IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.3 Metode Angka Lempeng Total
Di kalangan industri pangan, pengujian E.coli dan total Koliform selain menggunakan metode APM juga banyak menggunakan metode ALT (Cawan tuang) dan membran filtrasi. Berdasarkan pengalaman penulis selama menjadi Product Manager untuk Mikrobiologi di Merck , di Indonesia, metode APM lebih banyak digunakan oleh kalangan institusi pemerintahan atau beberapa industri lokal yang mengacu kepada SNI. Di sebagian besar industri pangan skala menengah ke atas umumnya lebih memilih menggunakan metode angka lempeng total dengan cara cawan tuang (pour plate), karena metode APM dianggap lama dan merepotkan.
Adapun media yang paling banyak digunakan di industri pangan di Indonesia untuk uji Koliform adalah Violet Red Bile Agar (VRBA). Media ini juga direkomendasikan oleh ISO, APHA, BAM, IDF-FIL, SMDP (Merck, 2005). Karena banyaknya pertanyaan dari kalangan industri pangan ke penulis tentang perbandingan antara hasil APM dan ALT untuk uji Koliform dan E.coli, maka dalam penelitian ini juga dilakukan perbandingan keduanya. Medium VRBA adalah medium yang diusulkan oleh Davis pada tahun 1951 untuk deteksi dan perhitungan bakteri Koliform termasuk E.coli di air, susu, ice-cream, daging dan bahan pangan lainnya (Merck, 2005). Medium ini sesuai dengan rekomendasi dari American Public Health Association (1992), the International Dairy Federation FIL-IDF (Internationaler Milchwirtschaftsverband 1985), the Institute for Food Technology and Packaging (Institut für Leben-mitteltechnologie und Verpackung) (1974).
Apabila dilihat dari komposisi media VRBA (Tabel 8) maka pertumbuhan bakteri secara umum didukung oleh adanya peptone from meat, NaCl dan Yeast extract. Sebagai sumber karbohidrat yang utama adalah laktosa yang sekaligus juga menjadi pembeda antara Enterobacteriaceae yang laktosa positif dan negatif. Degradasi laktosa menjadi asam oleh bakteri laktosa positif membuat indikator pH neutral red memberi warna merah pada koloni bakteri tersebut dan menyebabkan presipitasi bile acids membentuk halo kemerahan disekitar koloni. Penghambatan terhadap bakteri gram positif dimungkinkan oleh adanya crystal violet dan bile salts yang kadang justru juga menghambat pertumbuhan bakteri Koliform dan E.coli apabila dalam keadaan sublethal injured / sakit (ISO, 2004; Merck, 2004 & 2005).
Tabel 8. Perbandingan antara komposisi media VRBA, CCA dan TBX Agar
Komposisi Media (g / l) Deskripsi
VRBA CCA* TBX Agar**
Peptone 7.00 (meat) 3.00 20.00 Yeast Extract 3.00 Sodium chloride 5.00 5.00 Lactose 10.00 Neutral Red 0.03 Bile salt 1.50 (mixture) 1.50 (No.3) Crystal violet 0.002
Sodium dihydrogen phospat 2.20 di-sodium hydrogen phospat 2.70
Sodium pyruvat 1.00 Tryptophane 1.00 Sorbitol 1.00 Tergitol 7 0.15 Chromogenic mixture 0.40 0.075 Agar-agar 13.00 10.00 15.00
Total penggunaan media (g/l) 39.53 26.50 36.60 Harga per botol 500g *** Rp. 920.000 Rp. 4.490.000 Rp. 7.555.000 Harga per petri (15 ml) Rp. 1.091 Rp. 3.563 Rp. 8.290 Pembacaan hasil Koliform saja Koliform, E. coli E. coli saja * CCA : Chromocult Coliform Agar
** TBX Agar : Chromocult TBX Agar
***Harga media berdasarkan pada Price List 2009 yang dikeluarkan PT Merck Tbk
Selain itu, media VRBA tidak bisa secara spesifik membedakan antara E.coli, Koliform dengan Enterobacteriaceae lainnya, tetapi hanya membedakan bakteri yang bersifat laktosa positif dan laktosa negatif saja yang semuanya
memunculkan warna merah dikelilingi zone presipistasi (Gambar 15). Beberapa strain Klebsiella (yang juga merupakan anggota koliform) dan Enterococci tumbuh sebagai koloni pink dengan ukuran sangat kecil (pin-point) sehingga memungkinkan terjadinya kesalahan pembacaan hasil (Merck, 2005). Kesulitan lain penggunaan media ini apabila mengikuti prosedur ISO 4832:2004 adalah pemanasan media dalam air mendidih tidak boleh lebih dari 2 menit dan media harus digunakan dalam waktu tiga jam setelah dibuat (ISO, 2004).
Di lain pihak, ada kebutuhan industri pangan akan media baru yang dapat memberikan hasil yang lebih cepat dan akurat dengan pengerjaan yang mudah. Seperti pada metode APM sebelumnya, penggunaan substrat kromogenik untuk pengujian Koliform dan E.coli juga sudah banyak digunakan dalam media agar, misal media TBX agar untuk ISO 16649:2001 dan Chromocult® Coliform Agar (USEPA, 2007). Pada media TBX, kromogen yang digunakan hanya satu macam dan hanya untuk mendeteksi sifat ß–glucuronidase yang ada di E. coli saja dengan warna koloni hijau (ISO, 2001). Media TBX di Indonesia tidak populer karena peraturan pemerintah maupun perusahaan yang ada di Indonesia pada umumnya menghendaki uji Koliform dan E.coli sekaligus. Media Chromocult® Coliform Agar (CCA) lebih sesuai dan lebih diterima untuk keperluan Indonesia karena bisa mendeteksi keduanya yaitu Koliform berwarna merah salmon sedang E.coli biru tua sampai violet.
Pada penelitian ini hanya dilakukan perhitungan Angka Lempeng Total dengan Media CCA saja, tanpa membandingkan dengan VRBA dan TBX karena tujuannya adalah untuk membandingkan metode ALT yang lebih sederhana cara pengerjaannya dengan metode perhitungan APM konvensional. Dari hasil perhitungan sampel terlihat bahwa semua sampel yang positif metode APM, baik yang konvensional maupun yang cepat, juga memberikan hasil positif di CCA. Sampel air proses yang tidak dicemari juga memberikan hasil negatif, sama dengan kedua metode APM (Tabel 9). Data tersebut disajikan dalam nilai cfu/100 ml sesuai dengan perhitungan APM yang juga per 100 ml. Dari data Anova untuk perhitungan antara cemaran saja dan sampel + cemaran dalam konsentrasi rendah (Lampiran 11) diperoleh nilai F hitung lebih besar dari F tabel dan nilai P lebih besar dari 5% yang menunjukkan hasil yang tidak beda nyata.
Tabel 9. Hasil pengujian dengan media Chromocult® Coliform Agar
Kontrol Positif (cfu/100 ml) Sampel ber E. coli (cfu/100 ml) Ulangan Sampel
air proses Rendah* Sedang** Tinggi*** Rendah* Sedang** Tinggi*** 1 0 188 1963 4000 200 2275 4163 2 0 175 1188 2875 238 1613 3188 3 0 150 2000 4350 175 1838 3600 Rerata 0 171 1717 3742 204 1908 3650 Catatan :
* Rendah : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 4 cfu/ml ** Sedang : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 40 cfu/ml *** Tinggi : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 80 cfu/ml
Pada Tabel 10 tampak sifat pertumbuhan beberapa bakteri pada media CCA, didasarkan pada sifat pemecahan substrat salmon-GAL, X-glucuronide dan asam amino tryptophan untuk test indol. Pemecahan substrat Salmon-GAL oleh enzim ß-D-galactosidase yang dimiliki oleh total Koliform (termasuk E.coli) ditandai dengan munculnya warna merah salmon pada koloni. Pemecahan substrat X-Glucuronide oleh enzim ß-D-glucuronidase yang dimiliki oleh E.coli dan beberapa bakteri lainnya ditandai dengan warna biru terang sampai torquoise. Khusus untuk E.coli yang memiliki kedua enzim tersebut akan memecah kedua substrat tersebut menghasilkan gabungan antara warna merah salmon dan torquoise menjadi warna biru gelap sampai violet (Gambar 16). Gram negatif lain yang tidak memiliki kedua macam enzim tersebut tumbuh sebagai koloni tak berwarna (Merck, 2005; Manafi, 1995; Manafi dan Rosmann, 1998b).
Tabel 10 Karakteristik beberapa bakteri di media Chromocult® Coliform Agar
Test strains Recovery rate % Pertumbuhan Warna koloni Salmon-GAL X – Glucu ronide Indole Escherichia coli ATCC 11775 ≥ 70% Bagus / sangat bagus biru gelap - violet + + + Citrobacter freundii ATCC 8090 > 70% Bagus / sangat bagus merah salmon + - - Escherichia coli DSMZ 502 > 70% Bagus / sangat bagus biru-violet + - + Salmonella enteritidis ATCC 13076 Tidak terbatas Bagus / sangat bagus tak berwarna - - - Enterococcus faecalis ATCC 19433 < 0.01 tidak tumbuh Sumber : Microbiology Manual Merck (2005)
Warna yang timbul pada koloni oleh kromogen tersebut akan tetap stabil untuk beberapa hari, tidak terpengaruh oleh nilai pH, temperatur, atau cahaya. Karena pewarnaan tersebut tidak terdifusi ke agar maka pembedaan masing-masing koloni dimungkinkan dalam media ini, bahkan apabila terjadi pada perhitungan koloni yang tinggi (Merck, 2005)
Hasil false negatif pada media kromogenik dimungkinkan terjadi pada strain Escherichia coli yang bersifat ß-glucuronidase negatif, seperti Escherichia coli O157 (ISO, 2001). Dalam Manafi et.al (1991) disebutkan bahwa ada korelasi kuat antara E.coli pembentuk verotoksin dengan sifat ß-glucuronidase negatif sehingga memberikan hasil negatif pada media kromogenik (tidak membentuk koloni hijau) dan fluorogenik (fluoresensi negatif) walaupun dapat tumbuh.
Dalam hal aktifitas ß-D-galactosidase (X-Gal), hanya beberapa strain Vibrio metschnikovii, V. vulnificus, Aeromonas hydrophila dan A.sobria memberikan reaksi “false positive” X-Gal (Manafi, 1995; Geissler et al., 2000). Ley et al (1993) menemukan bahwa semua strain Aeromonas, Citrobacter dan Enterobacter yang diisolasi dari air baku (raw water) dalam medium yang mengandung X-Gal bersifat ß-D-galactosidase positif. Sebaliknya, hanya 10-20% saja dari strain-strain tersebut yang menghasilkan warna merah dengan kilap logam pada media m-Endo agar LES.
Gambar 16. Pertumbuhan Citrobacter freundii ATCC 8090 dan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media Chromocult® Coliform Agar
Dari total 674 sampel air berklorinasi yang ditanam di m-Endo agar LES dan medium yang mengandung X-Gal, 18 yang negatif di Endo memperlihatkan hasil positif di Medium X-Gal. Dari 50% bakteri yang bersifat ß-D-galactosidase positif, 76% diidentifikasi sebagai Aeromonas hydrophila (Ley et al, 1993). Ossmer (1993) juga menyebutkan bahwa X-Gal memberikan hasil yang lebih cepat dan lebih sensitif untuk Koliform total daripada produksi gas dari laktosa.
Untuk keperluan konfirmasi koloni E.coli, cukup dengan memberikan satu tetes KOVACS' indole reagent kepada koloni yang berwarna biru gelap sampai violet. Apabila pereaksi tersebut berubah menjadi warna merah cherry (Gambar 17) setelah beberapa detik maka dapat dikonfirmasikan bahwa terjadi pembentukan indol yang memberi kepastian (99%) bahwa koloni tersebut memang E.coli. Kemungkinan untuk melakukan test indol langsung di agar yang sama membuat CCA menjadi unik dan sangat membantu memepercepat uji E.coli (Merck, 2005; Manafi, 1995; Manafi dan Rosmann, 1998b).
Media CCA terbukti dalam beberapa penelitian, memang memiliki tingkat akurasi yang tinggi yaitu 94-96% untuk sifat enzimatis GUD positif; 99% untuk sifat indol positif (Manafi, 1991); dan 98% untuk sifat GAL positif (Geissler et al, 2000). Selain itu ada 3-4% strain E.coli yang mempunyai sifat ß-D-glucuronidase negatif, yang akan membentuk koloni tak berwarna misal E.coli O157 atau juga strain yang tidak dapat tumbuh pada temperatur 44 °C misal E. coli 0157:H7 (Merck, 2005). Pendekatan pengujian cepat dengan media kromogenik misal identifikasi Escherichia coli menggunakan one-day cultivation bahkan juga sudah diakui pentingnya oleh WHO sebagai metode alternatif, selain penggunaan probe fluoresense secara mikroskopis dan teknik laser scanning (WHO, 2002).
Geissler et.al (2000) membandingkan kinerja dari Fluorocult® LMX Broth, Chromocult® Coliform Agar (CCA) dan Chromocult® Coliform Agar ditambah cefsulodin 10 g/ml (CCA-CFS) dengan metode standar APM untuk perhitungan Koliform dan E.coli di air pantai untuk rekreasi. Dalam penelitian Geissler ini juga dibuktikan bahwa standar APM konvensional memberikan hasil yang kurang sensitif untuk perhitungan E.coli., walaupun secara statistik tidak ada beda nyata antara LMX, CCA, CCA-CFS dan APM untuk perhitungan E.coli.
Gambar 17. Pembentukan warna cherry red pada koloni Escherichia coli setelah ditetesi reagen KOVAC’s.
Di lain pihak penggunaan media CCA-CFS untuk angka lempeng total memberikan hasil yang lebih akurat untuk total Koliform karena gangguan background flora lebih terkurangi. Karena itu kontribusi bakteri ß-galactosidase positif, non Koliform (terutama Aeromonas spp. dan Vibrio spp.) dalam perhitungan angka lempeng total tidak bisa diabaikan begitu saja.
Penggunaan larutan PDF sebagai pengencer tanpa penambahan NaCl juga berpotensi menyebabkan kerusakan sel karena bukan larutan yang bersifat isotonis. Selain itu, tidak adanya kandungan peptone dalam cairan pengencer menyebabkan tidak ada efek recovery sehingga sel bakteri yang sublethal injured kemungkinan akan sulit tumbuh. ISO 6887 menganjurkan digunakannya larutan pengencer Maximum Recovery Diluent yang per liternya mengandung 85 g NaCl dan 1 g peptone yang mempunyai efek recovery dari peptone dan isotonik dari NaCl fisiologis sehingga tidak terjadi kerusakan sel pada sampel (Merck, 2005). Pengaruh tersebut juga diduga menjadi sebab dari rendahnya recovery rate media CCA di penelitian ini (Tabel 11) yang seharusnya >70% (Merck, 2005).
Tabel 11 Recovery rate Escherichia coli di media Chromocult® Coliform Agar dibandingkan dengan konsentrasi awal bakteri sampel
Kontrol positif Sampel ber E. coli
Ulangan
Rendah* Sedang* Tinggi* Rendah* Sedang* Tinggi* 1 47% 49% 50% 50% 57% 52% 2 44% 30% 36% 59% 40% 40% 3 38% 50% 54% 44% 46% 45% Rerata 43% 43% 47% 51% 48% 46% Catatan :
* Rendah (konsentrasi cemaran 4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml) dan Tinggi (80 cfu/ml)
Dari komunikasi pribadi dengan Rolf Ossmer (18 Maret 2009) yang mengembangkan Chromocult® Coliform Agar di Laboratorium R&D Merck KGaA di Jerman, seharusnya recovery rate dari media CCA untuk E.coli adalah >70% (70-100%). Rendahnya recovery rate dalam penelitian ini kemungkinan karena sampel tidak terdistribusi dengan baik di cawan petri, yang disebabkan oleh teknik pencampuran sampel dengan media pada metode cawan tuang yang salah. Area berwarna violet di agar (Gambar 18) merupakan indikasi tempat terkumpulnya bakteri, sehingga jumlah koloni yang terpisah secara sempurna menjadi berkurang.
Pada metode cawan tuang, koloni yang tumbuh di dekat permukaan agar-agar dapat tumbuh dalam dua koloni dengan morfologi yang berbeda, yaitu koloni kecil didalam agar dan koloni yang lebih besar di permukaan agar. Pertumbuhan koloni dipermukaan agar-agar seringkali sangat kuat dengan warna dan ukuran yang atypical. Penyebab dari terbentuknya koloni atypical seperti pada Gambar 18 belum diketahui tetapi mungkin telah terjadi penghambatan pada reaksi enzimatis oleh kombinasi beberapa komponen dari material sampel dengan pertumbuhan yang terjadi di permukaan. Hal ini bisa diatasi dengan melakukan overlayer pada CCA seperti yang banyak direkomendasikan oleh banyak prosedur standar. Pada medium CCA, apabila muncul koloni atypical, maka semua koloni dengan warna violet di tengah koloni atau warna violet yang terdifusi kedalam agar adalah koloni E.coli (Ossmer R 27 Maret 2009, komunikasi pribadi)
Gambar 18 Pertumbuhan koloni Escherichia coli atypical di media Chromocult Coliform Agar.
Dalam penelitian ini memang tidak dibandingkan antara metode ALT menggunakan media VRBA dan CCA karena tujuan utama adalah membanding-kan antara APM dengan ALT yang dalam hal ini diwakili oleh CCA. Pemilihan CCA sendiri seperti diterangkan diatas adalah karena beberapa keunggulan yang dimiliki CCA seperti ketelitian, kepraktisan dan kecepatan hasil. Penelitian yang membandingkan VRBA dan CCA telah dilakukan oleh Gonzales et.al pada tahun 2003 pada sampel makanan siap saji (ready-to-eat foods). Dari hasil penelitian tersebut disimpulkan bahwa CCA memiliki beberapa keuntungan dibandingkan dengan VRBA yaitu hanya memerlukan satu medium untuk mendeteksi Koliform dan E.coli, mengurangi biaya, mengurangi waktu secara nyata, dan mengurangi kecenderungan terjadinya kontaminasi silang dibanding metode-metode lainnya.