IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.4 Metode Presence Absence
Untuk sampel air yang sangat bersih seperti air minum atau air proses, yang jumlah bakterinya sangat kecil umumnya dianjurkan untuk menggunakan metode membran filtrasi atau Presence/ Absence dengan jumlah sampel yang cukup besar, misalnya 100 ml. Dengan jumlah sampel yang besar diharap tingkat ketelitian dan sensitifitas uji juga meningkat. Sebenarnya standar mikrobiologis air proses dan
air minum menurut Kepmenkes, WHO, FDA, dan USEPA adalah negatif atau nol cfu per 100 ml sampel. Karena itu, untuk pengujian air minum umumnya metode yang disahkan adalah metode membran filtrasi atau P/A yang memiliki tingkat ketelitian lebih tinggi dari pada metode APM dan ALT (Depkes, 2002; WHO, 2004; USEPA, 2007; FDA, 2002).
Dalam penelitian ini, metode APM yang sekarang digunakan dalam SNI dan metode ALT yang banyak digunakan di industri dibandingkan dengan metode P/A yang merupakan metode standar untuk pengujian air minum yang digunakan oleh USEPA. Metode membran filtrasi tidak dipilih karena jarang digunakan di Indonesia dan memerlukan pengerjaan yang lebih rumit daripada metode P/A.
Metode Presence Absence (P/A) pada penelitian ini menggunakan media siap pakai Readycult® Coliform 100 (RC 100) seperti pada Gambar 20. Media Readycult® Coliform 100 ini merupakan pengembangan dari media LMX Broth (Tabel 7) menjadi bentuk siap pakai untuk metode Presence Absence dengan sampel air sebanyak 100 ml (Manafi and Rosmann, 1998a; Merck, 2005). RC 100 dibuat dari media Fluorocult® LMX Broth sebanyak 1.7 g, dikemas dalam sachet khusus dan disteril dengan cara radiasi (Merck, 2005; Manafi, 2000). Karena media sudah dalam keadaan ditimbang dan steril maka media bisa langsung dituang kedalam botol steril ukuran 250 ml yang sudah diisi dengan 100 ml sampel (Gambar 19). Karena basis medianya sama, maka prinsip kerja media maupun cara pengamatan media RC adalah sama dengan LMX Broth.
Metode P/A menggunakan media Readycult® Coliform 100 ini telah disahkan oleh USEPA untuk digunakan dalam pengujian bakteri Koliform maupun E. coli dalam air minum (USEPA, 2007). Keunggulan metode ini dibandingkan dengan APM maupun ALT adalah pengerjaannya yang jauh lebih sederhana, cepat dan jumlah sampel yang dites jauh lebih besar daripada metode APM maupun ALT sehingga apabila ada satu sel saja dalam 100 ml sample akan terdeteksi sebagai positif.
Tabel 12 Hasil pengujian Escherichia coli dengan metode Presence Absence pada media Readycult® Coliform 100
Sampel Kontrol positif Sampel ber E. coli Jenis
Media Ulangan Air
Proses Rendah Sedang Tinggi Rendah Sedang Tinggi 1 negatif positif TD TD positif TD TD 2 negatif positif TD TD positif TD TD RC
100
3 negatif positif TD TD positif TD TD
Catatan :
- Rendah (konsentrasi cemaran 4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml) dan Tinggi (80 cfu/ml) - Keterangan : TD = Tidak dilakukan
Dari hasil penelitian terlihat bahwa semua sampel air proses tanpa cemaran adalah negatif dan semua sampel dengan cemaran maupun cemaran saja pada konsentrasi rendah adalah positif (Tabel 12). Pada penelitian ini metode P/A hanya dilakukan untuk konsentrasi rendah saja untuk melihat sensitifitas pada jumlah sel terendah, sedangkan untuk konsentrasi sedang dan tinggi tidak dilakukan karena sudah pasti akan positif hasilnya. Hasil ini sejalan dengan kedua metode sebelumnya yaitu APM (dengan LST maupun LMX) dan ALT (dengan CCA), dimana pada sampel air proses saja semua hasilnya negatif sedang pada konsentrasi rendah semua positif dengan nilai cfu yang berbeda-beda. Apabila memang hasil akhir yang diinginkan hanya negatif per 100 ml sampel maka diantara ketiga metode tersebut, metode P/A lah yang paling sesuai karena paling mudah dilakukan, cepat dan dengan hasil yang sebanding dengan metode lain.
Manafi and Rosmann (1998a) dalam penelitiannya mendapatkan hasil bahwa Readycult® mendeteksi Koliform dan E.coli secara signifikan pada lebih
banyak sampel dalam 24 jam dibandingkan dengan standard Methods. Readycult® menunjukkan hasil false positive untuk Aeromonas spp., yang merupakan waterborne bacteria yang umum. Deteksi Koliform dan E.coli dikurangi menjadi total satu hari dibandingkan dengan metode EPA konvensional yang memerlukan 4 hari dan metode DIN yang memerlukan 3 hari. Selain itu juga dibuktikan bahwa sensitifitas Readycult® sama dengan Standard Methods dan bahkan Readycult® dapat menghitung E.coli dan Koliform secara simultan dalam analisis yang sama. Efisiensi dan kecepatan reaksi yang dapat dideteksi membuat media ini sangat bermanfaat dalam test mikrobiologi air rutin (Manafi and Rosmann, 1998a).
Pada Gambar 20 tampak berbagai hasil inkubasi media Readycult®. Paling kiri yaitu yang berwarna bening kekuningan adalah pada saat awal inokulasi atau apabila sampelnya steril. Botol yang tengah tampak keruh tetapi tidak berwarna biru kehijauan, yang berarti ada pertumbuhan bakteri tetapi bukan termasuk Koliform. Hasil ini didapat dari inkubasi sampel air proses tanpa cemaran pada tanggal 3 Juni 2008, yang memang di media CCA juga tumbuh koloni tak berwarna cukup banyak. Botol paling kanan keruh dan berwarna biru kehijauan, yang menunjukkan ada pertumbuhan bakteri Koliform (dari perlakuan dengan cemaran E.coli) . Uji konfirmasi lanjutan untuk membedakan E.coli dari bakteri kelompok Koliform lainnya dilakukan dengan melihat fluoresensi dengan lampu UV 366 nm dan pembentukan cincin merah dari reaksi indol dengan pereaksi KOVAC’s (Gambar 21).
Keunggulan dan kelemahan media Readycult® dibandingkan dengan media konvensional untuk uji Koliform dan E.coli pada dasarnya sama dengan media Fluorocult® LMX Broth yang telah diterangkan di bagian metode APM LMX. Keunggulan lainnya dari Readycult® adalah kemudahan dalam pengerjaan dan ketelitian yang lebih untuk uji air minum dengan jumlah bakteri Koliform sangat kecil bahkan negatif, karena sampel yang diuji adalah 100 ml dalam satu botol.
Gambar 20 Pertumbuhan bakteri Koliform di media Readycult® Coliform 100
Gambar 21 Fluoresensi (1) dan Reaksi Indol (2) dalam media Readycult® Coliform 100.
Kemudahan pengerjaan seperti sudah disinggung di bagian inokulasi, terutama karena media sudah dalam dalam bentuk snap siap yang steril (Gambar 19), dengan dua pilihan yaitu untuk keperluan sampel 50 ml atau 100 ml. Dengan bentuk snap siap pakai tersebut proses preparasi media yang konvensionl seperti penimbangan, pelarutan, sampai dengan sterilisasi dan penyimpanan menjadi
1. awal inokulasi 2. ada pertumbuhan bukan Koliform 3. positif Koliform 1 2
hilang. Kebutuhan tenaga, peralatan, waktu pembuatan media dan ruang simpan untuk media jadi juga menjadi sangat berkurang. Prosedur sederhana ini memungkinkan suatu laboratorium sederhana dengan peralatan dan kompetensi personal minimal, bahkan di lapangan, bisa juga melakukan test rutin monitoring Koliform.
Bentuk snap dengan media steril juga memungkinkan dilakukannya pengujian dengan sampel air sebesar 100 ml karena tidak lagi diperlukan air sebagai pelarut dalam proses pembuatan media. Apabila menggunakan media biasa maka untuk melakukan pengujian dengan sampel sebanyak 100 ml diperlukan media sebanyak 50 ml dengan minimal 3 kali resep (3-fold) (Merck, 2005; APHA, 2005). Hal ini tentu akan sangat mengurangi biaya pengujian dibandingkan dengan metode APM atau P/A biasa.
Karena metode ini sangat sensitif maka yang diuji hanya sampel tanpa inokulasi dan cemaran yang konsentrasi rendah saja. Jumlah sel akhir per botol adalah 400 sel untuk konsentrasi rendah (Tabel 12) karena jumlah inokulum 4 sel/ ml sedangkan jumlah suspensi cemaran yang digunakan adalah 100 ml. Cemaran konsentrasi sedang dan konsentrasi tinggi tidak diuji karena sudah pasti hasilnya akan positif karena menurut Manafi dan Rosmann (1998a) apabila ada satu sel saja dalam 100 ml sampel yang akan memberikan hasil positif.
Selain untuk deteksi secara simultan Koliform dan E.coli, Readycult Coliform dapat juga digunakan untuk pengkayaan dalam cara deteksi E.coli O157:H7 secara cepat dan mudah di sampel air. E.coli O157:H7 yang diduga ada di sampel yang diinokulasikan ke media RC yang berwarna hijau kebiruan tetapi fluoresensi negatif dan indol positif dikonfirmasi dengan Singlepath E.coli O157 (Bubert et.al, poster)