IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2 Pengukuran Angka Paling Mungkin dengan Metode Konvensional Metode APM yang digunakan dalam penelitian ini ada dua macam yaitu Metode APM yang digunakan dalam penelitian ini ada dua macam yaitu
metode APM konvensional dan metode APM cepat dengan media fluorogenik-kromogenik. Metode APM bisa menggunakan seri 3 tabung, seri 5 tabung, seri 8 tabung atau seri 10 tabung (FDA, 2006). USEPA (2001) dan APHA (2005) menggunakan total volume sample 100 ml untuk air minum, bisa dalam bentuk 10 ml x 10 tabung, 20 ml x 5 tabung atau 100 ml x 1 tabung. Untuk air yang bukan air minum maka digunakan APM seri 5 tabung – 3 seri pengenceran dengan jumlah sampel 10 ml, 1 ml, dan 0.1 ml. Dalam penelitian ini digunakan seri 5 tabung karena walaupun sampelnya berkualitas air minum tetapi ada dicemari dengan bakteri dalam jumlah yang banyak.
Volume media broth yang digunakan adalah 10 ml (double strength), 5 ml (single strength) dan 5 ml (single strength). Penggunaaan double strength pada media 10 ml karena tabung tersebut akan diinokulasi dengan sampel sejumlah 10 ml juga ( APHA, 2005, Merck 2005). Perbandingan antara volume sampel dan
volume media akan menentukan konsentrasi media cair yang harus dibuat sehingga konsentrasi akhir diharapkan sesuai dengan kebutuhan bakteri (single strength).
Metode APM konvensional dimulai dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LST) sebagai uji penduga (presumtive) Koliform. Media LST ini mengandung laktosa yang akan difermentasi oleh bakteri Koliform sebagai sumber karbon. Bakteri Koliform dikenal sebagai bakteri yang dapat memfermentasi laktosa, menghasilkan gas dan asam (Merck, 2004; Merck, 2005; Harrigan, 1998). Gas yang dihasilkan dari fermentasi tersebut ditampung dalam tabung durham dan terlihat sebagai gelembung yang dapat mengangkat tabung ke atas apabila jumlahnya cukup banyak seperti pada Gambar 9. Adanya gas dalam tabung durham dan kekeruhan media menunjukkan bahwa tabung tersebut diduga positif Koliform (Merck, 2005; Merck, 2004; Harrigan, 1998).
Gambar 9 Pertumbuhan bakteri E.coli dalam media Lauryl Sulfate Tryptose Broth yang ditunjukkan dari kekeruhan dan gas pada tabung durham
Dari tabung LST positif tersebut diambil 1 ml dan dikonfirmasikan dengan menginokulasikan ke media kedua untuk uji penguat. Dalam tahap kedua ini biasanya digunakan dua macam media yaitu media Brilliant Green Lactose Bile
2% Broth (BGLB) untuk uji Koliform dan media EC Broth untuk uji E.coli. Hasil positif dari kedua media tersebut juga ditandai dengan terbentuknya gas di tabung durham yang merupakan hasil fermentasi laktosa dan kekeruhan media (Harrigan, 1998; Merck, 2004; Merck 2005; SNI, 2006). Dalam penelitian ini karena hanya menguji bakteri E.coli saja maka hanya digunakan media EC Broth sebagai media kedua. Apabila hasil tabung EC Broth positif maka diambil satu ose dan digoreskan ke Levine EMB Agar (LEMBA) untuk uji penegasan.
Koloni E.coli di LEMBA memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik, seperti tampak pada Gambar 10 (SNI, 2006). Dalam Manual Microbiology Merck disebutkan bahwa koloni E.coli di LEMBA berdiameter 2-3 mm, kilap logam yang kehijauan dalam cahaya yang dipantulkan dan gelap atau bahkan hitam dibagian tengah dalam cahaya yang diteruskan (Merck, 2005). Enterobacter dalam media LEMBA ini sangat mirip dengan E.coli hanya ukuran koloninya yang lebih besar (4-6 mm), abu-abu kecoklatan dibagian tengah, tanpa kilap logam (Merck, 2005).
Karena E.coli tidak selalu memunculkan kilap logam di LEMBA maka apabila kilap logam itu tidak muncul akan susah untuk membedakannya dengan Enterobacter (SNI, 2006). Adanya kemungkinan kesalahan ini menyebabkan diperlukannya uji konfirmasi pada koloni terduga dengan uji biokimia (IMViC). Lima koloni terduga digoreskan ke Plate Count Agar miring kemudian diinkubasikan 18-24 jam untuk setiap tabung yang terbukti positif setelah diuji IMViC akan dihitung sebagai tabung positif E.coli (Merck 2005; SNI, 2006). Dalam SNI (2006), selain uji IMViC tersebut dilakukan juga uji pembentukan gas di medium LST dan uji morfologi dengan pengecatan gram.
Uji IMViC adalah uji konfirmasi untuk E.coli yang terdiri dari uji Indol, uji Methyl Red (MR), uji Voges Preskouer (VP), dan uji Citrat. Uji indol dilakukan dengan menginokulasikan kultur murni ke media Tryptone Water yang mengandung asam amino L-trypthopan. Trypthophan akan dipecah oleh enzim trypthophanase yang dimiliki oleh 99% E.coli menjadi indol yang akan bereaksi membentuk cincin merah pada bagian atas broth bila ditetesi reagen KOVAC’s.
Gambar 10 Koloni E.coli dengan kilap logam di Media LEMBA (Levine EMB Agar)
Uji MR dan VP dilakukan dengan menginokulasikan kultur murni ke dua tabung kecil yang berisi 5 ml media MR-VP Broth Base. Pada uji MR setelah inkubasi, ditambahkan lima tetes larutan indikator methyl red dan dilihat pembentukan warna merah. Pada uji VP setelah inkubasi ditambahkan 0.6 ml larutan alpha naphtol dan 0.2 ml reagen larutan KOH, warna merah yang terbentuk menunjukkan hasil positif. Uji citrat untuk E.coli menunjukkan hasil negatif yang ditunjukkan oleh warna media agar tetap hijau (Merck, 2005; SNI, 2006). Hasil reaksi IMViC pada bakteri E.coli tampak pada Gambar 11.
Pada penelitian ini, jumlah sel akhir per tabung APM untuk konsentrasi rendah adalah 40 sel (pada inokulum 10 ml), 4 sel (pada inokulum 1 ml), dan 0.4 sel (pada inokulum 0.1 ml). Jumlah sel akhir per tabung APM untuk konsentrasi sedang adalah 400 sel (pada inokulum 10 ml), 40 sel (pada inokulum 1 ml), dan 4 sel (pada inokulum 0.1 ml). Jumlah sel akhir per tabung APM untuk konsentrasi tinggi adalah 800 sel (pada inokulum 10 ml), 80 sel (pada inokulum 1 ml), dan 8 sel (pada inokulum 0.1 ml). Dari hasil tersebut terlihat bahwa setelah inkubasi semua tabung akan selalu positif kecuali pada inokulum 0.1 ml pada konsentrasi pengenceran rendah.
Gambar 11 Hasil uji IMViC untuk bakteri E. coli
Dalam Tabel 5 (lebih lengkapnya bisa dilihat di Lampiran 7) terlihat bahwa pada konsentrasi bakteri rendah dan sedang masih ada tabung yang negatif tetapi untuk konsentrasi bakteri tinggi semua tabung adalah positif. Hasil AMP sesuai namanya yaitu Angka Paling Mungkin atau Most Probable Number adalah estimasi dari kisaran yang luas suatu kemungkinan konsentrasi menggunakan seri pengenceran yang diinkubasi pada beberapa pengenceran. Tabel APM yang paling mendekati jumlah sebenarnya dengan tingkat kepercayaan 95% diperbaiki oleh De Man pada tahun 1983 (FDA, 2006).
Apabila dilihat dari konsentrasi bakteri rendah adalah 4 sel/ml tetapi setelah dinokulasikan per tabung maka yang berkemungkinan negatif adalah tabung dengan konsentrasi bakteri rendah pada inokulum 0.1 ml. Dalam tabung ini perkiraan jumlah sel adalah 0.4 sel/tabung atau dari setiap 10 tabung yang di inokulasi terdapat 4 tabung positif (minimal berisi satu sel) apabila sel terdistribusi sempurna. Adanya tabung negatif pada pengenceran 0.1 terlihat pada Lampiran 7, baik untuk tabung LST mapun LMX.
Indol (+) MR (+) VP (-) Citrat (-)
Tabel 5 Perbandingan jumlah mikroba ter-recover pada metode Angka Paling Mungkin (Lauryl Sulphate Tryptose & LMX)
Sampel
Kontrol positif (cfu/100 ml)
Sampel ber E. coli (cfu/100 ml) Jenis
Media Ulangan Air
Proses Rendah* Sedang* Tinggi* Rendah* Sedang* Tinggi* 1 <1.8 240 >1600 >1600 240 >1600 >1600 2 <1.8 245 >1600 >1600 390 920 >1600 3 <1.8 395 >1600 >1600 150 >1600 >1600 Lauryl Sulphate Tryptose Broth Rerata <1.8 293 >1600 >1600 260 >1600 >1600 1 <1.8 240 >1600 >1600 390 >1600 >1600 2 <1.8 260 >1600 >1600 390 1600 >1600 3 <1.8 295 >1600 >1600 295 1600 >1600 Fluorocult LMX Broth Rerata <1.8 265 >1600 >1600 358 >1600 >1600 Catatan :
* Rendah : konsentrasi awal bakteri E.coli dalam sampel 4 cfu/ml ** Sedang : konsentrasi awal bakteri E.coli dalam sampel 40 cfu/ml *** Tinggi : konsentrasi awal bakteri E.coli dalam sampel 80 cfu/ml
Dalam Tabel 5 dan Lampiran 7 terlihat juga bahwa hasil antara LST dan LMX baik di cemaran maupun sampel ber E. coli adalah sebanding kecuali di beberapa perlakuan, terutama di konsentrasi bakteri rendah dimana LMX menunjukkan hasil yang lebih tinggi dari pada LST. Pada ulangan 1 (18 Mei 2008) untuk perlakuan sampel ber E. coli, keseluruhan hasil adalah sama tetapi pada perlakuan sampel ber E. coli hasil yang lebih tinggi didapat pada pengujian dengan media LMX (konsentrasi bakteri rendah sampel 2 dan konsentrasi bakteri sedang sampel 1). Pada pengujian kedua (3 Juni 2008) perlakuan cemaran konsentrasi rendah sampel satu, hasil LMX juga menunjukkan angka lebih tinggi dari LST, sedangkan pada perlakuan sampel ber E. coli hasil yang lebih tinggi terjadi pada LMX dengan cemaran sedang baik untuk sampel satu dan dua.
Hal yang sama juga terjadi pada pengujian ketiga (26 Juni 2008). Pada perlakuan cemaran sedang ada sampel satu, hasil yang lebih tinggi terjadi pada media LMX. Pada perlakuan sampel ber E. coli hasil LMX yang lebih tinggi terjadi pada perlakuan konsentrasi cemaran rendah baik pada sampel satu maupun sampel dua. Di lain pihak, hasil LST yang lebih tinggi dari LMX hanya terjadi pada pengujian ketiga (tanggal 26 Juni 2008) dengan perlakuan dengan konsentrasi bakteri sedang sampel satu, dengan perbedaan hanya satu tabung positif di volume inokulum 0.1 ml. Pada pengamatan 24 jam, secara umum
tabung LMX menunjukkan tanda-tanda positif lebih cepat dari pada LST sehingga memungkinkan didapat hasil yang lebih cepat.
Pada Lampiran 7 terlihat bahwa hasil pembacaan untuk sampel air semua adalah negatif (kombinasi tabung 000) sehingga didapat hasil <1.8 cfu/100 ml yang merupakan nilai terendah untuk APM yang berarti masih mungkin ada kandungan bakteri Koliform tetapi dibawah 1.8 cfu/100 ml. Hal ini agak menyulitkan karena standar air bersih untuk Koliform maupun E.coli adalah 0/100 ml sampel (EC, 1998; Depkes, 2007; WHO, 2004). Hal inilah yang menyebabkan metode standar untuk pengujian air minum yang saat ini banyak digunakan adalah bukan metode APM tetapi metode Membran Filtrasi dan metode Presence Absence (APHA, 2005; EC, 1998; FDA, 2006; Merck, 2004). Dengan menggunakan metode P/A atau membran filtarsi bisa diperoleh hasil yang menyatakan nilai negatif atau nol per 100 ml sampel sesuai standar yang tercantum, karena jumlah sampel yang diuji bisa sampai 100 ml dan limit bawah pembacaan hasil adalah nol cfu atau tidak ada pertumbuhan.
Pada perlakuan dengan konsentrasi bakteri tinggi semuanya menunjukkan hasil yang sama yaitu >1600 atau semua tabung positif (kombinasi 555). Hal ini menyulitkan karena tidak didapatkan suatu angka yang pasti yang bisa dibandingkan dengan hasil dari metode lainnya. Untuk konsentrasi tinggi sebenarnya bisa didapat hasil yang angka tertentu (bukan >1600) apabila dilakukan penambahan seri pengenceran sampai diperoleh kombinasi angka tabung positif yang ideal (FDA, 2006). Kesulitan dari penambahan seri pengenceran sampai lebih dari tiga tingkat adalah implikasinya terhadap penambahan waktu, peralatan, tenaga, dan media yang sangat berbeda nyata. Apabila dibandingkan dengan jumlah inokulum awal yaitu konsentrasi bakteri rendah (4 cfu/ml), konsentrasi bakteri sedang ( 40 cfu/ml) dan konsentrasi bakteri tinggi (80 cfu/ml) maka hasil yang diperoleh di kedua media LST dan LMX cukup mencerminkan kondisi tersebut.
Uji anova (Lampiran 8) yang dilakukan untuk APM LST menunjukkan bahwa F hitung lebih kecil dari F tabel dan nilai P lebih besar dari 5% yang berarti tidak ada perbedaan hasil yang nyata antar sampel yang diambil pada hari yang berbeda dan juga antar perlakuan cemaran dan sampel + cemaran. Hasil untuk
APM LMX juga menunjukkan kondisi yang sama dengan APM LST (Lampiran 9). Dalam hal ini yang bisa dianalisa hanya yang cemaran rendah saja karena cemaran sedang dan tinggi nilainya sebagian besar bukan berbentuk angka (>1600).
Dalam SNI (2006) disebutkan bahwa hasil yang baik dalam APM adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah, contoh yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan di pengenceran yang lebih tinggi, contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil yang negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri). Dalam penelitian ini hanya dilakukan pengujian untuk jumlah sampel yang diinokulasikan adalah 10 ml, 1 ml, dan 0.1 ml saja untuk semua perlakuan karena adanya keterbatasan waktu, tenaga, ketersediaan peralatan dan biaya dalam pengerjaan.
Gambar 12 Pertumbuhan bakteri E. coli (warna hijau) dalam media Fluorocult® LMX Broth
Pada perhitungan anova dari pertumbuhan dengan metode APM konvensional maupun cepat tersebut diatas (Lampiran 10), diperoleh hasil F hitung lebih kecil dari F tabel dan P value lebih besar dari 5% baik pada variasi sampel, metoda maupun interaksinya sehingga dapat disimpulkan bahwa hasil dari metode APM LST adalah sebanding dengan APM LMX. Walaupun hasil
yang didapat dari kedua metode tersebut sebanding akan tetapi ada beberapa hal lain yang patut menjadi pertimbangan yaitu kemudahan pengerjaan, kemudahan dalam melakukan pengamatan hasil, kecepatan memperoleh hasil akhir test dan kepekaan yang lebih tinggi. Kepekaan dan kemudahan pengamatan terutama terlihat pada konsentrasi bakteri rendah dimana seringkali gelembung gas pada tabung durham agak sulit diamati (pada inkubasi 24 jam). Pada penggunaan media cepat Fluorocult® LMX untuk metode APM cepat, pertumbuhan E. coli ditandai dengan perubahan warna hijau yang dimulai dari dari bagian atas tabung terlihat jauh lebih nyata dan mudah diamati (Gambar 12).
Keuntungan lain dari media LMX menurut Manafi (1995), adalah hasil yang dapat diketahui secara langsung dan sekaligus dalam waktu yang sama dan tabung yang sama apakah ada bakteri Koliform maupun E.coli, tanpa perlu uji lanjutan yaitu penegasan Koliform (BGLB), pendugaan E.coli (EC Broth) dan penegasan E.coli (LEMBA). Adanya Koliform dalam LMX ditandai dengan terbentuknya warna hijau kebiruan yang dimulai dari bagian atas media yang tidak hilang apabila dikocok. Semakin lama waktu inkubasi, warna hijau kebiruan akan semakin turun ke dasar tabung dan warna hijau kebiruan akan semakin pekat (Gambar 12).
Gambar 13 Pembacaan fluoresensi pada media Fluorocult® LMX dengan lampu UV.
Konfirmasi untuk memastikan koloni tersebut Koliform biasa atau E.coli bisa dilakukan dengan parameter tambahan yaitu fluoresensi dengan lampu UV (Gambar 13) dan pembentukan cincin merah akibat reaksi indol yang dihasilkan E.coli dengan reagen Kovac’s (Gambar 14). Fluoresensi dibawah lampu UV tampak sebagai warna biru pendar yang terang, yang lebih tampak nyata dalam kondisi gelap. Selain itu, dengan penambahan reagen Kovac’s akan terbentuk cincin merah dibagian atas broth
Dari kedua media untuk APM yang dianalisa maka media LST memberikan hasil recovery rate untuk sampel ber E.coli yang lebih rendah dari pada media LMX, apabila dibandingkan dengan kontrol positif dengan media yang sama (Tabel 6).
Tabel 6 Recovery rate E.coli pada tiga macam media pada konsentrasi awal bakteri 400 cfu/100 ml (rendah)
Hasil pengukuran (cfu/100ml) Recovery Rate sampel ber E.coli Jenis Media
Kontrol positif Sampel ber E. coli
dibandingkan kontrol positif Lauryl Sulfate Tryptose Broth 293 260 89%
Fluorocult LMX Broth 358 122%
Chromocult Coliform Agar 204 70%
Pada ISO 11133-2 maka recovery rate disebut sebagai productivity yaitu jumlah cfu yang tumbuh di media uji dibagi dengan jumlah cfu yang tumbuh di media general, misal Tryticase Soy Agar atau media general lainnya. Untuk media selektif nilainya harus >50% (ISO, 2002). Pada Tabel 6 nilai recovery rate untuk penelitian ini dihitung berdasarkan pertumbuhan di medium LST dengan perlakuan kontrol positif. Dari hasil perhitungan diperoleh nilai recovery rate pada perlakuan sampel ber E.coli rendah pada medium LST adalah 89%, LMX 122% dan CCA 70%.
Sebenarnya media LMX adalah generasi ketiga dari pengembangan media Lauryl Sulfate Broth, dengan perbaikan komposisi media seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan diketemukannya teknologi fluorogenik dan kemudian kromogenik. Media Lauryl Sulfate Tryptose Broth sudah berkembang
menjadi Fluorocult® Lauryl Sulfate Broth, kemudian menjadi Fluorocult® LMX Broth dan terakhir menjadi Readycult® Coliform (Tabel 7).
Gambar 14 Pembacaan Indol (cincin merah) pada media LMX dengan penambahan reagen KOVAC’s
Media Lauryl Sulfate Tryptose Broth yang diperkenalkan oleh Mallmann dan Darby pada tahun 1941 sebagai media kultur selektif untuk pendugaan bakteri Koliform dan untuk untuk pengkayaan selektif untuk organisme Koliform dalam analisa air. Media Lauryl Sulfate Tryptose Broth juga merupakan media yang sangat umum digunakan dan sampai saat ini masih menjadi acuan dalam berbagai standar Internasional seperti AOAC, BAM, COMPF, EPA, ISO, SMD, SMWW (Merck, 2005). SNI yang mengadaptasi prosedur FDA / BAM dengan sendirinya juga menggunakan media LST ini (SNI, 2006).
Pada tahun 1991 Schindler memberikan rekomendasi penggunaan media Fluorocult® Lauryl Sulfate Tryptose Broth dalam Quality Control air mandi (Merck, 2005). Selanjutnya media ini digunakan sebagai standar pengujian oleh German-DIN-Norm 10183 untuk pemeriksaan susu, regulasi § 35 LMBG (01.00/54) untuk pemeriksaan produk pangan, ISO/DIS 11886 - 2.2 (1994) untuk
susu dan produk susu, dan selanjutnya the German Badegewässerverordnung (regulations for bathing water) 76/1604 EWG di tahun 1995 (Merck, 2005).
Perbaikan yang dilakukan dari media LST ke Fluorocult® LST adalah dengan penambahan L-tryptophan yang memungkinkan dilakukannya pegujian indol sekaligus dan MUG yang memungkinkan dilakukannya pengujian fluoresensi sekaligus seperti pada Gambar 14. Dengan penambahan kedua zat tersebut maka LST yang semula hanya dapat digunakan untuk pendugaan Koliform sekarang bisa juga dilakukan untuk konfirmasi keberadaan E.coli dari sifat fermentasi laktosa berupa pembentukan gas, enzim triptophanase berupa pembentukan indol, dan enzim glucuronidase berupa pembentukan fluoresensi (Manafi, 2000; Merck 2005).
Perkembangan selanjutnya adalah modifikasi dari media Fluorocult® Lauryl Sulfate Tryptose Broth menjadi Fluorocult® LMX Broth dengan penambahan substrat kromogenik, sorbitol dan IPTG kedalam media. LMX Broth pertama kali diperkenalkan oleh Manafi dan Kneifel (1989) dan kemudian dimodifikasi oleh Manafi dan Ossmer (1993) dengan memperbaiki penggunaan substrate yang dapat meningkatkan sensitivitas media sekaligus mengurangi keseluruhan waktu inkubasi menjadi hanya 24 jam.
Fluorocult® LMX Broth modified mengandung bufer fosfat untuk menggaransi tingkat pertumbuhan yang tinggi bagi bakteri Koliform total. Lauryl Sulfate yang ada sangat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif. Dengan substrat kromogenik X-Gal (5-bromo-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside), yang akan dipecah oleh Koliform dan substrat fluorogenik 4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide (X-Gluc) yang sangat spesifik untuk E.coli.
Selain kedua substrat diatas, LMX juga mengandung tryptophan yang akan dipecah oleh E.coli menjadi indol dengan adanya enzim tryptophanase (dimiliki oleh 99% E.coli). Sintesa enzim tersebut diamplifikasi oleh 1-isopropyl-ß-D-1-thio-galactopyranoside dengan meningkatkan aktifitas ß-D-galactosidase (Manafi, 1995; Merck, 2005). Dengan ketiga parameter tersebut maka dimungkinkan untuk melakukan deteksi total Koliform dan E.coli secara simultan dengan satu macam medium dalam satu tahapan kerja saja (Manafi, 2000; Merck, 2005).
Tabel 7 Perkembangan dari Lauryl Sulfate Tryptose Broth ke Fluorocult® LMX Broth dan Readycult® Coliform
Komposisi Media (g / l) Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LST) Fluorocult® Lauryl Sulfate Broth LMX Broth/ Readycult® Coliform Tryptose 20.0 20.0 5.0 Lactose 5.0 5.0 0 Sodium chloride 5.0 5.0 5.0 Dipotassium hydrogenphosphate 2.75 2.75 2.7 Potassium dihydrogen phosphate 2.75 2.75 2.0 Lauryl Sulfate Sodium Salt 0.1 0.1 0.1
L-tryptophan 1.0 1.0 Sorbitol 1.0 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside (X-GAL) 0.08 4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide (MUG) 0.1 0.05 1-isopropyl-ß-D-1-thio-galactopyranoside (IPTG) 0.1 Sumber : Manual Microbiology Merck (2005)
Dalam penelitian Manafi (1995), dilakukan pengujian 771 strain bakteri gram negatif dengan LMX broth dimana 98% E.coli yang di isolasi dari air minum adalah positif ß-D-glucuronidase (X-Gluc). 98% dari strain E. coli memperlihatkan aktifitas ß-D-galactosidase (X-Gal) dan 99% memberikan reaksi indol positif. Augoustinos et al. (1993) dalam Manafi dan Rosmann (1998b) dan Manafi (1991) mengisolasi 95,7% E.coli yang positif GUD (Glucuronidase) dari satu medium MUG dan menemukan strain Shigella (44-58%) dan Salmonella (20-29%) yang dapat memproduksi enzim GUD. Alonso et.al (1996) dalam Manafi dan (1998b) menemukan beberapa strain Klebsiella oxytoca, Serratia fonticola and Yersinia intermedia mampu memproduksi GUD. Selain itu juga beberapa strain Flavobacteria, Staphylococci, Streptococci dan Clostridia juga dapat memproduksi GUD. Akan tetapi pertumbuhan dari sebagian besar mikroorganisme tersebut dapat dihambat dengan agensia selektif di dalam media atau dengan pengaturan kondisi inkubasi (Manafi, 1995).
Rice et. al (1990) meneliti kemungkinan false positive dari penggunaan GUD untuk deteksi E. coli oleh spesies Escherichia yang lain. Dari isolat klinis (CDC) digunakan sebanyak 42 isolat yang terdiri dari E. hermanni, E. fergusonnii,
isolat yang terdiri dari E. hermanni, E. fergusonnii, E. vulneris, dan E. adecarboxylata. Kesemuannya ditumbuhkan di media EC-MUG, Colilert dan juga di cek kemungkinan sebagai Koliform fekal dengan menumbuhkan di suhu 44.5oC. Dari hasil yang diperoleh ternyata hanya E. coli yang bersifat GUD positif dan fekal Koliform positif, sedangkan spesies Escherichia yang lain bersifat GUD negatif dan fekal Koliform negatif sehingga metode ini bisa digunakan untuk mendeteksi E. coli tanpa adanya false positive.
Karena tryptophan sudah ada dalam komposisi media LMX broth, maka reaksi indol dapat langsung dilakukan pada media tersebut hanya dengan menambahkan pereaksi KOVAC’s secara langsung di tabung yang sama (Ossmer, 1993; Merck, 2005). Pereaksi KOVAC’s ditambahkan ke tabung sampai membentuk lapisan reagen setebal 5 mm di permukaan broth. Apabila lapisan pereaksi berubah menjadi warna merah cerry (cherry red) setelah 1-2 menit (Gambar 14) maka keberadaan E. coli telah terkonfirmasikan (Merck, 2005). Apabila hasil test fluoresensi masih negatif setelah inkubasi 24 jam, maka penambahan pereaksi KOVAC’s untuk pengujian indol tidak boleh dilakukan terlebih dahulu. Inkubasi diteruskan sampai 48 jam kemudian baru dilakukan kembali uji fluoresensi dan indol.
Pereaksi KOVAC’s adalah larutan alkoholis yang akan merusak kondisi pertumbuhan di broth tersebut. Pengujian indol secara simultan dalam satu tabung yang sama akan sangat memotong hari kerja apabila dibandingkan dengan prosedur konvensional, dimana dari LST positif ke medium EC broth, kemudian ke LEMBA yang selanjutnya koloni terduga di perbanyak ke agar miring untuk uji IMViC. Dalam uji IMViC yang salah satunya adalah uji Indol menggunakan medium Tryptone Water yang kemudian diinkubasi selama 24 jam sebelum ditambahkan pereaksi KOVAC’s.
Penggunaan ketiga parameter diatas, yaitu fluorogenik, kromogenik dan indol diketahui dapat meningkatkan sensitifitas, selektifitas media sehingga meminimalkan kemungkinan terjadinya kesalahan (baik kesalahan positif maupun negatif) dalam pengujian Koliform dan E.coli.