimbulkan keluhan pada konsumen. List bahan kimia yang dipersyaratkan meliputi kelompok bahan-bahan anorganik, organik, pestisida, serta desinfektan dan hasil sampingannya. Jenis bahan kimia yang dapat menimbulkan keluhan lebih sedikit dan umumnya dalam kadar yang lebih rendah daripada kelompok yang berpengaruh langsung pada kesehatan. Persyaratan radioaktifitas adalah kandungan radioaktif air. Persyaratan fisik meliputi warna, rasa dan bau, temperatur, dan kekeruhan. Persyaratan bakteriologis meliputi kandungan Escherichia coli (E.coli) atau koli fekal dan koliform total (Depkes, 2002).
Kepmenkes 907/2002 hanya mempersyaratkan pengujian E. coli atau koli fekal dan bakteri koliform dan tidak mempersyaratkan pengujian patogen enterik seperti Salmonella dan bakteri patogen lainnya, karena keberadaannya bisa menjadi indikator kualitas mikrobiologis suatu sampel air minum. Prediksi akan kualitas mikrobiologis suatu produk atau keadaan selama proses produksi menggunakan bakteri indikator memberikan informasi tentang kegagalan proses, kontaminasi paska proses, kontaminasi dari lingkungan, dan kondisi umum tingkat sanitasi dengan cara sederhana, dapat dipercaya dan cepat. Keberadaan koliform fekal (coli fekal) termasuk E.coli di air minum menjadi indikasi bahwa kontaminasi fekal kemungkinan telah terjadi pada air tersebut. Terjadinya kontaminasi fekal menunjukkan resiko adanya bakteri patogen enterik lainnya dalam sampel tersebut. Koliform fekal dan E.coli lebih cocok digunakan untuk indikator kontaminasi fekal daripada koliform karena berasal dari fekal, sedangkan koliform biasa ada yang berasal dari fekal dan ada pula yang dari lingkungan (Pierson and Smoot, 2001).
Saat ini penggunaan E. coli sebagai komponen kriteria mikrobiologis suatu produk pangan lebih memberikan keuntungan dari pada penggunaan koliform fekal karena telah tersedianya metode pengujian E. coli secara cepat (Pierson and Smoot, 2001). Penelitian mengenai aplikasi substrat fluorogenik dan kromogenik dalam media (terutama media untuk E.coli dan koliform) dilakukan secara intensif sejak tahun 1980. Hingga saat ini hasil penelitian tersebut memungkinkan dilakukannya pengujian E.coli dan koliform secara cepat, tepat dan sederhana (Manafi, 1996).
tersebut akan memberikan warna tertentu dan atau fluoresensi yang spesifik sehingga bisa dijadikan identifikasi suatu jenis bakteri tertentu. Media berbasis kromogenik dan fluorogenik dapat memberikan hasil yang lebih cepat karena menargetkan pada enzim yang dihasilkan oleh mikroba target. Pada media konvensional, hasil diperoleh dengan menunggu sampai terbentuk asam dan gas dari hasil fermentasi oleh enzim yang sudah dihasilkan terlebih dahulu (Manafi, 1996).
Tabel 1 Berbagai media dan metode referensi untuk analisa koliform, E.coli dan koli fekal
Lauryl Sulfate Broth * SMWW, EPA, AOAC, BAM, APHA, ISO, USDA, SNI
Presence Absence Broth * SMWW, EPA √ Readycult Coliform 100 ** EPA √ √
***) Keterangan dari singkatan nama :
International Organization for Standardization (ISO); American Public Health Association
(APHA); Food and Drug Association – Bacteriological Analytical Manual (FDA-BAM),
Association of Anorganic Chemistry (AOAC); Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (SMWW-APHA); Standard Methods for Examination of Dairy Products
CODEX CAC/GL 21 menyebutkan bahwa untuk menentukan kelayakan konsumsi suatu pangan yang sangat mudah rusak atau pangan dengan umur simpan yang pendek, harus dipilih (apabila memungkinkan) metode uji yang dapat memberikan hasil sebelum pangan itu dikonsumsi atau melewati masa umur simpannya. Selain itu juga disebutkan bahwa metode mikrobiologi yang dipilih harus dapat dipertanggung-jawabkan dalam hal kompleksitas, ketersediaan media, peralatan, mudah di-interpretasikan hasilnya, waktu pengujian dan biaya yang diperlukan (Codex, 1997).
Pemilihan suatu metode analisa, selain acuan ke suatu metode standar nasional atau internasional, yang juga menjadi faktor sangat penting adalah kemudahan dalam melakukan pengujian, ketelitian hasil, dan kecepatan diperolehnya hasil pemeriksaan. Dalam aplikasi untuk industri pangan, seringkali harga media yang mahal untuk suatu metode uji yang baru bukan menjadi faktor utama. Yang lebih penting dari harga adalah metode yang dapat memberikan hasil yang cepat dan pengerjaannya yang praktis sehingga tidak diperlukan jam kerja dan jumlah pegawai yang banyak untuk mengerjakannya. Selain itu, hasil yang cepat diperoleh akan memberikan banyak implikasi ke penghematan biaya gudang dan kecepatan waktu suatu barang bisa dilepas ke pasar, terutama untuk produk pangan yang berumur pendek.
Kebutuhan akan metode uji cepat, khususnya untuk uji E.coli di sampel air minum yang digunakan di industri pengolahan pangan mendorong dilakukannya penelitian ini. Walaupun Kepmenkes 907/2002 sebagai acuan tertinggi kualitas air minum di Indonesia tidak menyebutkan suatu metode uji yang harus digunakan, tetapi beberapa Standar Nasional Indonesia (SNI) masih menyebutkan penggunaan metode Angka Paling Mungkin (APM) untuk uji Koliform dan E.coli. SNI tersebut diantaranya adalah SNI 01–2897–1992 (Cara uji cemaran Mikroba), SNI 01–3553–2006 (Air Minuman Dalam Kemasan), SNI 01–2332-1-2006 (Cara uji mikrobiologi – Bagian 1: Penentuan Coliform dan Escherichia coli pada produk perikanan).
koloni terduga di media Levine EMB Agar harus dilakukan konfirmasi menggunakan pengecatan gram, pembentukan gas dan uji IMViC untuk yang membutuhkan total waktu pengujian 5-7 hari. Uji SNI untuk E.coli dan Koliform adalah adopsi dari metode FDA-BAM untuk uji yang sama (FDA, 2006). Metode APM adalah metode yang kurang diminati di kebanyakan industri di Indonesia karena membutuhkan waktu pengerjaan, tenaga kerja dan peralatan yang banyak.
Beberapa penelitian membuktikan bahwa metode baru yang berbasis kromogenik dan fluorogenik mampu memberikan hasil yang setara atau lebih baik dengan media konvensional, bahkan dengan keuntungan waktu yang lebih cepat dan cara pengerjaan yang lebih mudah (Manafi & Rosmann. 1998; Manafi & Rosmann. 1998; Manafi, 2000, Geissler et al. 2000; Ogden et. al. 1998; WHO, 2002). Dalam deteksi, identifikasi dan perhitungan organisme target, pendekatan konvensional umumnya hanya menggunakan teknik tunggal, sedangkan pendekatan lain bisa menggunakan kombinasi beberapa metode yang berbeda. Salah satu contohnya adalah dalam identifikasi E.coli bisa menggunakan media kromogenik yang hanya membutuhkan waktu sehari, bisa dikombinasikan dengan teknik-teknik lain yaitu fluorogenik, mikroskopis dan laser scanning (WHO, 2002).
Benoti, et.al (2002) membandingkan antara metode standar pemeriksaan koliform dan E.coli untuk pemeriksaan susu di Kementerian Pertanian Brazil (MARA - Ministério da Agricultura e Reforma Agrária) dan metode baru yang lebih cepat. Dalam penelitian itu digunakan media Brilliant Green Bile Broth untuk Koliform dan media EC Broth/Tryptone Water untuk E.coli. Kedua media konvensional tersebut dibandingkan dengan media cepat Fluorocult® LMX Broth (Merck) yang bisa digunakan sekaligus untuk koliform maupun E.coli. Dalam penelitian tersebut terbukti bahwa kedua metode tersebut memberikan hasil yang serupa. Fluorocult® LMX mempunyai keunggulan dibandingkan media konvensional karena lebih cepat dan lebih mudah dilakukan, sehingga cocok untuk pengujian produk susu dengan masa pakai yang sangat pendek.
1. Apakah metode cepat dapat memberikan hasil pertumbuhan (growth) yang sama dibandingkan dengan dengan metode konvensional, untuk pemeriksaan E.coli di sampel air proses.
2. Apakah ada perbedaan total hari pengujian antara metode cepat dan metode konvensional untuk pemeriksaan E.coli di sampel air proses.
3. Apakah ada penghematan biaya pengujian laboratorium apabila menggunakan metode cepat.
4. Apakah ada penghematan biaya gudang apabila menggunakan metode cepat. 5. Berapa persen penghematan biaya total pengujian E.coli pada sampel air
proses dengan media cepat dibandingkan dengan metode konvensional
1.2 Tujuan Penelitian
Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan (recovery rate, waktu pengujian, dan analisis biaya) antara metode konvensional dan cepat untuk analisis E.coli di sampel air. Perbandingan dilakukan pada kinerja keempat metode yang diuji terhadap: (1) hasil pertumbuhan E.coli (recovery rate); (2) total waktu pengujian yang diperlukan masing-masing metode; (3) Analisa biaya yang meliputi biaya pembelian media, biaya laboratorium dan biaya gudang untuk penyimpanan barang jadi selama pengujian belum selesai; (4) penghematan yang bisa dilakukan dengan penerapan metode cepat.
1.3 Manfaat Penelitian
1.4 Hipotesis Penelitian
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Definisi Air dalam Proses Pengolahan Pangan
Dalam Pedoman Penerapan Cara Produksi Makanan Yang Baik (CPMB), yang dikeluarkan oleh Badan Pengawasan Obat dan Makanan, fungsi air sebagai bahan baku dalam proses produksi pangan dibagi menjadi dua jenis. Jenis pertama adalah air yang digunakan dalam proses pengolahan dan mengalami kontak langsung dengan makanan, misalnya untuk mencuci bahan mentah, merebus makanan, membuat uap untuk mengukus makanan dan lain-lain. Jenis air ini harus memenuhi persyaratan air bersih (BPOM, 1996). Jenis kedua adalah air yang menjadi bagian dari makanan (ingredien) misalnya untuk membuat kaldu, larutan gula, larutan garam dan lain-lain (BPOM, 1996). Jenis air ini harus memenuhi persyaratan air minum atau air bersih (BPOM, 1996; Codex, 2003).
Selain fungsi air sebagai bahan baku, air dalam proses produksi pangan juga digunakan untuk pembuatan es dan untuk fungsi pembersihan. Air untuk pembuatan es yang akan mengalami kontak langsung dengan makanan dibuat dari air yang memenuhi persyaratan sebagai air minum (BPOM, 1996; Codex, 2003). Air untuk fungsi pembersihan, harus disediakan air dingin dan air panas dengan kualitas air minum (Codex, 2003). Jouve (2000) menyebutkan bahwa air yang digunakan dalam proses produksi harus memiliki kualitas air minum (potable water) dengan kualitas mikrobiologis yang bagus. Dalam EC 98 (1998), yang termasuk di dalam air yang ditujukan untuk konsumsi manusia adalah air untuk minum, memasak, mempersiapkan makanan dan kebutuhan rumah tangga lainnya, serta air untuk kebutuhan produksi makanan.
(Lampiran 16) tetapi diganti dengan Keputusan Menteri Kesehatan RI No. 907/MENKES/SK/VII/2002 tentang Syarat-syarat dan Pengawasan Kualitas Air Minum seperti pada Tabel 2 (DEPKES, 2002). Definisi air minum menurut Kepmenkes No. 907/2002 adalah air yang didistribusikan melalui pipa untuk keperluan rumah tangga, air yang didistribusikan melalui tangki air, air kemasan, dan air yang digunakan untuk bahan makanan dan minuman yang disajikan kepada masyarakat (DEPKES, 2002).
Dalam Codex CAC/RCP 1-1969, Rev.4-2003 tentang pasokan air minum disebutkan bahwa pasokan air minum yang cukup dengan fasilitas yang memadai untuk penyimpanan, distribusi dan kontrol suhu, harus tersedia, apabila diperlukan,untuk memastikan keamanan pangan. Standar air minum (potable water) harus mengacu pada edisi terakhir dari WHO Guidelines for Drinking Water Quality, atau standar lain yang lebih tinggi (Codex, 2003). Definisi air minum menurut WHO (2004) adalah semua air yang akan digunakan untuk minum maupun air yang masuk dan ada di sistem distribusi air. Kandungan E.coli atau bakteri koliform tahan panas harus negatif per 100 ml sampel air minum. Standar WHO tersebut juga menjadi acuan untuk pembuatan standar kualitas air minum di European Community sesuai dengan Council Directive 98/83/EC tanggal 3 November 1998 tentang Quality of Water Iintended for Human Consumption (EC, 1998).
dengan mencuci dan menggosok tanki, kemudian mengisi air sampai penuh kembali dan mengalirkan uap panas ke dalam tanki sampai mencapai suhu 95oC. Air yang sudah panas tersebut selain memanaskan tanki kemudian dialirkan juga ke semua sistem distribusi yang ada.
2.2 Bakteri Indikator dalam Air Minum
Pengujian mikrobiologi pada sampel air umumnya dilakukan untuk melihat kemungkinan terjadinya transmisi penyakit-penyakit yang dapat disebarkan oleh air (waterborne desease). Beberapa mikrooganisme patogen yang mungkin disebarkan melalui air (waterborne pathogen) adalah bakteri, virus dan parasit intestinal. Bakteri patogen tersebut antara lain Vibrio cholerae, Shigella dysentriae, Salmonella spp., Salmonella Typhi, Campylobacter jejuni. Escherichia coli patogen (enterohaemorhagik, enterotoksigenik, enteropatogenik, enteroinvasif), Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Burkholderia pseudomallei, non-tuberculous mycobacteria, dan Legionella spp.. Virus yang mungkin ada di air minum antara lain Adenovirus, Norovirus dan Sapovirus, Rotavirus, Enterovirus, Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, Reovirus Adenovirus, Hepatitis A virus Hepatitis E virus, Hepatitis A virus, Norwalk like virus, Astrovirus, Calcivirus, Epidemic non A non B hepatitus. Sementara itu parasit intestinal yang mungkin ada di dalam air minum antara lain Cryptosporidium parvum, Giardia lablia, Entamoeba histolytica (Harrigan, 1998; Merck, 2004; WHO, 2006). Bahaya mikrobiologis lain yang disebabkan oleh toksin yang diproduksi cyanobacteria (blue-green algae) seperti Anabaena, Oscillatoria, Aphanizomenon, Nodularia, Microcystis, Nostoc, dan Clyndrospermum (Harrigan, 1998).
didapat air minum yang benar-benar sehat. Akan tetapi pengujian patogen pada umumnya memerlukan waktu yang lama, sulit dikerjakan dan memerlukan biaya yang besar sehingga dirasa tidak praktis untuk dilakukan dalam monitoring rutin. Untuk itu diperlukan suatu organisme indikator yang memenuhi kriteria tertentu, sehingga keberadaannya memberikan korelasi yang nyata dengan terjadinya kontaminasi fekal di air tersebut (WHO, 2006).
Istilah organisme indikator sebenarnya dapat diaplikasikan ke setiap kelompok organisme (baik secara taksonomik, fisiologis atau ekologis) yang keberadaan ataupun ketidak beradaannya memberikan bukti tak langsung tentang gambaran kondisi sample tersebut dimasa lalu atau gambaran kondisinya saat ini dari suatu hal yang tidak di-investigasi secara langsung. Yang sering digunakan sebagai indikator adalah kelompok koliform sebagai indikasi adanya kontaminasi fekal, walaupun bisa juga digunakan sebagai indikator kurangnya pemanasan pada pangan yang diproses panas (Harrigan, 1998). Istilah organisme indeks (index organism) diusulkan oleh Ingram pada tahun 1977 (Harrigan, 1998) untuk penanda dimana kehadirannya mengindikasikan kemungkinan keberadaan patogen-patogen dari lingkungan yang sama. Istilah organisme penanda (marker organism), yang awalnya digunakan dalam pengujian mikrobiologis air minum, juga sering digunakan dalam pengujian kualitas dimana Escherichia coli telah diketahui menjadi indikasi potensi bahaya dari kemungkinan adanya bakteri patogen intestinal (Harrigan, 1998).
Organisme indikator/indeks/marker tersebut secara universal harus ada dalam jumlah besar di feses manusia dan hewan berdarah panas lainnya, harus dapat dideteksi dengan metode yang sederhana dan harus tidak tumbuh di air alami (natural water) (WHO, 2006). Selain itu organisme tersebut juga harus ada pada saat patogen yang dituju ada, jumlahnya harus jauh lebih banyak dari patogen tersebut, dan harus lebih tahan terhadap kondisi lingkungan atau manipulasi proses yang diterima (Harrigan, 1998).
fekal karena sebagian koliform berasal dari alam. Dilain pihak, hasil uji E.coli dan koliform yang negatif bukan jaminan tidak ada patogen dalam sampel tersebut karena protozoa dan virus umumnya lebih tahan terhadap perlakuan klorinasi dari pada koliform. Selain itu, pemilihan jenis bakteri indikator dan metode analisa juga akan berpengaruh terhadap interpretasi hasil, misalnya pemilihan E.coli untuk indikator adalah khusus untuk strain biasa karena E.coli patogen tidak akan terdeteksi dengan metode konvensional (Harrigan, 1998). Keterbatasan tersebut menyebabkan Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) bersama WHO dalam sidangnya di Geneva 24-25 April 2002 memutuskan bahwa ada kebutuhan akan parameter mikrobiologis dan metode yang lebih baik untuk melakukan penilaian keamanan dan monitoring suatu air minum (WHO, 2006).
Parameter uji mikrobiologis rutin yang dilakukan untuk sampel air adalah total bakteri heterotrofik (Heterothropic Plate Count), koliform total, koliform fekal (tahan panas), Escherichia coli, Streptococci fekal atau Enterococci faecalis, Clostridia atau Clostridium perfringens (Merck, 2004).
Total bakteri heterotrofik
Bakteri yang terdapat di air sebagian besar dapat dikelompokkan dalam tiga tipe yaitu: (a) bakteri akuatik (autochthonous); (b) organisme asli tanah; dan (c) organisme yang biasanya hidup di pencernanaan manusia dan hewan. Kebanyakan bakteri perairan adalah Gram negatif (seperti Pseudomonas, Flavobacterium, Cytophaga, Acinetobacter, Chromobacterium), walaupun ada beberapa bakteri Gram positif (seperti Corynebacteria, Micrococcus, Bacillus) yang mungkin ditemukan (Harrigan, 1998).
Beberapa bakteri akuatik sangat sulit ditumbuhkan di media biasa kecuali di CPS medium Apabila ditumbuhkan pada medium CPS maka hasilnya akan sepuluh kali lipat daripada pertumbuhan di Nutrient Agar atau Plate Count Agar. Bakteri seperti ini biasanya mempunyai temperature optimal di 25oC atau kurang, dan plate harus diinkubasi sampai 14 hari (Harrigan, 1998).
dan anggota Enterobacteriaceae yang saprofitik seperti Enterobacter. Jenis bakteri ini umumnya hidup di temperatur optimal sekitar 25oC dan dapat tumbuh di Nutrient Agar atau Plate Count Agar (Harrigan, 1998).
Total bakteri heterotrofik atau Angka Lempeng Total (Total Plate Count) memberikan indikasi keseluruhan dari sumber air tanah, efikasi dari proses pengolahan air, kebersihan, dan kesempurnaan sistem distribusi air dengan mengukur potensi pertumbuhan kembali mikroorganisme setelah air minum diproses (re-growth/after-growth). Mikroorganisme umumnya akan tumbuh di dalam air dan juga sebagai biofilm pada permukaan-permukaan (pipa, tanki, dll)
Jumlah total bakteri yang tinggi pada air minum yang telah diproses mengindikasikan adanya pertumbuhan kembali mikroorganisme setelah proses dan sebagai indikator tak langsung akan keberhasilan penghilangan patogen selama proses tersebut. Perubahan total bakteri dalam sampel air mengindikasikan perubahan kualitas mikrobiologis air atau kalau terjadi secara tiba-tiba merupakan peringatan dini adanya polusi di sistem proses pengolahan air tersebut, yang memerlukan penyelidikan segera. (Merck, 2004). Harrigan (1998) menyebutkan bahwa kebanyakan, kondisi total bakteri yang tinggi bukan berasal dari fekal atau pencemaran limbah tetapi dari bakteri saprofitik tanah. Walaupun tidak selalu berarti ada patogen akan tetapi total bakteri yang tinggi dapat menyebabkan masalah pada proses pembusukan pangan (food spoilage).
Koliform
diameter 1-3 mm, sedikit cembung, permukaan halus, tidak berwarna atau abu-abu, jernih. Pada media MacConkey Agar dan Eosin Methylen Blue Agar : koloni yang mampu memfermentasi laktosa akan berwarna merah muda dengan kilap logam. Klebsiella dan Enterobacter membentuk koloni yang lebih besar dan berlendir, sedangkan Proteus membentuk koloni yang menjalar atau swarming (Supardi dan Sukamto, 1999).
Koliform umumnya hidup di saluran pencernakan manusia dan hewan berdarah panas, tetapi ada juga yang berasal dari tanah dan air permukaan. Walaupun banyak yang berasal dari fekal tetapi beberapa diantaranya adalah bakteri heterotrofik yang dapat berkembang biak di berbagai jenis lingkungan perairan. Yang termasuk dalam kelompok bakteri koliform adalah Escherichia, Enterobacter, Klebsiella dan Citrobacter (Merck, 2004). Menurut Supardi dan Sukamto (1999) yang termasuk koliform adalah Escherichia coli, Edwarsiella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Arizona, Providentia, Pseudomonas dan basil parakolon. .
Keberadaan koliform tidak selalu berasal dari kontaminasi fekal di sumber air akan tetapi mungkin dari pencemaran yang terjadi saat berada di sistem pengolahan air atau distribusi dalam sistem yang tidak baik. Adanya koliform mengindikasikan bahwa kemungkinan air tersebut telah terkontaminasi dengan mikroorganisme yang bisa menyebabkan penyakit. Pada umumnya koliform bersifat non-patogen, tetapi pada kondisi khusus juga bisa menyebabkan penyakit, terutama pada orang-orang yang peka (Merck, 2004).
Koliform fekal
Kehadirannya di air minum adalah indikasi kuat bahwa belum lama berselang telah terjadi kontaminasi limbah atau kotoran hewan. Kelompok bakteri yang didominasi oleh Escherichia coli dan galur-galur Klebsiella yang tahan panas ini lebih berkaitan dengan adanya kontaminasi fekal daripada total bakteri koliform, sehingga keberadaannya dalam air minum umumnya tidak bisa diterima (Merck, 2004).
Escherichia coli.
Escherichia coli adalah koliform fekal yang memfermentasi laktosa, menghasilkan gas dan asam pada suhu 35-37oC dan 44 - 45.5 oC (meliputi 90% dari E.coli). Sifat biokimia lainnya yang digunakan untuk identifikasi secara konvensional adalah reaksi methyl red positif, reaksi Voges-Proskauer negatif, tidak dapat menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, dan memiliki reaksi indol positif. Pembentukan indol terjadi karena E.coli mempunyai enzim tryptophanase yang dimiliki oleh 99% strain E.coli yang disebut strain E.coli tipe 1 (Harrigan, 1998; Merck, 2004). Sifat enzim lain yang diketahui adalah yaitu 96% dari strain E.coli mempunyai aktifitas enzim β-D-galaktosidase (GAL) dan enzim β-D-glukuronidase (GUD). Seperti halnya koliform fekal, E.coli dapat dideteksi dengan menumbuhkan pada media selektif cair atau agar pada suhu lebih tinggi (44 atau 45,5oC) menggunakan penangas air (Merck, 2004).
Klasifikasi E.coli dilakukan berdasarkan reaksi biokimia dan serotipenya. Berdasarkan serotipe, E.coli bisa dibedakan atas adanya antigen somatic (O) dan antigen flagelar (H), yaitu enteropathogenic E.coli (EPEC), enterotoxigenic E.coli (ETEC), enteroinvasive E.coli (EIEC), diffuse-adhering E.coli (DAEC), enteroaggregative E.coli (EAEC), dan enterohemorrhargic E.coli (EHEC). Diantara kelompok E.coli penyebab penyakit karena pangan (foodborne illness) dan menyebabkan sakit yang parah adalah EHEC (Meng et.al. 2001).
Walaupun E.coli merupakan bakteri yang paling banyak digunakan sebagai indikator kontaminasi fekal tetapi kegagalan dalam mendeteksi E.coli tidak selalu berarti bahwa tidak ada patogen enterik di sana (Pierson & Smooth, 2001).
Enterococci.
Enterococci spp. adalah bakteri gram positif, katalase negatif, berbentuk cocci, dan biasanya tumbuh pada temperatur 45oC dalam 6,5% NaCl dan pH 9,6 (Merck, 2004). Sumber dari Enterococci adalah material fekal manusia, hewan (berdarah panas maupun dingin) dan tanaman. Enterococci berbeda dari koliform dalam hal ketahanannya terhadap garam (6,5% NaCl) dan relatif tahan terhadap pembekuan. Beberapa Enterococci (Enterococcus faecalis dan E.faecium) juga relatif tahan panas dan mungkin bisa bertahan pada suhu pasteurisasi susu (Pierson & Smooth, 2001).
Jumlah Enterococci dalam kotoran manusia lebih sedikit daripada koliform fekal dan E.coli dan jarang ditemukan, sehingga membatasi penggunaannya sebagai bakteri indikator dalam proses air minum. Selain itu Enterococci jarang tumbuh di lingkungan, lebih tahan terhadap berbagai proses perlakuan dan disinfeksi dibandingkan bakteri koliform, coliphage dan virus (Merck, 2004).
koliform atau E.coli dalam suatu sistem distribusi air. Selain itu Enterococci juga digunakan sebagai indikator dalam monitoring rutin untuk sumber utama air yang baru dibuat atau setelah perbaikan sistem distribusi. Test Enterococci dilakukan untuk mendapatkan data tambahan terhadap karakteristik suatu sistem air alam karena mereka sangat jarang bekembang biak di alam (Merck, 2004). Karena bisa bertahan di peralatan lingkungan proses produksi dalam jangka waktu yang panjang, maka Enterococci bisa juga digunakan untuk mengidentifikasi buruknya kualitas pelaksanaan proses produksi (Pierson & Smooth, 2001).
Clostridia
Indikator yang terakhir adalah Clostridia dan Clostridium perfringens yang sesuai untuk indikator survival virus dan kista protozoa di air minum, atau ookista di air minum yang diolah (apabila sampah diduga sebagai sumber kontaminasi). Keduanya tidak direkomendasikan untuk digunakan sebagai parameter rutin dalam pemeriksaan kualitas air karena spora Clostridia dapat terakumulasi dan bertahan dalam waktu yang lama di alam (Merck, 2004).
Clostridium perfringens adalah bakteri anaerobik, Gram positif, bentuk batang berspora, berkaspula, dan non motil. Ukuran sel bervariasi tergantung jenis media pertumbuhan, misalnya pada medium yang mengandung glukosa selnya pendek sedang pada media sporulasi yang mengandung pati ukurannya akan lebih panjang. Selain bisa dijadikan indikator, bakteri ini sendiri bersifat patogen terhadap manusia dan hewan karena mampu memproduksi enterotoksin yang bisa menyebabkan diare dan gas gangrene (Labbe, 1992)
2.3 Standar Kualitas Mikrobiologis Air Minum
Tabel 2 Persyaratan kualitas bakteriologis air minum menurut Keputusan Menteri Total Bakteri Koliform Jumlah per 100 ml sampel 0
c. Air pada sistem distribusi
E.coli atau fecal coli Jumlah per 100 ml sampel 0 Total Bakteri Koliform Jumlah per 100 ml sampel 0
Sumber: Depkes (2002)
Dalam National Drinking Primary Water Standard yang dikeluarkan oleh United States Environmental Protection Agency, USEPA 816-F-01-007 - Office of Water (4606) disebutkan bahwa Maximum Contaminant Level Goal (MCLG) koliform total (termasuk koliform fekal dan E.coli ) dalam sampel air harus nol (zero). Jumlah sampel yang mungkin mengandung koliform total (positif) tidak lebih dari 5% dari total sampel sebulan. Untuk sistem air yang jumlah sampel per bulannya kurang dari 40, maka jumlah sampel yang mungkin positif tidak boleh lebih dari satu dalam sebulan. Setiap sampel yang ada koliform totalnya harus dianalisa untuk E.coli atau koliform fekal, untuk memastikan apakah tercemar material fekal hewan. Dari hasil pemeriksaan lanjutan tersebut mungkin saja ternyata dalam sampel tersebut tidak terkandung E.coli atau koliform fekal. E.coli atau koliform fekal termasuk dalam kelompok koliform total (USEPA, 2001).
2004). Koliform berasal dari lingkungan sedangkan koliform fekal dan E. coli berasal dari kotoran fekal hewan maupun manusia (USEPA, 2001).
Standar untuk air minum menurut KEPMENKES 907, Council Directive 98/83/EC maupun WHO adalah kandungan bakteri koliform maupun E. coli harus negatif dalam 100 ml sampel air minum (Depkes, 2002; EC, 1998; dan WHO, 2004). USEPA (2001) mensyaratkan bahwa dalam satu bulan jumlah sampel yang positif koliform tidak boleh lebih dari 5% dari total sampel dan untuk system yang jumlah sampelnya kurang dari 40 per bulan maka tidak boleh lebih dari satu sampel yang positif koliform. Semua sampel yang positif koliform harus dianalisa E. coli atau koliform fekal (cukup salah satu) untuk menentukan apakah ada pencemaran dari fekal manusia atau hewan.
2.4 Metode Pengujian Bakteri Koliform dan E.coli
Salah satu alasan mengapa koliform total dan E.coli paling banyak digunakan sebagai bakteri indikator adalah karena cara pengujiannya yang relatif mudah dan cepat. Pengujian mikrobiologis mungkin memberikan akurasi hasil yang bervariasi karena pemilihan medium pertumbuhan dan temperatur inkubasi. Disamping itu, kondisi asal dan umur sampel air dapat mempengaruhi spesies yang terisolasi serta jumlahnya (WHO, 2006). Media yang digunakan untuk pengujian koliform dan E. coli bisa media konvensional yang berbasis fermentasi karbohidrat atau media cepat yang berbasis fluorogenik dan/atau kromogenik.
Media konvensional pada umumnya berdasarkan pada kemampuan bakteri koliform dalam memfermentasi laktosa oleh enzim ß-D-galactosidase, menghasilkan asam dan gas. Asam yang terbentuk akan mengubah indikator yang ada dalam media tersebut menjadi warna tertentu, baik pada media maupun pada koloni bakteri. Gas yang terjadi karena fermentasi laktosa akan ditangkap dengan tabung durham pada medium cair atau akan menimbulkan rekahan di media padat. Beberapa reaksi lain yang mungkin timbul (sesuai komposisi medianya) adalah terbentuknya kilap logam (Endo Agar dan EMB agar) atau terjadinya presipitat disekitar koloni pada Violet Red Bile Agar (Manafi, 1996; Merck, 2005).
Broth/Lauryl Tryptose Broth (LST), MacConkey Broth (MCB), MacConkey Agar (MCA), EC Broth/Medium, Violet Red Bile Agar (VRBA), Endo Agar, Eosin Methylen Blue Agar (EMBA), Levine EMB Agar (LEMBA), m-Endo Agar LES, A 1 Medium, dan P-A Broth (APHA, 2005; ISO, 2004; Merck, 2005; USEPA, 2007).
Secara umum, penggunaan media konvensional untuk pengujian bakteri indikator masih belum bisa membedakan antara bakteri laktose positif, bakteri kelompok koliform dan bakteri E. coli. Untuk membedakannya diperlukan tahapan identifikasi atau konfirmasi dari koloni terduga yang tumbuh di media agar untuk isolasi. Porses identifikasi tersebut selain memerlukan waktu yang banyak, juga memerlukan beberapa tahapan pengerjaan (Manafi, 1996). Kebutuhan untuk mendapatkan hasil pengujian mikrobiologis secepatnya, terutama untuk produk pangan yang masa pakainya singkat, mendorong berbagai penelitian tentang media yang lebih cepat, praktis dan akurat. Beberapa media baru yang sesuai dengan kebutuhan tersebut sudah mulai diterima dan diakui oleh beberapa Lembaga Internasional seperti APHA, WHO, USEPA, ISO, dan FDA. Umumnya media yang digunakan adalah yang menggunakan enzim spesifik sebagai target penanda suatu mikroorganisme tertentu (APHA, 2005; ISO, 2001; USEPA, 2007, WHO, 2002).
Enzim
Methyl-umbelliferon Karbohidrat
Enzim
Tak Berwarna
Fluoresens i
Sinar UV366 nm
Enzim ß-D-Glucurondase
Media Fluorogenik
Media substrat-enzim fluorogenik umumnya mengandung substrat yang spesifik terhadap enzim tertentu (seperti gula atau asam amino) dan fluorogen (seperti 4-methylumbelliferone), yang interaksinya dapat mengubah sinar UV menjadi sinar yang tampak. Sebagian besar enzim-substrat yang sering digunakan adalah coumarin (Manafi, 1996). Substrat methylumbelliferyl bersifat larut air, sangat sensitif dan sangat spesifik. Karena sifatnya yang terpengaruh oleh pH, terdifusi secara kuat ke media padat, dan perlu lampu UV untuk mendeteksi, maka penggunaan substrat in menjadi terbatas. Substrat fluorogenik yang paling umum digunakan adalah MUG atau methylumbelliferyl glucuronidase (Manafi, 2000).
Secara umum reaksi yang terjadi pada media fluorogenik tampak pada Gambar 1. Enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang tumbuh di media fluorogenik akan memecah ikatan komplek substrat karbohidrat dengan methylumbelliferron. Gugus karbohidrat akan dipecah oleh enzim dan gugus methylumbelliferil akan dilepaskan ke media. Apabila disinari dengan lampu UV panjang gelombang 365 nm atau 366 nm akan tampak sinar fluoresen biru pada media cair atau pada koloni terduga yang tumbuh di media agar (Manafi, 1996; Merck, 2004; APHA, 2005).
Media
Media cepat yang dikembangkan dari media konvensional dengan penambahan substrat fluorogenik MUG dapat digunakan untuk menumbuhkan, sekaligus membedakan E.coli dari bakteri lainnya. Contoh pengembangan media konvensional menjadi media cepat fluorogenik dari adalah media VRBA with MUG (APHA, 2005; FDA, 2002) dan media EC Broth with MUG (APHA, 2005). Dalam Manafi (2000) disebutkan jumlah MUG yang ditambahkan ke media konvensional adalah 50 µg/ml (BGLB, LB, ECB, LTB), 100 µg/ml (LTB), 150 µg/ml (MCB), dan 200 µg/ml (VRBA).
Beberapa contoh media cair yang menggunakan MUG, yang tersedia secara komersial di pasar adalah Fluorocult LMX Broth, Readycult Coliform, Colilert, Coliquick, dan Colisure (Tabel 3). Selain itu beberapa contoh media konvensional yang sudah mengandung MUG didalamnya adalah Fluorocult® LMX broth, Fluorocult® Lauryl Sulfate Broth, Fluorocult® BRILA Broth, Readycult® Coliform, Fluorocult® VRBA, Fluorocult® MacConkey Agar, Fluorocult® E.coli O157:H7 (Merck, 2005).
Media Kromogenik
Substrate-enzim kromogenik adalah senyawa-senyawa yang bertindak sebagai substrat terhadap suatu enzim spesifik, dan berubah warna karena kerja dari enzim tersebut. Secara umum, berdasarkan reaksi kimianya, empat kelompok senyawa kromogenik dapat dikenali dan dideskripsikan oleh Manafi pada tahun 1998. Turunan indolil bersifat larut air dan tahan panas sehingga bisa digunakan di media agar. Turunan indolil yang sering digunakan antara lain: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl (X), 5-bromo-6-5-bromo-4-chloro-3-indolyl (magenta), atau 6-chloro-3-indolyl (salmon), dan semuanya terbukti tidak terdifusi di agar (Manafi, 2000).
Pada Gambar 2 terlihat reaksi umum dari enzim-substrat pada media kromogenik. Enzim spesifik yang dilepaskan oleh suatu mikroorganisme akan menggunakan karbohidrat dari komplek karbohidrat-indolil yang ada di media sebagai sumber karbon. Dua gugus indolil yang lepas akan saling berikatan, dan dengan adanya oksigen akan membentuk warna tertentu, tergantung jenis indolil dari kromogen yang digunakan. Karena pembentukan warna memerlukan oksigen maka ketersediaan udara yang cukup di botol atau cawan petri menjadi sangat penting (Manafi, 1996; Manafi, 2000).
Gambar 2 Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik menghasilkan warna tertentu pada koloni.
Contoh media kromogenik yang sudah tersedia di pasar adalah yang menggunakan X-GAL sehingga memberikan warna biru (Tabel 3) adalah Fluorocult LMX Broth, Readycult Coliform Medium, EMX Agar, C-EC-MF Agar, Coli ID, Rapid E.coli 2, Coli Complete, ColiBag, Pathogel, dan E.colite. Media kromogenik yang menggunakan ONPG sehingga memberikan warna kuning (Tabel 3) adalah Colilert dan Coliquick. Substrat CRPG memberikan warna merah digunakan pada media Colisure. Substrat lain yang juga memberikan warna merah adalah Salmon GAL, dan digunakan pada media Chromocult Coliform Agar, CHROM Agar ECC, E coli /Coliforms, Coliscan, HiChrom ECC.
Enzim Indolyl
Karbohidrat
Enzim
Tak Berwarna
ikatan indolyl + O2 warna
+
O
2Glucuronide dan Galactoside Enzim ß-D-glucuronidase
Media Simultan untuk Koliform dan E.coli
Baik koliform maupun E.coli sampai saat ini masih sangat penting sebagai indikator kualitas air dan produk pangan secara umum sehingga akan sangat berguna apabila ada suatu media yang dapat mendeteksi keduanya sekaligus dalam waktu yang bersamaan. Beberapa percobaan telah dilakukan dan metode baru sudah diperkenalkan yaitu yang berdasar pada deteksi enzim ß-D-galactosidase (ß-GAL) dan enzim ß-D-glucuronidase (GUD) menggunakan substrat fluorogenik dan/atau khromogenik (Manafi & Rosmann, 1998b). Enzim ß-D-galactosidase (ß-GAL) yang dimiliki oleh 98% koliform (Manafi, 1995). Enzim ß-D-glucuronidase (GUD) yang dimiliki oleh 98% E.coli dan 99% E.coli memberikan reaksi indol positif (Manafi, 1995 dan 1996). Akan tetapi ada 3-4% E.coli ternyata memiliki sifat MUG negatif dan GAL positif, misalnya E.coli O157 (Merck, 2005).
Gambar 3 Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik dengan dua macam kromogen.
Enzim Indolyl
Karbohidrat
Enzim
Tak Berwarna
+
O
2Chloroindigo Bromochloroindigo
Coliforms dan E.coli
E.coli
X-Gluc dan Salmon GAL (+) E.coli
Glucuronidase dan
Galactosidase Glucuronide dan
Media yang digunakan untuk pengujian simultan koliform dan E. coli pada Tabel 3 ada yang mengandung dua macam substrat kromogenik, ada pula yang mengandung kromogenik dan fluorogenik sekaligus. Untuk media yang mengandung substrat kromogenik lebih dari satu maka akan tampak dua atau lebih warna koloni yang berbeda untuk jenis bakteri yang berbeda. Contoh dari media tersebut adalah Chromocult® Coliform Agar, CHROM Agar ECC, E.coli/Coliforms, ColiScan, dan HiChrome ECC (Salmon GAL-merah dan XGLUC-violet); Coli ID dan Rapid E.coli 2 (XGAL-biru dan Salmon Glu-rose violet); dan m-Coliblue (TTC dan XGluc (Manafi, 2000).
Contoh reaksi yang terjadi apabila menggunakan dua macam kromogen sekaligus ada pada Gambar 3, yaitu untuk media Chromocult® Coliform Agar. Pada gambar tersebut terlihat dua macam reaksi warna yang terjadi dari peruraian enzim-substrat yaitu merah salmon (dari enzim Galactosidase yang dimiliki oleh koliform dan E.coli) dan hijau torquise (dari enzim Glucuronidase yang dimiliki oleh E.coli). E.coli menghasilkan kedua macam enzim sehingga akan terjadi warna purple yang merupakan campuran dari merah salmon dan hijau torquise tersebut (Manafi, 2000; Merck, 2004; Merck 2005).
Dalam suatu kultur bakteri campuran, warna yang tampak untuk akan ada empat macam, yaitu merah salmon untuk koliform (GAL positif), purple (GAL positif dan GUD positif) untuk E.coli, hijau torquise untuk bakteri dengan sifat GUD positif dan GAL negatif, serta koloni tak berwarna untuk Enterobacteriaceae lainnya (Manafi, 2000; Merck, 2004; Merck 2005). Kemungkinan kedua adalah media simultan yang menggunakan kombinasi kromogenik dan fluorogenik sekaligus. Pada media jenis ini maka selain timbul warna spesifik juga muncul fluoresensi apabila dilihat dibawah lampu UV 366 nm.
Kelompok ketiga adalah yang menggunakan sistem lain yaitu, ColiComplete, ColiBag/Water check, Pathogel, E. colite, m-Coliblue (Manafi, 2000).
Tabel 3 Penggunaan berbagai substrat kromogenik dan fluorogenik dalam media untuk deteksi E.coli dan koliform
Medium Substrat a / Warna Manufaktur Koliform E. coli
Media cair
Fluororcult® LMX Broth XGAL/biru-hijau MUG/fluoresen biru Merck (Jerman) Readycult Coliform XGAL/MUG MUG/fluoresen biru Merck (Jerman) ColiLert ONPG/kuning MUG/fluoresen biru IDEXX (USA) Coliquick ONPG/kuning MUG/fluoresen biru Hach (USA Colisure CPRG/merah MUG/fluoresen biru IDEXX (USA)
Media Padat
Fluorocult® Agars - MUG/fluoresen biru Merck (Jerman) TBX Agar - BCIG/biru OXOID (UK), Merck
(Jerman)) Uricult Trio - HOQ/hitam Orion (Finnland) EMX -agar XGAL/biru MUG/fluoresen biru Biotest (Jerman) C-EC-MF-Agar XGAL/biru MUG/fluoresen biru Biolife (Italy) Chromocult Coliform
Agar
SalmonGal/merah XGLUC/biru-violet Merck (Jerman) Coli ID XGAL/biru SalmonGlu/rose-violet bioMerieux (France) CHROMagar ECC SalmonGal/merah XGLUC/purple Chromagar (France) Rapid’ E.coli 2 XGAL/biru SalmonGlu/purple Sanofi (France)
E.coli/Coliforms SalmonGal/merah XGLUC/purple OXOID (UK), ColiScan SalmonGal/merah XGLUC/purple MicrologyLab.(USA) MI-agar MUGal/fluoresen
biru
Indoxyl/biru Brenner et al. (1993) HiCrome ECC SalmonGal/merah XGLUC/biru Union Carbide
(USA)
Sistem Lain
ColiComplete XGAL/biru MUG/fluoresen biru Biocontrol (USA) ColiBag/Water check XGAL/biru-hijau MUG/fluoresen biru Oceta (Kanada) Pathogel XGAL/biru MUG/fluoresen biru Charm Sci.(USA) E. colite XGAL/biru MUG/fluoresen biru Charm Sci.(USA) m-Coliblue TTC/merah XGLUC/biru Hach (USA)
a) Singkatan: ONPG (o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside); Salmon-GAL (6-bromo-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside); XGAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-(6-bromo-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside); CPRG (chlorophenol red ß-galactopyranoside); XGLUC atau BCIG (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucuronide); MUG (4-methylumbelliferyl-ß-(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucuronide); TTC (Tryphenyl Tetrazolium Chloride); HOQ (Hydroxyquinoline-ß-D-glucuronide) Sumber : Manafi, 2000
koliform, E.coli, E.coli O157:H7, koliform dan E.coli secara simultan, dan Salmonella (Manafi, 2000).
2.5 Metode Pengujian Koliform dan E. coli.
Empat metode pengujian untuk bakteri koliform dan E.coli yang paling umum dilakukan adalah metode Angka Paling Mungkin (Most Probable Number atau Multiple-tube Fermentation Technique), metode Angka Koliform Total (Total Coliform Count), metode Membrane Filtrasi (Membrane Filtration Technique), atau metode Positif/Negatif (Presence Absence Procedure) melalui fase pendugaan–penegasan (presuptive–confirmed phase) atau test lengkap (APHA, 2005; Merck, 2004). Setiap teknik bisa diaplikasikan dalam keterbatasan spesifikasinya dan dengan memperhatikan tujuan pemeriksaan. Agar dapat memberikan hasil yang valid maka diperlukan penerapan prosedur Quality Control yang ketat (APHA, 2005). Beberapa metode acuan baik nasional maupun internasional menggunakan beberapa metode sekaligus (Tabel 4), sehingga pemakai dapat memilih metode yang cocok dengan jenis sampel dan situasi yang ada di laboratoriumnya.
Tabel 4 memberikan contoh beberapa metode pengujian koliform, E.coli dan koli fekal beserta media yang digunakan, menurut referensi ISO, APHA, FDA, SNI, dan USEPA. USEPA tampaknya lebih cepat mengadopsi teknologi kromogenik fluorogenik dengan mengakui penggunaan EC-MUG, LMX, Readycult Coliform, dan Chromocult Coliform Agar.
Angka Paling Mungkin
pangan yang bahan-bahan yang terkandung di dalamnya mungkin akan mengacaukan akurasi perhitungan koloni (FDA, 2006).
Tabel 4 Metode dan media yang digunakan dalam dalam beberapa metode referensi untuk pengujian koliform, E.coli dan koli fekal
Metode / Media Metode Standar *) Koliform E.coli Koli Fekal
*) Keterangan dari singkatan nama :
International Organization for Standardization (ISO, 2001); American Public Health Association
(APHA, 2005); Food and Drug Association – Bacteriological Analytical Manual (FDA, 2002);
United StateEnvironment Protection Agency (USEPA, 2007); Standar Nasional Indonesia (SNI)
Hanya mikroorganisme hidup yang terhitung dengan metode APM. Karena bakteri di dalam suatu sampel membentuk rantai yang tidak terpisahkan selama persiapan sampel dan pengenceran, maka APM harus diputuskan sebagai perkiraan growth units (GUs) atau colony-forming units (CFUs), bukan sebagai individu bakteri (FDA, 2006). Esensi dari metode APM adalah untuk mengencerkan sampel sampai ke suatu tingkat dimana inokula di dalam tabung akan (kadang kala, tetapi tidak selalu) mengandung organisme hidup (FDA, 2006).
a.Media Lauryl Sulfate Broth (positif = gas dan keruh)
b. Media Fluorocult LMXBroth (positif = warna hijau)
diperbanyak (10 ml atau bahkan 100 ml) kemudian ditambahkan ke medium double strength atau dengan volume yang setara (Harrigan, 1998)
Gambar 4 Pertumbuhan E.coli dalam media Lauryl Sulfate Broth dan Fluorocult® LMX Broth pada metode Angka Paling Mungkin
Media yang umum digunakan untuk APM adalah Lactose Broth (LB) atau Lauryl Sulfate Broth (LSB) untuk uji pendugaan koliform (presumptive coliform). Apabila terjadi gas dan media menjadi keruh di LB/LTB seperti di Gambar 4a, maka dilakukan uji penegasan koliform (confirmed coliform) ke media Brilliant Green Bile 2% Broth (BGLB) dan uji pendugaan E. coli ke media EC Broth. Uji penegasan E. coli dilakukan dengan menginokulasikan tabung EC broth positif ke media Levine EMB Agar. Dari hasil uji penegas yang positif kemudian dilakukan inokulasi ke medium Nutrient Agar (NA) atau Plate Count Agar (PCA) untuk keperluan uji konfirmasi IMVIC (APHA, 2005; FDA, 2006).
