II. TINJAUAN PUSTAKA
2.5 Metode Pengujian Koliform dan E. coli
Empat metode pengujian untuk bakteri koliform dan E.coli yang paling umum dilakukan adalah metode Angka Paling Mungkin (Most Probable Number atau Multiple-tube Fermentation Technique), metode Angka Koliform Total (Total Coliform Count), metode Membrane Filtrasi (Membrane Filtration Technique), atau metode Positif/Negatif (Presence Absence Procedure) melalui fase pendugaan–penegasan (presuptive–confirmed phase) atau test lengkap (APHA, 2005; Merck, 2004). Setiap teknik bisa diaplikasikan dalam keterbatasan spesifikasinya dan dengan memperhatikan tujuan pemeriksaan. Agar dapat memberikan hasil yang valid maka diperlukan penerapan prosedur Quality Control yang ketat (APHA, 2005). Beberapa metode acuan baik nasional maupun internasional menggunakan beberapa metode sekaligus (Tabel 4), sehingga pemakai dapat memilih metode yang cocok dengan jenis sampel dan situasi yang ada di laboratoriumnya.
Tabel 4 memberikan contoh beberapa metode pengujian koliform, E.coli dan koli fekal beserta media yang digunakan, menurut referensi ISO, APHA, FDA, SNI, dan USEPA. USEPA tampaknya lebih cepat mengadopsi teknologi kromogenik fluorogenik dengan mengakui penggunaan EC-MUG, LMX, Readycult Coliform, dan Chromocult Coliform Agar.
Angka Paling Mungkin
Angka Paling Mungkin (APM) atau Most Probable Number (MPN) atau Multiple Tube Technique adalah modifikasi dari Presence Absence Test (P/A). Sampel yang ditambahkan dibagi ke beberapa tabung yang berbeda dengan volume larutan sampel yang sama (Merck, 2005). Seri pengenceran tersebut menghitung perkiraan konsentrasi mikroba dalam sampel sehingga disebut angka paling mungkin (FDA, 2006). APM terutama cocok untuk sampel dengan konsentrasi organisme yang rendah (<100/g), terutama susu dan air, dan untuk
pangan yang bahan-bahan yang terkandung di dalamnya mungkin akan mengacaukan akurasi perhitungan koloni (FDA, 2006).
Tabel 4 Metode dan media yang digunakan dalam dalam beberapa metode referensi untuk pengujian koliform, E.coli dan koli fekal
Metode / Media Metode Standar *) Koliform E.coli Koli Fekal
Metode Angka Paling Mungkin
LST => BGLB dan EC Broth USEPA, FDA, APHA, SNI √ √ √
LST - MUG USEPA, FDA, APHA √ √
Fluorocult LMX, Colilert USEPA √ √ √
Metode Angka Lempeng Total
Chromocult® Coliform Agar USEPA, AOAC
TBX Agar ISO 16649-2:2001 √
VRBA ISO 4832, FDA, APHA √
VRBA - MUG FDA, APHA √ √
Metode Membran Filtrasi
m-Endo, LES-Endo, mFC, M-1 USEPA, APHA √ Chromocult® Coliform Agar, USEPA √ √
Metode Presence Absence
P-A Broth => BGLB USEPA, APHA √
LST => EC Broth USEPA √ √
A-1 Broth (direct media) APHA √
Readycult Coliform USEPA *) Keterangan dari singkatan nama :
International Organization for Standardization (ISO, 2001); American Public Health Association
(APHA, 2005); Food and Drug Association – Bacteriological Analytical Manual (FDA, 2002);
United StateEnvironment Protection Agency (USEPA, 2007); Standar Nasional Indonesia (SNI)
Hanya mikroorganisme hidup yang terhitung dengan metode APM. Karena bakteri di dalam suatu sampel membentuk rantai yang tidak terpisahkan selama persiapan sampel dan pengenceran, maka APM harus diputuskan sebagai perkiraan growth units (GUs) atau colony-forming units (CFUs), bukan sebagai individu bakteri (FDA, 2006). Esensi dari metode APM adalah untuk mengencerkan sampel sampai ke suatu tingkat dimana inokula di dalam tabung akan (kadang kala, tetapi tidak selalu) mengandung organisme hidup (FDA, 2006).
Dari jumlah tabung yang ada pertumbuhan pada setiap seri pengenceran yang dihitung akan dibandingkan ke tabel tertentu sesuai dengan jenis seri pengenceran yang dipakai misal 3, 5, 8, dan 10 tabung (FDA, 2006). Apabila kemungkinan jumlah organisme dalam sampel sangat rendah maka jumlah sampel
a.Media Lauryl Sulfate Broth (positif = gas dan keruh)
b. Media Fluorocult LMXBroth (positif = warna hijau)
diperbanyak (10 ml atau bahkan 100 ml) kemudian ditambahkan ke medium double strength atau dengan volume yang setara (Harrigan, 1998)
Gambar 4 Pertumbuhan E.coli dalam media Lauryl Sulfate Broth dan Fluorocult® LMX Broth pada metode Angka Paling Mungkin
Media yang umum digunakan untuk APM adalah Lactose Broth (LB) atau Lauryl Sulfate Broth (LSB) untuk uji pendugaan koliform (presumptive coliform). Apabila terjadi gas dan media menjadi keruh di LB/LTB seperti di Gambar 4a, maka dilakukan uji penegasan koliform (confirmed coliform) ke media Brilliant Green Bile 2% Broth (BGLB) dan uji pendugaan E. coli ke media EC Broth. Uji penegasan E. coli dilakukan dengan menginokulasikan tabung EC broth positif ke media Levine EMB Agar. Dari hasil uji penegas yang positif kemudian dilakukan inokulasi ke medium Nutrient Agar (NA) atau Plate Count Agar (PCA) untuk keperluan uji konfirmasi IMVIC (APHA, 2005; FDA, 2006).
Beberapa media baru yang digunakan untuk APM adalah media yang mengandung fluorogenik, kromogenik atau keduanya. Beberapa media yang mengandung fluorogenik misalnya EC-MUG (APHA, 2005), Fluorocult® Lauryl Sulfate Broth, Fluorocult® Brilliant Green Lactose Broth (Merck, 2005). Media yang lain mengandung baik fluorogenik dan kromogenik misalnya Fluorocult® LMX Broth. Hasil uji penduga positif apabila terjadi perubahan warna media
menjadi hijau kebiruan, yang biasanya mulai dari bagian atas tabung seperti tampak di Gambar 4 b (Manafi, 2000; Merck, 2004).
Angka Lempeng Total.
Angka Lempeng Total (ALT) atau Total Plate Count (TPC) merupakan metode perhitungan bakteri dengan menggunakan agar. Beberapa media yang umum digunakan dalam ALT adalah Violet Red Bile Agar (VRBA) dan Fluorocult® VRBA. Metode internasional yang menggunakan VRBA antara lain American Public Health Association (APHA), SMDP, International Dairy Federation (IDF), US Food and Drug Administration Bacteriology Analytical Manual (FDA-BAM), International Standardisation Organisation (ISO), (BAM, APHA). Beberapa media kromogenik yang bisa digunakan untuk ALT misalnya Chromocult® Coliform Agar, Chromocult® TBX Agar (APHA, 2005; FDA, 2002; ISO, Merck, 2004).
Pada Gambar 5 terlihat pertumbuhan koliform di empat macam media yang berbeda, yaitu Chromocult® Coliform Agar / CCA (A), Violet Red Bile Agar / VRBA (B), ENDO Agar / EA (C), MacConkey Agar / MCA (D). Pada CCA (Gambar 5 A) tampak koloni warna-warni yang membedakan antara koloni koliform warna merah salmon dan E.coli warna purple, sehingga untuk perhitungan total koliform kedua warna tersebut dijumlahkan. Untuk media VRBA (Gambar 5 B) baik koliform dan E.coli semua warnanya sama yaitu koloni merah dengan presipitat disekitar koloni yang berukuran 1-2 mm. Klebsiella yang termasuk golongan koliform dan bakteri Enterococci kadang-kadang tumbuh di VRBA dengan bentuk koloni pink-point. Pada media Endo Agar (Gambar 5 C) koloni koliform dan E.coli juga berwarna sama yaitu merah, hanya untuk E.coli ada kilap logamnya. Media ke empat yaitu MCA koliform dan E.coli yang bersifat positif laktosa akan berwarna merah dikelilingi oleh zone keruh karena presipitasi asam bile sebagai akibat ari penurunan pH (Merck, 2005). Dari keempat media tersebut hanya CCA yang mampu menumbuhkan sekaligus membedakan antara koloni koliform dan E.coli, sehingga bisa digunakan sekaligus sebagai media untuk menumbuhkan, menghitung dan media seletif.
Gambar 5 Pertumbuhan E.coli dalam media Chromocult® Coliform Agar (A), Violet Red Bile Agar (B), ENDO Agar (C), MacConkey Agar (D) pada metode Angka Lempeng Total
Membran Filtrasi
Metode membran filtrasi biasanya digunakan untuk kualitas air minum atau air lain yang memiliki kandungan mikroorganisme sangat rendah. Keuntungan penggunaan membran filtrasi adalah volume sampel yang ditest bisa sangat besar sehingga akurasi data lebih besar dari pada metode lain yang sampelnya sangat terbatas. Media yang direkomendasikan oleh USEPA dan APHA untuk pengujian ini adalah M-Endo atau LES Endo kemudian di konfirmasi ke LTB dan BGLB untuk Standar Methods SM 9222B,C; MI Medium Standar Methods SM 9222, m-Coliblue, Chromocult Coliform Agar, dan Coliscan (USEPA, 2007; APHA, 2005). Hasil pengujian dengan membran filtrasi tampak pada Gambar 6.
A B
C D
Gambar 6 Pertumbuhan koloni pada metode pengujian Membran Filtrasi
Kelemahan metode membran filtrasi adalah apabila sampel banyak mengandung partikulat yang nantinya akan tertahan di membran dan berpotensi mengganggu perhitungan koloni. Selain itu metode ini memerlukan investasi beberapa manifold dan pompa vakum untuk pelaksanaannya. Penggunaan jenis membran yang tepat juga akan mempengaruhi hasil karena interaksi antara bahan kimia dari media dengan membran sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri (Ossmer et.al, 1999).
Presence Absence.
Metode Presence Absence (P/A) untuk koliform adalah modifikasi sederhana dari metode APM. Penyederhanaan dilakukan dengan menggunakan satu porsi besar (100 ml) dalam botol kultur tunggal untuk mendapatkan informasi kualitatif, yaitu ada atau tidaknya koliform. Hal ini dijustifikasi oleh teori yang ada bahwa dalam 100 ml sample air minum tidak boleh ada koliform sama sekali. Metode ini juga memungkinkan untuk dilakukannya. Metode P/A membuka kemungkinan untuk dilakukannya screening lanjutan untuk bakteri-bekteri indikator lain (koliform fekal, Aeromonas, Staphylococcus, Pseudomonas, Streptoccus fekal, dan Clostridium). Kelebihan lain adalah kemampuan dalam menganalisa jumlah sample yang lebih besar per satuan waktu pengujian (APHA, 2005).
Inokulasi sampel Koliform negatif (being atau keruh Koliform positif (warna hijau kebiruan)
E.coli positif (warna hijau , Fluoresensi positif, indol positif)
Gambar 7. Metode Presence Absence menggunakan Readycult Coliform 100
Metode P/A umumnya digunakan untuk sampel dengan kualitas mikrobiologis yang sangat bagus dimana keberadaan mikroorganisme mustahil ada atau seharusnya tidak boleh ada, misalnya tidak boleh adanya (negatif) koliform dan E.coli di sampel air minum. Kelemahan dari metode ini adalah apabila hasilnya positif maka tidak ada informasi (kuantitatif) tentang tingkat kontaminasi yang terjadi. Sensitifitas dari metode ini sangat tergantung pada jumlah sampel yang dianalisa. Untuk air minum umumnya menggunakan sampel 100 ml, sedangkan untuk air minum yang dikemas maka sampel yang digunakan adalah 250 ml (Codex, 2003; WHO, 2002).
Studi komparasi dengan metode membran filtrasi mengindikasikan bahwa P/A bisa memaksimalkan deteksi koliform di sample yang mengandung macam-macam organisme yang dapat menutupi (overgrow) koloni koliform dan menyulitkan deteksi. Apabila hasilnya positif maka dianjurkan untuk diuji ulang dengan metode kuantitatif untuk menghitung jumlah koliformnya yang akan memberikan indikasi tingkat kontaminasi air (APHA, 2005). Gambar 7 memberikan contoh metode P/A menggunakan media Readycult Coliform dengan pembacaan hasil yang sama dengan media LMX yaitu warna hijau kebiruan untuk koliform positif, dan E.coli positif warna hijau fluoresensi dan indol (Merck, 2005; Manafi and Rossman, 1998).